TY  - THES
A1  - Hoffmann, Tanja
T1  - Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur
T1  - Generation and characterization of anti-PrP antibodies with inhibitory effect on prion replication in cell culture
N2  - Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infektiöse Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc übernimmt. Die Konversion des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten mögliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen können und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antikörper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen können und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antikörpern für therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antikörper mittels „Hybridom“-Technik hergestellt. Zwei der Antikörper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-Mäusen, die zuvor mit fibrillärem PrP immunisiert wurden. Bei fünf Antikörpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde für die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antikörper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Aviditäten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar. Das Epitop des Antikörpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), während die Antikörper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globulären C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antikörper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits häufiger für inhibitorisch wirksame Antikörper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antikörper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antikörper 48-11-5 führte zu einer unvollständigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verlängerung des Applikationszeitraums nicht verstärken ließ. Dagegen inhibierten die Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollständig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antikörper mit PrP zurückgeführt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch hätte verringern können, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosität von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antikörper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosität der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antikörper 103-8 reduzierte die Infektiosität der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 die Infektiosität der ScN2a-Zellen vollständig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers wird zusätzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterstützt, der mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antikörpern der Antikörper B2-43-133 ein Kandidat für weiterführende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antikörper für die Inhibition nutzen, konnte nicht geklärt werden. Obwohl der Antikörper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfläche (Retention) verlängerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Moleküle der PrPSc-Konversion entzogen werden können, wurde dies für einen Referenzantikörper, welcher einen ähnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder dafür, dass die Verlängerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antikörper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder dafür, dass verschiedene Antikörper verschiedene Mechanismen nutzen können. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antikörpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht bestätigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erhöhung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antikörper führte.
N2  - The development of prion diseases is characterized by accumulation of an abnormal folded isoform of the cellular prion protein (PrPC). This infectious isoform, called PrPSc, emerges through interaction with PrPC adopting the conformation of PrPSc. Thus, conversion of PrPC to its pathogenic isoform and the resulting PrPSc accumulation are substantial hallmarks of prion diseases that provide possible therapeutical intervention points. Recent studies have shown that antibodies recognizing PrPC and/or PrPSc interfere with the conversion process in vitro and in vivo and inhibit PrPSc accumulation (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). This study was initiated to generate new anti-PrP antibodies that could efficiently inhibit the PrPSc conversion and thereby extend the repertoire of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic and diagnostic use. Altogether, seven antibodies could be established by hybridoma-technique: two mAbs from immunisation of Prnp0/0 mice with fibrillar PrP (B2-31-166 and B2-43-133) and the remainder (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) by using recombinant PrP as immunogen. All antibodies were able to detect recombinant PrP as well as native and denaturated PrPC and PrPSc. The avidities and similar dissociation constants were comparable to commercial reference antibodies. The epitope of mAb B2-31-166 was determined in the unstructured N-terminal domain (residues 96-110), whereas mAbs 7-12-5, 12-29 and 48-115 detected an epitope in the C-terminal globular domain (residues 158-176). The epitopes of mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 are located in the C-terminus (residues 142-157) as well and correspond to the -helix 1 of PrPC (residues 144-152). This region was already determined as a potential epitope for other inhibitory effective antibodies. Three antibodies (7-12-5, 12-29 and B2-31-166) did not inhibit PrPSc accumulation in prion-infected cells (ScN2a cells). MAb 48-11-5 only led to an incomplete reduction of the PrPSc content. This effect could not be strengthened through extending the treatment period. In contrast, mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 were able to completely inhibit the PrPSc accumulation in ScN2a cells. This effect was attributed to a specific interaction between antibodies and PrP as no cytotoxic effect was detectable that could lead to an unspecific reduction of the PrPSc content. Interestingly, analysis of the infectivity of antibody-treated ScN2a cells showed that mAb 110-10 was indeed able to inhibit PrPSc accumulation, although it did not affect the infectivity of ScN2a cells. MAb 103-8 reduced the infectivity level, but new PrPSc accumulation could be detected in ScN2a cells 30 days after the treatment had been finished. Only treatment with mAb B2-43-133 completely eliminated the infectivity of ScN2a cells and no PrPSc could be detected in ScN2a cells even 36 days after treatment. The strong inhibitory effect of this antibody is supported by a very low IC50 value (0,31 nM) which is also comparable with commercial anti-PrP antibodies. In summary, these results indicate that anti-PrP antibody B2-43-133 represents a good candidate for future immunotherapeutic approaches. Furthermore, it was impossible to clearly identify the underlying mechanisms of the antibodies for the inhibition of PrPSc accumulation. Although mAb B2-43-133 prolonged the retention of PrPC on the cell surface, whereby the bound PrPC molecules could hypothetical withdraw the PrPSc conversion, this could not be observed for commercial antibodies with similar inhibitory effect. These data imply that the prolongation of the PrP retention is only one feature of mAb B2-43-133. However, it is possible that different antibodies use different mechanisms to inhibit PrPSc conversion and that the retention is one of them. In addition, the inhibition of PrPSc accumulation is probably not mediated by the formation of an antibody-protein complex since the treatment of ScN2a cells with a stable complex consisting of B2-43-133 and recombinant PrP complex decreased the inhibitory effect compared to free antibody.
