TY  - THES
A1  - Roth, Markus
T1  - Etablierung eines isogenen Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung mono- und biallelischer TP53-Inaktivierungen beim Multiplen Myelom
T1  - Establishment of an isogenic cell line model for the investigation of the impact of mono- and biallelic TP53-inactivation on multiple myeloma
N2  - Trotz der Fortschritte in der Therapie des Multiplen Myeloms und des stetig wachsenden Arsenals effektiver anti-MM-Medikamente muss ein Teil der Patienten mit bestimmten zytogenetischen Veränderungen der Tumorzellen nach wie vor der Hochrisiko-Gruppe zugeordnet werden und hat eine Lebens-erwartung von nur wenigen Jahren. Einer der ungünstigsten prognostischen Marker ist die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 durch Mutationen des Gens oder Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 17, del(17p). Diese wird häufig mit einer Chemoresistenz der entarteten Plasmazellen in Verbindung gebracht.
In der vorliegenden Arbeit gelang es mittels des CRISPR/Cas9-Systems TP53-Läsionen zu erzeugen und isogene Klone der TP53wt/wt Zelllinie AMO-1 zu generieren. Diese wurden anhand der Sequenzanalysen von beiden TP53-Allelen den Gruppen der biallelisch TP53-inaktivierten, der monoallelisch TP53-inaktivierten und der TP53wt/wt Klone zugeordnet. Das gruppenspezifische Verhalten der Klone aller drei Gruppen hinsichtlich deren Expression von p53, p21 und Mdm2 unterstrich die Validität des etablierten Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung von TP53-Läsionen beim Multiplen Myelom. Neben einer kompletten Ausschaltung durch biallelische TP53-Inaktivierung zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch eine Haploinsuffizienz des p53-Systems. Diese äußerte sich in einer Abschwächung der Nutlin-3A-abhängigen p53-, p21- und Mdm2-Induktion bereits nach Inaktivierung eines TP53-Allels durch Frameshift-Mutation. Korrelierend zu dem Proteinexpressions¬muster konnte eine zunehmende Resistenzentwicklung der Klone je nach Grad der TP53-Inaktivierung (mono- bzw. biallelisch) gegen Nutlin 3A sowie genotoxische Substanzen nachgewiesen werden, während die Sensibilität der MM-Zellen gegen Proteasominhibitoren unbeeinträchtigt blieb. Einschränkungen hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das Multiple Myelom im Allgemeinen bestehen in dem Umstand, dass die beschriebenen Beobachtungen lediglich an einer einzigen MM-Zelllinie gemacht werden konnten. Dies ist durch die geringe Auswahl an TP53wt/wt MM-Zelllinien, die zudem noch oft eine schlechte Transfektabilität und niedrige Zellteilungsrate nach Einzelzellselektion aufweisen, bedingt.
Die an der Zelllinie AMO-1 gemachten Beobachtungen stehen in Einklang mit der in klinischen Studien festgestellten Verkürzung des progressionsfreien- (PFS) und Gesamt-Überlebens (OS) bei MM-Patienten mit TP53-Alterationen. Die zunehmende Chemoresistenz der malignen Plasmazellen nach mono- bzw. biallelischer TP53-Inaktivierung kann als Grund für die Akkumulation entsprechender Klone im Rezidiv und in fortgeschrittenen Krankheitsstadien des MM angesehen werden. Mittels möglichst umfassender Erfassung des genauen TP53-Läsions-Status in zukünftigen klinischen Studien zu multiplen Zeitpunkten des Krankheitsverlaufs könnte der Einfluss verschiedener, in der Therapie des MM zum Einsatz kommender Substanzen auf die Selektion bzw. die Unterdrückung besonders virulenter Subklone mit TP53-Läsionen untersucht werden.
N2  - Despite the current huge improvements in the therapy of multiple myeloma, patients with TP53-inactivation have a poor PFS and OS.
