TY  - THES
A1  - Schmitt, Johannes
T1  - Proteine der Kernhülle und deren Rolle bei der Umgestaltung des Zellkerns meiotischer und postmeiotischer Zellen von Säugern
T1  - Proteins of the nuclear envelope and their role in the rearrangement of the nucleus in meiotic and post-meiotic mammalian cell
N2  - Während der Spermatogenese finden erstaunliche Differenzierungsprozessen statt. Reguliert wird die Spermatogenese sowohl hormonell als auch durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und der extrazellulärer Matrix. Unterteilt wird die Spermatogenese in drei funktionelle Einheiten. Die Proliferationsphase, die Meiose und die Spermiogenese. Im Laufe der Proliferationsphase gehen aus den Spermatogonien, Spermatocyten hervor, die die Meiose durchlaufen. Während der Prophase I der Meiose kommt es zur Reduktion und Rekombination des genetischen Materials, was mit charakteristischen und höchst dynamischen Bewegungsvorgängen der Telomere einhergeht. Auf die Meiose folgt die Spermiogenese, in der das genetische Material in seine „Transportform“ überführt wird und aus einer stationären, zellverbundenen Einheit ein mobiles autark funktionierendes Vehikel des genetischen Materials wird; das Spermium. Um das Verständnis dieser Vorgänge zu erweitern wurden in dieser Arbeit die Verteilungsmuster einiger Proteine in der Kernhülle von Zellen der Spermatogenese, in Hinblick auf ihre dynamische Umverteilung untersucht. Bei diesen Proteinen handelte es sich um die SUN-Domänen Proteine und das meiosespezifische Lamin C2. Die SUN-Domänen Proteine sind Teil des membrandurchspannenden LINC-Komplexes, der Komponenten des Nukleoplasma mit denen des Cytoplasma verbindet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun2 während der Meiose exprimiert werden, und an den Anheftungsplatten meiotischer Chromosomen lokalisieren und deren dynamisches Verteilungsmuster dem Verteilungsmuster der Telomere während der Prophase I der Meiose entsprechen. Dies deutet darauf hin, dass Sun1 und Sun2 eine tragende Rolle, während der koordinierten Bewegungsprozessen der Prophase I der Meiose spielen. In der Spermiogenese sind die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun3 vertreten. Dabei weist deren unterschiedliche Lokalisation an entgegengesetzten Zellpolen darauf hin, dass Sun1 und Sun3 möglicherweise unterschiedliche Funktionen bei der Umgestaltung des Spermienkopfes während der Spermiogenese erfüllen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung einer Mauslinie um die Rolle von Lamin C2 in der Meiose untersuchen zu können. Hierzu wurde eine Lamin C2 Knock-out Studie begonnen. In ersten Untersuchungen der knock-out Tiere konnte eine Größenreduktion der Hoden beobachtet werden. Ebenso konnte ein Abbruch der Meiose vermerkt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass sowohl die SUN-Domänen Proteine, als auch Lamin C2, wichtige Rollen in dem komplexen Arrangement der Spermatogenese übernehmen.
N2  - During spermatogenesis amazing differentiation processes take place. Spermatogenesis is regulated by hormones and crosstalk between several cell types and the extra cellular matrix. It can be divided in three functional processes: The proliferation phase, meiosis and spermiogenesis. In the course of the proliferation phase spermatogonia become spermatocytes, which then pass through meiosis. During prophase I of meiosis the reduction and the recombination of the genetic material take place, involving characteristic and highly dynamic movements of meiotic telomeres. Meiosis is followed by spermiogenesis, where the genetic material is converted to its “transport form”, thereby turning a static, tissue associated cell into a mobile, self-sufficient vehicle of the genetic material; the sperm. To expand the knowledge of these processes, the localisation of some proteins of the nuclear envelope of spermatogenetic cells were examined in this work, in order to discover their dynamic distribution pattern. These proteins are the SUN-domain proteins and the meiosis specific lamin C2. The SUN-domain proteins are part of the transmembrane LINC-complex, which connects nucleoplasmic and cytoplasmic components. This work shows, that the SUN-domain proteins Sun1 and Sun2 are expressed during meiosis, that they are located at the attachment sites of the meiotic telomeres, and that their localisation parallels the dynamic movements of the telomeres, which take place in meiotic prophase I. These results indicate that Sun1 and Sun2 play a major role in the coordinated telomere movements during prophase I of meiosis. This work furthermore shows the specific expression of Sun1 and Sun3 during spermiogenesis. Their localisation at opposite poles of the spermatid head indicates discrete functions during the transformation of the sperm head, which takes place in this phase of spermatogenesis. Another focus of this work was the establishment of a lamin C2 knock out mouse line to analyse the role of lamin C2 in meiosis. Analysis of the knock out animals showed a reduction of testis-size in comparison to wild-type mice. Additionaly meiosis was aborted in lamin C2 deficient mice. In summary these results make evident, that the SUN-domain proteins, as well as the meiosis specific lamin C2 play an important role in the complex arrangements of spermiogenesis.