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - Prionprotein
KW  - ScN2a Zellen
KW  - Immunisierung
KW  - Scrapie
KW  - Behandlung
KW  - monoclonal antibodies
KW  - prion protein
KW  - scrapie
KW  - treatment
KW  - ScN2a cells
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998
ER  - 
TY  - THES
A1  - Geis, Tanja
T1  - Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen zu klinisch relevanten immunodominanten Antigenen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien (MRSA) für eine Antikörpertherapie
T1  - Molecular and immunological characterization of immunodominant antigens of MRSA
N2  - Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend phänotypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für die Aufklärung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antikörper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifität war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septikämischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antikörper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antikörpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgeführt. Eine spezifische Antikörperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antikörper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die höchste Spezifität bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Primärantikörperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifität des polyklonalen Antikörpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabhängig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antikörper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Domänen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream“- und „downstream“-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle“-Vektor pBT2, der bei erhöhter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot überprüft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen über die mögliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz für S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig für das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von möglichen in vivo-Umwelteinflüssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der Stämme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegenüber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen ermöglicht. In weiteren Experimenten wurden das Hämolyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von Hämolysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede für verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein für eine Antikörpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen.
N2  - Summary: Staphylococcus aureus is one of the most frequent causes of nosocomial infections. The spectrum of diseases ranges from self limiting local infections of the skin to feared life-threatening systemic infections. The increasing rate of multi-resistant S. aureus strains represents a serious problem in the therapy of infections due to S. aureus. In addition to the development of new antibiotics, it is very important to develop alternative forms of therapy in the fight against multi-resistant bacteria, such as S. aureus. As an alternative, immuno-therapeutical methods can be developed, for example the use of monoclonal antibodies against target elements of S. aureus. A prerequisite for the development of therapeutical antibodies is the identification of immuno-dominant antigens which should preferentially be located on the cell surface of the pathogen or being secreted proteins. Recently, two immunodominant antigens named IsaA and IsaB have been identified which seem to be suitable structures for an antibody-based immuno-therapeutical approach. To learn more about the function of the immunodominant antigens and to evaluate the role in diseases caused by S. aureus in this work an isaB-mutant was constructed and phenotypically characterized. Moreover, a human monoclonal antibody against IsaA should be generated. For testing the specificity of monoclonal antibodies, it was necessary to develop an anti-IsaA-specific ELISA. By fusion of the human heteromyeloma cell line HAB-1 with B-lymphocytes from lymphatic material of patients with sepsis anti-IsaA producing hybridoma clones should be generated and later on tested in different models. By application of the human heteromyeloma cell line cross-reactions of species, as they were observed with murine antibodies, can be circumvented. In this work, several fusions of different lymphatic material were accomplished. However, specific anti-IsaA producing antibodies could not be generated. Furthermore, an anti-IsaA-specific ELISA could successfully be established on the basis of polyclonal anti-IsaA-antibodies from immunized rabbits. The ELISA showed the highest specificity at an antigen-coating of 2 µg/ml of IsaA and an optimal primary antibody concentration of 1:25600. To evaluate the expression of IsaA protein within the species S. aureus and to test the specificity of the antibody Western blot experiments were performed using different S. aureus strains, strains from other staphylococcal species and also non-staphylococcal isolates. These experiments reveal that IsaA is specifically expressed by all S. aureus strains tested, independently of the origin of the strains and regardless the type of infection the strains have caused or the type of resistance they do express. The isaB-mutant was created via constructing an inactivating plasmid (pTG1), in which the erythromycin resistance cassette ermB was cloned between an upstream and downstream fragment of isaB in the temperature-sensitive shuttle-vector pBT2, which cannot replicate in S. aureus at higher temperatures (42°C) facilitating homologous recombination with homologous sequences in the genome. The successful construction of the isaB-mutant was proven by Southern blot hybridization. Moreover, the mutant was submitted to different comparative experiments with the wildtype, in order to get information about the possible function of the target protein IsaB. Growth experiments have clearly demonstrated a faster growth behaviour of the isaB-mutant cells compared to the wildtype. However, in the presence of high salt and glucose concentrations the wildtype grew much faster suggesting a role of IsaB in growth under extreme environmental conditions. The results of this work clearly support the idea of using IsaB as a target protein for immuno-therapy against life-threatening infections due to S. aureus.