In the present work, it succeeded to establish isogenic clones of the TP53wt/wt-cell-line AMO-1 via CRISPR-Cas9-engineering. These clones could successfully be grouped in TP53wt/wt, TP53wt/- and TP53-/- clones by detection of p53 expression after overnight treatment with the mdm2-inhibitor nutlin-3a and by TP53-sequencing. All clones showed a group-specific induction of p53, p21 and mdm2, being less for the wt/- in comparison to the wt/wt-clones and not detectable for the -/- clones. Subsequently these clones showed a resistance for the treatment with the genotoxic drugs melphalan and etoposide, in contrast to their response on the proteasome inhibitors bortezomib and carfilzomib where no differences could be observed.
These observations agree well with the clinically observed dramatic impact of TP53-inactivation on PFS and OS. The development of chemoresistance by TP53-inactivation could be the reason for the accumulation of such clones during relapse after therapy and in advanced stages of the disease. To explore the impact of different therapy-modalities on the development of TP53-inactivated clones might be the aim of future clinical studies.
KW  - Plasmozytom
KW  - Muliples Myelom
KW  - multiple myeloma
KW  - TP53
KW  - p53
KW  - CRISPR/Cas9
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208939
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmid, Corinna
T1  - p53-Inaktivierung im Melanom - ein therapeutischer Ansatzpunkt?
T1  - p53-inactivation in melanoma - a therapeutical target?
N2  - Die Therapiemöglichkeiten für Patienten im Melanom Stadium IV sind nach wie vor begrenzt und die Erkrankung nur selten heilbar. Eine mögliche Ziel¬struktur in der Melanom¬therapie der Zukunft könnte das im Melanom häufig genetisch wild¬typisch vorliegende p53 sein. 

Für vorliegende Arbeit wurden humane Melanomzelllinien, welche stabil mit einem p53-Reportergenkonstrukt transduziert waren, hinsichtlich ihrer p53-Expression, -Akti-vität und -Akti¬vierbarkeit untersucht. Alle verwendeten Melanom¬zell¬¬¬linien exprimierten p53 un¬ab¬hängig vom p53-Mutations¬status. Drei der sieben untersuchten p53-wild¬typischen Melanomzelllinien zeigten keine oder nur sehr niedrige p53-Reporter¬gen¬aktivität. Die anderen vier p53-wildtypischen Zelllinien dagegen waren durch hohe, mittels p53-Knockdown unterdrückbare Reportergen¬expression gekennzeichnet. Die Proliferation dieser Zellen in Gegenwart von aktivem p53 belegt, dass Melanomzellen eine hohe Toleranz gegenüber diesem Tumor¬suppressor besitzen können. Eine weitere Steige¬rung der p53-Expression und -Aktivität durch die Hemmung von MDM2 (mouse double minute 2) mit der Substanz Nutlin-3a führte in den Zellen mit messbarer p53-Aktivität jedoch zu einem G1-Zell¬zyklusarrest. Dies belegt die prinzipielle Eignung von p53 als mögliche thera¬peutische Zielstruktur. Aufgrund ihrer schlechten Biover¬füg¬barkeit und hohen Toxizität gelten MDM2-Inhibitoren bisher aber als ungeeignet für den klinischen Einsatz. 

Die Reduktion hoher therapeutischer Nebenwirkungen könnte durch eine Melanom-spezifische Reaktivierung von p53 gelingen. Eine mögliche negativ-modulierende Wirkung des Mela¬¬nom¬¬markers TRP2 (tyrosinase-related-protein 2) auf p53 wurde im Jahr 2010 von Sendoel et al. nach Unter¬suchungen am Fadenwurm C. elegans vorgeschlagen. TRP2 wird beim metastasierten Melanom in mehr als 80 % der Fälle exprimiert und wäre, handelte es sich beim Melanom um einen weit verbreiteten Regulationsmechanismus, ein interessantes Zielprotein, um die Aktivität von p53 zu steigern. Die dargestellten Ergeb¬nisse zeigen, dass TRP2 zwar in vier von fünf Melanomzelllinien exprimiert wurde, die Unterdrückung der TRP2-Expression jedoch weder spezifischen Einfluss auf die p53-Expression noch auf die p53-Reportergenaktivität zeigte. Auch das veränderte Wachs¬tums¬¬¬verhalten der Zellen nach Unterdrückung von TRP2 mittels drei unterschiedlicher shRNAs konnte im Rescue-Experiment, bei dem TRP nach seinem Knockdown ektop exprimiert wurde, keinem spezifischen Effekt von TRP2 auf die p53-Expression oder p53-Reporteraktivität zugeordnet werden. Auch in der TRP2-negativen Zelllinie führte die ektope TRP2-Expression nicht zu einer verminderten p53-Expression oder -Aktivität. Für das im Gegensatz zu MDM2 deutlich melanomspezifischere TRP2 konnte demensprechend kein sicherer regulatorischer Zusammenhang mit p53 dargestellt werden.