KW  - Meiose
KW  - Spermatogenese
KW  - Kernproteine
KW  - meiosis
KW  - spermatogenesis
KW  - nucleus
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31203
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kandert, Sebastian
T1  - Der Einfluss von Mutationen im LMNA-Gen auf die Struktur und Funktion des Zellkerns
T1  - The impact of mutations in the LMNA-gen on structure and function of the nucleus
N2  - Die Lamina ist ein Netzwerk aus Lamin-Proteinen und befindet sich unterhalb der inneren Kernmembran. Die Lamine A/C, die zu den Typ V Intermediärfilamenten gehören, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Zellkernes sowie der Chromatinorganisation, der Transkription, der DNA-Replikation, der Differenzierung und der Genomstabilität. In den letzten Jahren wurden über 200 verschiedene Mutationen im Lamin A/C kodierenden LMNA Gen gefunden, die mehr als 10 unterschiedliche Krankheiten, die so genannten Laminopathien, auslösen können. Zu diesen Laminopathien zählen unter anderem die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) und das Progerie-Syndrom. Die Mutation LMNA S143F In dieser Arbeit wurde zunächst die Punktmutation LMNA S143F, die in der N-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert ist, näher untersucht. Diese Mutation ist der Auslöser von einzigartigen phänotypischen Merkmalen einer frühen Myopathie sowie einer Progerie. Strukturelle Analysen mit dem Elektronenmikroskop ergaben, dass die primären dermalen Fibroblasten der Laminopathie-Patientin morphologisch veränderte Zellkerne hatten. In Abhängigkeit von S143F Lamin A/C konnte in den Patientenfibroblasten eine abnormale Lokalisation der Kernproteine Nesprin2 Giant und den kürzeren Nesprin2-Isoformen nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass eine reduzierte Expression von Nesprin2 Giant eine Rolle bei der Ausprägung der morphologischen Kerndeformationen spielte. Patientenzellen, die Nesprin2 Giant in hohem Maße exprimierten, zeigten keine Deformationen des Zellkerns und eine normale Verteilung verschiedener Kernproteine. FRAP-Analysen in vivo und biochemische Proteinextraktionsstudien des S143F-Lamin A/Cs in vitro zeigten eine verringerte Mobilität und Dynamik, sowie eine reduzierte Löslichkeit von S143F Lamin A/C gegenüber wildtypischem Lamin A/C. Die Mutation LMNA S143F liegt im Außenbereich der coiled-coil-Struktur des Lamins. Dadurch führt der Austausch der neutralen AS Serin durch die große hydrophobe AS Phenylalanin nicht zu einer Störung in der Dimer-bildung, sondern zu einer Beeinflussung der Formierung zu Protofilamenten bzw. höheren Strukturen. Dies konnte durch in vitro Untersuchungen von rekonstituierten Parakristallen aus S143F Lamin A/C dargestellt werden, die eine Veränderung des transversalen Bänderungs-musters aufwiesen. Zusammengenommen zeigen die Resultate, dass die Mutation LMNA S143F die Lamin-A-Polymerisation beeinflusst und dadurch die Dynamik und Mobilität der Typ A-Lamine beeinträchtigt. Außerdem konnte erstmals nachgewiesen werden, dass das Nesprin2 Giant Protein eine essentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt, indem es die Struktur des Zellkerns verstärkt und als struktureller „Gegenspieler“ zu Lamin A/C fungiert. Die Mutation LMNA R545C Die Punktmutation LMNA R545C, die in der C-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert, ist Auslöser eines sehr gravierenden Phänotyps der autosomal dominanten Form der Emery- Dreifuss-Muskeldystrophie (AD-EDMD). Strukturelle Analysen ergaben, dass die primären Myoblasten des EDMD-Patienten morphologisch veränderte Zellkerne haben. Ein Vergleich von deformierten Kernen aus Zellen mit verschiedenen Laminopathie-auslösenden Mutationen wie LMNA R545C, LMNA S143F und LMNA R377H zeigten allerdings, dass die untersuchten Mutationen nicht immer zu gleichen abnormalen Phänotypen der Kernmorphologie, sondern zu divergenten Ausprägungen der morphologischen Kernveränderungen in Patientenzellen führten. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass auch die Proteine Lamin A/C und Emerin in den Patientenzellen eine fehlerhafte Verteilung aufwiesen und „Honigwabenmuster“ ausbildeten. Interessanterweise konnte auch eine vom Alter der Zellen abhängige Akkumulation der 20S-Untereinheit des Proteasoms in kleine nukleäre Foci beobachtet werden. Diese Foci kolokalisierten weitgehend mit den promyelotischen Leukämie-Körperchen (PML). In den Patientenmyoblasten war der CDK-Inhibitor p21 stark angereichert, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der proteasomalen Funktion ist. Nach Kultivierung der Patientenmyoblasten in Minimalmedium zeigten diese eine eingeschränkte Fähigkeit zur ex-vivo Differenzierung zu Myotuben. Dementsprechend war die Expression des Myogenese-spezifischen Transkriptionsfaktors Myogenin, sowie des Proliferationmarkers hypophosphoryliertes Retinoblastoma-Protein in Patientenmyoblasten nicht korrekt induziert. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass auch die Mutation LMNA R545C Einfluss auf die Kernarchitektur und -Proteinverteilung, die Chromatinorganisation, Gen-expression und Funktion des Proteasoms einnimmt. Darüber hinaus beeinträchtigte die Mutation LMNA R545C die Fähigkeit zur korrekten Proliferation und Differenzierung der Myoblasten, welches eine potentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt.
N2  - The nuclear lamina is a network of lamin polymers underlying the inner nuclear membrane. The lamins A/C, which are type V intermediatefilaments, are involved in the organisation of chromatin, gene regulation, DNA-replication, differentiation and the integrity of the genome. In recent years more than 200 mutations in the lamin A/C coding LMNA gene were discovered, which cause more than 10 genetic diseases, collectively termed as laminopathies. These laminopathies include the Emery-Dreifuss-muscular dystrophy (EDMD) and the progeria syndrome. The mutation LMNA S143F First we observed the S143F lamin A/C point mutation, located in the N-terminal domain of the lamin A/C. This mutation causes a phenotype combining features of myopathy and progeria. Structural analyses revealed that patient dermal fibroblast cells had dysmorphic nuclei containing numerous blebs and lobulations. The lamin S143F organization was altered, showing intranuclear and nuclear envelope aggregates and often presenting a honeycomb appearance. Subject to the S143F lamin A/C, there is a reduced expression and an altered distribution of nesprin2 giant and the shorter nesprin2 isoforms in patient fibroblasts. A subpopulation of mutant cells, however, expressing the nesprin2 giant isoform, did not show an overt nuclear phenotype. By contrast, nesprin2 giant deficient cells reveal an aberrant nuclear phenotype and a mislocalization of LAP2α and the transcriptional active form of the RNA-Polymerase II. More detailed analyses of the S143F lamin A/C structure by FRAP-analysis in vivo and biochemical extraction studies in vitro revealed that S143F lamin is less dynamic and dissoluble compared to wildtype lamin A/C. The LMNA S143F mutation occupies the surface of the coiled-coil-structure of the lamin A/C. Thus, the structural topology and particularly the substitution by a bulky, hydrophobic amino acid do not affect the lamin A/C dimer structure but rather perturb intermolecular interactions. This was confirmed by in vitro analysis of reconstituted paracrystals of lamin A/C, which exhibited an altered transversal stratification-pattern. Beyond that, another question was, whether there is a formation of heteropolymers of wildtype and S143F lamin A/C and a formation of homopolymers in vivo. BIFC-analysis confirmed that wildtype and mutated lamins had the capacity to form heteropolymers and homopolymers in vivo. Moreover, the wildtype homopolymers and the lamin A/C-heteropolymers localized correctly in the nuclear envelope. In contrast, the formation of the S143F lamin A/C homopolymers influenced their correct localization in the nuclear envelope and lead to an aberrant nuclear morphology. The mutation LMNA R545C Myoblasts of patients developing a serious form of the autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (AD-EDMD) in response to the R545C lamin A/C point mutation, located in the C-terminal domain, have been analyzed. Structural analyses revealed that subpopulations of these patient myoblast precursor cells had nuclear structural defects as lobulations, whose frequency increased with cell passages in culture. This overt phenotype was compared to other dysmorphic nuclei from laminopathy-causing mutations like LMNA S143F or LMNA R377H. These