KW  - MRSA
KW  - monoklonale Antikörper
KW  - immunodominante Antigene
KW  - ELISA
KW  - Immuntherapie
KW  - MRSA
KW  - monoclonal antibodies
KW  - immunodominant antigens
KW  - ELISA
KW  - immuntherapy
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108
ER  - 
TY  - THES
A1  - Langenhan, Ronny
T1  - Identifizierung immunodominanter antigener Strukturen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) mit Hilfe einer Expressionsgenbank
T1  - Identification immunodominant and antigenic structures of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with an expression library
N2  - Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen.
N2  - Infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are increasingly difficult to threat due to the presence of multiple antibiotic resistance traits. Therfore, the developemet of alternative strategies are urgently demanded to combat severe staphylococcal infections. Immunotherapy has become a promising approach using specific, monoclonal antibodies against defined immunodominant structures (antigens) of the bacterium. The recent progress of genome-based research of bacterial pathogens allows now the global analysis of factors involved in pathogenicity. The identification of such virulence-associated factors might result in the development of specific antibodies against bacterial pathogens which may administered supplementary to antibiotics increasing the success of of a therapy. In this study an expression library of an MRSA strain was constructed. For this purpose, genomic DNA of a MRSA strain was digested with Sau3A and DNA fragments of 3 to 10 kb were ligated into the expression vector ZAP-express. The gene library encompasses approximately 10,000 clones. To detect specific antigenic structures the expression library was screened by using human sera of MRSA septiceamic patients and sera of asymptomatically colonized individuals. Clones which specifically reacted with the patients sera were further analyzed by DNA-sequencing and BLAST analysis. Several staphylococcal antigenic and immunodominant structures were identified including a putative holin and a gene with strong homology to the amidase lytA. Both proteins may phage-derived as they show significant similarity to a range of phage proteins. In addition, genes of the isd-locus reacted with the immunsera. These genes encode proteins which are important for transport of iron into the cell. Furthermore, a cadmium resistance factor (cadA), unknown proteins localized on Staphylococcus aureus pathogenicity island 3 (SaPI3) and protein A showed a positive reaction with the immune sera. Interestingly, almost all proteins identified are associated with mobile genetic elements. The results of the study suggests that proteins encoded on mobile genetic elements are indeed expressed during infection which in turn are recognized by the immune system resulting in the production of specific antibodies. To what extend these antibodies contribute to a successful defence of staphylococcal cells is currently not known and subject of ongoing studies. Moreover, the antigenic and immunodominant structures identified in this study have to subcloned to characterize their immunoreactive potential. The positive reaction of the patient serum with protein A is probably caused by the antibody-binding capacity of the protein to the FC-fragment of antibodies. An alternative theoretical opportunity could be that an acute S. aureus infection causes a massive production of protein A that subsequently consume antibodies due to binding of the FC-Fragment. The sum of these events may cause a dramatic immunsuppressive effect. In conclusion, several putative immunodominant structures have been identified being the basis for further studies to assess whether or not these structures may serve as targets of an antibody-based therapy of infections caused by S. aureus.
KW  - MRSA
KW  - monoklonale Antikörper
KW  - Expressionsgenbank
KW  - Pathogenitätsinsel
KW  - Bakteriophagen
KW  - MRSA
KW  - monoclonal antibodies
KW  - expression library
KW  - pathogenicity island
KW  - bacteriophage
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13719
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weinand, Hanne
T1  - Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen die Endonuklease NmeDI zur Typisierung von Neisseria meningitidis
T1  - Development of monoclonal antibodies directed against the endonuclease NmeDI for typing of Neisseria meningitidis
N2  - Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt.