 
Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche Bedeutung wildtypischem p53 im Melanom zukommt und ob sich weitere mögliche p53-Regulatoren als therapeutische Angriffspunkte eignen.
N2  - The aim of this study was to investigate the role of wildtype and transcriptional inactive p53 and tyrosinase related protein 2 (TRP2) as potential regulator of p53 in melanoma cell lines. 

Nine human melanoma cell lines were transduced with a lentiviral pGreenFire™ reporter construct encoding luciferase and GFP under the control of a p53 responsive element. Western blots, luciferase and green fluorescent protein (GFP) assays were used to analyze p53-expression, -activity and -upregulation before and after knockdown of p53 and TRP2 by specific shRNAs. Moreover, melanoma cells were treated with Nutlin-3a, a specific inhibitor of the p53 ubiquitinase mouse double minute 2 homolog (mdm-2), to study its effect on cell proliferation using propidium iodide cell cycle FACS-analysis.  

Growth of melanoma cells in the presence of active p53 suggests that they tolerate high levels of p53. Furthermore this study shows that preexisting p53 activity can be upregulated by treating the cells with Nutlin-3a. This upregulation was associated with a clear cut cell cycle arrest while the low level p53 activity melanoma cell lines did not show any comparable effect. In contrast regulation of p53 by TRP2 seems not to be common in melanoma cell lines. This study could not depict specific effects on p53 activity alteration after TRP2 knockdown. The role of TRP2 as a potential regulator of p53 in melanoma stays questionable. 

In principle enhancement of preexisting p53 activity by treating melanoma cells with Nutlin-3a would be a suitable therapeutic target. However, due to its toxicity in humans it might be inappropriate for clinical applications.
KW  - Melanom
KW  - p53
KW  - TRP2
KW  - Nutlin
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157853
ER  - 
TY  - THES
A1  - Frietsch, Jochen
T1  - Genetische Untersuchungen zur Amplifikation des Gens lasp-1 sowie statistische Auswertung der Auswirkungen der Proteinlokalisation auf das Langzeitüberleben
T1  - Genetic analysis of lasp-1 gene Amplification and statistic analysis of the impact of LASP-1s localization on long-term survival
N2  - Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen.
N2  - Breast cancer currently is the most frequent cancer in women worldwide and accounts for 15 % of cancer deaths in the western world. Metastatic diseases is generally considered as incurable with a median survival time of only a few years. The LIM and SH3 protein 1 (LASP-1) is a specific focal adhesion protein involved in cell proliferation and migration. The knockdown of LASP-1 in metastatic breast cancer and ovarian cancer cell lines results in a strong decrease in cell proliferation and cell migration. Reversely, ectopic over-expression of LASP-1 in non-neoplastic cells leads to an increase in migration. In patients with breast and ovarian cancer addressed in this study, the protein overexpression correlates with increased tumor size and nodal positivity. Quantitative analysis of genomic LASP-1 DNA in micro-dissected histological slices and subsequent qRT-PCR detected a LASP-1 amplification in only 1 out of 64 tissue samples, representing a negligible rate of LASP1 gene amplification. Therefore, LASP-1 overexpression is not due to LASP-1 gene amplification and can be interpreted as an active process in tumorigenesis which is caused through transcriptional regulation rather than gene amplification in the vast majority of human breast cancers. LASP-1 is not exclusively a cytoplasic protein, but has also been found in the nucleus of maligne transformed cells. In the present continuative long-term follow-up (January 1985 – December 2007) patient survival was correlated with LASP-1 expression using paraffin sections stained for LASP-1. Patients with nuclear location of LASP-1 show a significantly decreased long-term survival (p= 0,0250) in contrast to the subgroup of patients without nuclear LASP-1 expression. These results may lead to prognostic statements about the consequences of LASP-1 expression for individual patients.