analyses pointed out, that each mutation leads to a specific nuclear phenotype. Immunofluorescence microscopy showed that the organisation of both lamin A/C and its inner nuclear membrane partner emerin were altered, showing a honeycomb appearance too. Furthermore, our data showed for the first time that in an EDMD context, a progressive accumulation of the 20S proteasomal core subunits into foci that largely colocalized with promyeolocytic leukemia bodies (PML) was obvious, as cells age in culture. Moreover, the impairment of proteasome function, as pointed out by p21 nuclear accumulation, may contribute to the high index of premature cellular senescence we observed in patient cells. Another signal concerning the premature senescence was the accumulation of heterochromatin in late passages and the one- to twofold increase of the nuclear volume of the patient myoblasts. When transferred into low serum medium, patient myoblasts expressing R545C mutated lamin A/C were deficient for ex-vivo differentiation into myotubes. Accordingly, the myogenesis transcription factor myogenin and the hypophosphorylated retinoblastoma-protein were not induced properly in patient myoblasts. These data suggest that the LMNA R545C mutation also affected the nuclear envelope architecture and the distribution of nuclear proteins, chromatin organization, gene expression and the proper function of the proteasome. Furthermore, the LMNA R545C mutation impaired both proliferation and differentiation capacities of myoblasts precursors as part of the pathogenesis of the AD-EDMD.
KW  - Krankheit
KW  - Genmutation
KW  - Kernproteine
KW  - Laminopathie
KW  - Lamin
KW  - LMNA S143F
KW  - laminopathy
KW  - lamin
KW  - LMNA S143F
KW  - nucleus
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36145
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kühlkamp, Thomas
T1  - Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern
T1  - The plasma membrane associated transport modifier RS1binds ubiquitin und migrates into the nucleus
N2  - Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist.
N2  - This work discribes investigations about the subcellular distribution and function of the plasma membrane-associated protein RS1, an regulator of plasma membrane transporters like the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 or the organic cation transporter OCT2 (Vehyl et al., 1993; Reinhardt et al., 1999; Valentin et al., 2000). The green fluorescent protein (GFP) was fused to RS1 from pig (pRS1) and expressed in LLC-PK1 cells. The GFP-pRS1 protein could be detected at the plasma membrane, in the cytoplasma and in the nucleus. Expression of various truncated forms of GFP-pRS1 showed that the N-terminal half of pRS1 (amino acids 1-328) is not necessary for the migration of pRS1 into the nucleus. In contrast, truncations of the C-terminus inhibited translocation into the nucleus. The C-terminus of pRS1 contains a conserved ubiquitin associated domain (UBA) at amino acids 579 to 616. Affinity chromatography with ubiquitin-conjungated Sepharose beads showed a noncovalent binding of pRS1 to immobilized ubiquitin, which was abolished in the presence of an excess of free ubiquitin. Further analysis schowed that the C-terminal 111 amino acids were indispensable for ubiquitin binding. A conserved di-leucine signal (pRS1 336/337) is a well known endocytosis motif and points to an involvement of pRS1 in the internalisation of plasma membrane proteins. This hypothesis was supported by the finding of an increased uptake of the intercalating membrane dye RH 414 in a pRS1-overexpressing LLC-PK1 cell line. Based on this findings together with previous data, a model for the physiological role of RS1 was proposed. In this model, RS1 serves as an adaptor which links ubiquitinated plasma membrane transporters such as SGLT1 to the endocytosis machinery. Moreover RS1 migrates into the nucleus and is involved in the transcriptional suppression of SGLT1.
KW  - Ubiquitin
KW  - Carrier-Proteine
KW  - Plasmamembran
KW  - Zellkern
KW  - RS1
KW  - SGLT1
KW  - UBA
KW  - Ubiquitin
KW  - Plasmamembrane
KW  - Zellkern
KW  - Endocytose
KW  - RS1
KW  - SGLT1
KW  - UBA
KW  - ubiquitin
KW  - plasma membrane
KW  - nucleus
KW  - endocytosis
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179507
ER  -