N2  - Neisseria meningitidis is a leading cause of morbidity and mortality in children and adolescents. Typing is essential for epidemiological surveillance of meningococcal disease. The endonuclease NmeDI is specific to the clonal lineages ST-8 and ST-11 complex associated with serogroup C disease. Therefore, a monoclonal antibody was developed for rapid identification of strains belonging to these lineages. The antibody specifically recognized ST-8 and ST-11 complex meningococci in Western blots and dot blots. It is now routinely used at the German National reference centre for meningococci for presumptive identification of the lineages without multilocus sequence typing.
KW  - Herzmuskel
KW  - Durchblutungsmessung
KW  - NMR-Tomographie
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - monoklonale Antikörper
KW  - NmeDI
KW  - Typisierung
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - monoclonal antibodies
KW  - NmeDI
KW  - typing
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12878
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bittner, Thomas
T1  - Immunhistologische Charakterisierung immunkompetenter Zellen in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes
T1  - Immunohistochemical characterisation of immunocompetent cells in squamous cell carcinomas of the upper aerodigestive tract
N2  - Ziel der vorliegenden Studie war es, die Beziehung zwischen Expression der Basalmembran und der damit einhergehen Veränderung des Immunzelleninfiltrates zu untersuchen. Eine Reihe von 23 Plattenepithelkarzinomen des Larynx und Hypopharynx wurden lichtmikroskopisch untersucht. Hierzu wurde eine immunhistochemischen Färbung verwendet mit monoklonalen Antikörpern gegen folgende Membranantigene: CD 1a, CD 4, CD 8, Pan B, CD 14, ICAM 1, LFA, HLA-DR, Kollagen 4. Die immunhistochemische Analyse wurde bezogen auf den Differenzierungsgrad des Tumors, definiert durch die Ausprägung der Basalmembran. Epithel und Stroma wurden getrennt ausgezählt. Der Verlust der Basalmembran wurde von einer Veränderung in der Zusammensetzung des Immunzelleninfiltrates begleitet: HLA-DR und LFA nahm in beiden Kompartimenten ab. Pan B und CD 14 zeigten eine Parallelität im Färbeverhalten. Pan B zeigte die stärkste Färbung in Plattenepithelkarzinomen mit annähernd ununterbrochener Basalmembran. CD 8 zeigte die stärksteFärbung in Plattenepithelkarzinomen mit lückenhafter, aber noch vorhandener Basalmembran. Die CD 8 positiven Zellen zeigten stellenweise engen Kontakt zur Basalmembran, stellenweise keimzentrumsähnliche Anordnungen. Wir schlussfolgern, dass bei gut differenzierten Tumoren das B-Zell System, bei mäßig differenzierten das T-Zell System eine gewisse Rolle spielt. Der Übergangszone Tumor-Stroma scheint eine besondere immunologische Bedeutung zu zukommen.
N2  - The objective of the present study was to evaluate the relationship between the expression of the basement Membrane (BM) in SCC and the relative proportions of selective immune cell populations. A series of 23 SCC of the Larynx and the Hypopharynx was assessed by light microscopy and using immunohistochemical staining with monoclonal antibodies directed against the following cell surface antigens: CD 1a, CD 4, CD 8, Pan B, CD 14, ICAM 1, LFA, HLA-DR, Collagen 4. Immunhistochemical analysis of the tumor infiltrating cells was performed and correlated with the transformation level as defined by the grade of expression of BM. The loss of BM was accompanied by a change in immune infiltrate: HLA-DR and LFA decreased in both compartiments. The B cells stained in parallel with CD 14 positive cells. Pan B showed the highest levels in SCC with a nearly continous BM. CD 8 peaked in tumors with a leaky but still present BM. The CD 8 cells showed sometimes tight junction to the BM, sometimes formations similar to germinal centers. We conclude that in well differentiated SCC the B cell system plays a certain role, in middle differentiated the T cell system. The epithelio-stromal junction zone seems to play an important immunologic role.
KW  - Plattenepithelkarzinom
KW  - immunkompetente Zellen
KW  - monoklonale Antikörper
KW  - Immunantwort
KW  - squamous cell carcinoma
KW  - immunocompetent cells
KW  - monoclonal antibodies
KW  - immune response
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12087
ER  -