KW  - Brustkrebs
KW  - Überleben
KW  - Proteine
KW  - LASP-1
KW  - Ki67
KW  - PDEF
KW  - p53
KW  - breast cancer
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54262
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lehmann, Christiane
T1  - Analyse prädiktiver Biomarker für therapeutische Strategien bei kolorektalem Karzinom
T1  - Comparative Analysis of Predictive Biomarkers for Therapeutical Strategies in Colorectal Cancer
N2  - Ziel dieser Arbeit war es, prognoserelevante Faktoren für das kolorektale Karzinom anhand des eigenen Patientengutes zu untersuchen. Insbesondere sollte die prognostische Relevanz der Tumormarker CEA, CA 19-9 und p53 in Bezug auf tumorbedingtes Überleben und rezidivfreie Zeit analysiert werden, um anhand ihrer Ausprägung die Prognose eines Patienten nach primär chirurgischer Therapie besser definieren zu können. Dementsprechend sollte ein möglichst adäquates therapeutisches Vorgehen gewährleistet sein. Bezüglich des tumorbedingten Überlebens wurde anhand des Kaplan-Meier Verfahrens nachgewiesen, dass sowohl das UICC-Stadium als auch die Darmwandinfiltration (T-Status), Lymphknotenbefall (N-Status) und CEA im Serum als hochsignifikante Parameter dienen, wohingegen eine signifikante Einflussnahme für das Geschlecht, Alter, Tumorlokalisation, Grading, CA 19-9 und p53 (Serummessung) auf das Überleben nicht festgestellt wurde. Bei näherem Betrachten der einzelnen UICC-Stadien in Abhängigkeit von CEA war dieser der aussagekräfitgste prognostische Tumormarker (Serummessung, cut-off point >= 5 ng/ml) für Patienten in höherem UICC-Stadium (UICC III). Bei weiterer Betrachtung der einzelnen Subgruppen des UICC III-Stadiums war CEA insbesondere für Patienten in UICC IIIA am relevantesten. Bezüglich der beiden anderen Tumormarker CA 19-9 und p53 konnte mittels der Serummessungen keine Korrelation mit dem UICC-Stadium bzw. auch keine signifikante Einflussnahme auf das tumorbedingte Überleben festgestellt werden. Für die rezidivfreie Zeit zeigten UICC-Stadium, T-Status, N-Status, CEA (Serummessung) und Tumorlokalisation (Kolon/Rektum) eine signifikante Einflussnahme. Tumoren des Rektums hatten ein höheres Risikoprofil als die des Kolons. Die immunhistologische und molekulargenetische Analyse bezüglich aller drei Tumormarker bestätigte das UICC Stadium III als ein Risikostadium. Dabei lies sich entgegen der Serummessungen auch für CA 19-9 und p53 eine stadienabhängige Risiko-Korrelation darstellen. Des Weiteren korrelierte das Auftreten p53 spezifischer IgG Antikörper stark mit der p53 Proteinexpression im Gewebe, was die Annahme eines Zusammenhangs zwischen intrazellulärer Ansammlung von p53 in Tumorzellen und einer humoralen Antwort auf p53 stützt. Mit Ausnahme von CEA, zeigten CA 19-9 und p53 für sich alleine keine Korrelation zwischen erhöhten Serumwerten und/oder der Expression im Tumor und dem postoperativen Auftreten von Rezidiven. Dahingegen wurde erstmals in dieser Arbeit festgestellt, dass Patienten, die mindestens drei erhöhte Parameter (CEA, CA 19-9 und p53) im Serum und/oder im Tumor (Protein- oder Genexpression) hatten, eine höhere Rezidivrate (Lokal-, Metastasen) während der Tumornachsorge (36±6,6 Monate) zeigten; dies unabhängig von ihrem UICC Stadium (UICC I-III). Speziell diese Risikogruppe könnte von einer adjuvanten Therapie profitieren.
N2  - Background: Prognostic information regarding the risk of postoperative tumor recurrence defined by a profile of serological, morphological and/or molecular markers can have potential value particularly for patients with colorectal carcinoma (CRC) of UICC stage II/III, who may benefit from adjuvant chemotherapy after surgery. Methods: A retrospective study of 783 patients with CRC (UICC I-III) including a subgroup analysis of 116 subjects was conducted to determine preoperative serum CEA, CA 19-9, and p53 serum levels. In addition, protein and gene expression of p53, CEA, and APC was assessed in the tumors of those patients. The values of all serological, morphological and molecular parameters were correlated with clinicopathological characteristics for their predictive value of tumor recurrence over a mean follow-up period of 32±6.2 months. Results: Serum CEA but not CA 19-9 or p53 was a significant prognostic factor for disease free survival along with UICC and T/N-stage. When comparing elevated CEA, CA 19-9, and p53 serum levels with expression of the markers in the tumors, their overall expression was found to be 61.3% in the serum versus 93.5% in the tumor in the analyzed patients (n=116). In particular, all patients in UICC stage I-III that demonstrated at least three elevated markers (CEA/CA19-9/p53) in serum and/or in the tumor presented with tumor recurrence/metastases. Conclusion: Overall increased p53, CEA, and CA 19-9 serum levels and their marker expression in the tumor may be used at the time of removal of the primary tumor for defining patients at risk for tumor recurrence.
KW  - Carcino-embryonales Antigen
KW  - Protein p53
KW  - Tumorantigen CA 19-9
KW  - Dickdarmkrebs
KW  - Prognosemarker
KW  - Prognostic marker
KW  - Colorectal carcinoma
KW  - p53
KW  - CEA
KW  - CA 19-9
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23950
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schramm, Nicolai Alexander
T1  - Untersuchungen zur Anti-Tumor-Immunantwort unter Berücksichtigung der Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit kolorektalem Karzinom
T1  - T-cell response to p53 tumor-associated antigen in patients with colorectal carcinoma.
N2  - Trotz radikaler chirurgischer Resektion kommt es bei Patienten mit kolorektalem Karzinom häufig zum Tumorrezidiv. In unserem Patientenkollektiv (n=51) erlitten innerhalb von 3 Jahren 18% der Patienten ein Rezidiv nach kurativer R0-Resektion. Eine mögliche Erklärung dafür wird in einer Suppression der Anti-Tumor-Immunantwort gesehen, die eine vollständige immunologische Tumorzerstörung verhindert. Regulatorische T(Treg)-Lymphozyten spielen hierbei eine wesentliche Rolle. Der Nachweis dieser Zellen und deren gesteigerte IL-10-Produktion könnte eine mögliche Erklärung für die hohe Rezidivrate bei Patienten mit kolorektalem Karzinom bieten. Ziel unserer Untersuchungen war es daher, die tumorspezifische Immunantwort bei Patienten mit kolorektalem Karzinom stadienabhängig (UICC I-IV) zu untersuchen und im Blut und Tumor vorhandene T-Zellen sowohl morphologisch als auch funktionell zu charakterisieren. Als tumorspezifisches Antigen wurde das Tumorsuppressorgen p53 gewählt, da es in bis zu 60% aller kolorektalen Karzinome überexprimiert wird. Präoperativ gewonnene periphere Blutlymphozyten (PBL) dieser Patienten wurden mit überlappenden synthetischen Peptidfragmenten der gesamten Wildtyp-p53-Proteinsequenz stimuliert und anhand der resultierenden Zytokinproduktion (IL-10, IFN-γ) verglichen (ELISPOT, ELISA). Sowohl Cytospinpräparate der PBL als auch Tumorgewebe wurden immunhistologisch in Einzel- und Doppelfärbung charakterisiert. Mittels ELISA wurde das Serum der Patienten auf das Vorhandensein von p53-Antikörpern untersucht. Spezifische p53-Mutationen und die Expression von Treg spezifischen Genen im Tumorgewebe wurden mittels Real-Time-PCR analysiert. Nur bei 35 % der untersuchten Patientensera (n=40) fanden sich p53-spezifische Antikörper, wobei keine Korrelation zum UICC-Stadium bestand. Es zeigte sich, dass sich die p53-Peptide, die eine IFN-γ Produktion hervorrufen, von denen unterscheiden, die eine IL-10 Expression induzieren. Unabhängig von spezifischen p53-Mutationen spielte dabei das UICC-Stadium für die IL-10-Produktion eine besondere Rolle. So produzierten nach Peptid-Stimulation T-Zellen von Patienten im UICC-Stadium II wesentlich mehr IL-10 als T-Zellen von Patienten fortgeschrittener Stadien. Für die IFN-γ-Produktion fand sich keine Korrelation zum UICC-Stadium. Die immunhistologischen Untersuchungen zeigten, dass Patienten höherer Stadien (UICC III/IV) mehr CD4+CD25+-Lymphozyten im Blut und eine stärkere p53-Akkumulation im Tumor aufweisen als Patienten niedrigerer Stadien. Die Expression Treg-spezifischer Gene (CD4, CD25,CTLA-4, Foxp3, GITR, GATA-3) im Tumor korrelierte ebenso mit dem UICC-Stadium und war im UICC-Stadium II gesteigert. p53 induziert sowohl eine IFN-γ als auch eine IL-10 Expression. Das Überwiegen der IL-10-Produktion deutet darauf hin, dass p53-spezifische Treg–Zellen direkt an der Modulation Anti-Tumor-Immunantwort beteiligt sind. Durch Überexpression von p53 induziert der Tumor selbst eine Th2-Immunantwort, die zu vermehrter Toleranz des Tumors durch die Lymphozyten führt. Dies stellt einen neuen möglichen Tumor-Escape-Mechanismus dar. Sowohl die IL-10 Spiegel im Blut als auch die Expression Treg-spezifischer Gene im Tumorgewebe korrelieren mit dem Stadium der Erkrankung. Dies scheint die schlechte Prognose und hohe Rezidivhäufigkeit von Patienten mit bereits weit fortgeschrittenen Karzinomen zu erklären. Die Ergebnisse der Arbeit eröffnen darüber hinaus neue Therapieoptionen: Eine Verschiebung der Anti-Tumor-Immunantwort hin zur vollständigen immunologischen Tumorzerstörung (Th1) wäre in Form einer spezifischen anti-IL-10-Antikörperapplikation oder einer gezielten Depletion der tumorspezifischen Treg–Zellen denkbar.
N2  - Despite the radical surgical resection performed in patients with colorectal carcinoma, there is a high rate of tumor recurrence. Over an observation period of 3 years, 18% of the patients in our collective suffered a tumor relapse with local or distinct metastases after initial R0-resection. Some evidence suggests that this may be due to suppression of anti-tumor responses, a phenomenon that might be attributed to regulatory T cells. The aim of our study was to investigate the tumor-specific immune response depending on the UICC stage of patients with colorectal cancer. The cellular immune responses against defined antigens that are overexpressed in most of the patients with colorectal cancer were characterized. For this purpose, the tumor suppressor gene, p53, was chosen as the tumor-associated antigen that exhibits mutations and overexpression in up to 60% of colorectal carcinoma. We observed that p53 induced both IFN-gamma and IL-10 secretion. The predominance of IL-10 production indicated that regulatory T cells directly participate in modulating the anti-tumor immune response. IL-10 levels in the blood as well as the expression of regulatory T-cell specific genes at the tumor site correlate with the UICC stage of the disease. These results may provide an explanation for the poor prognosis and increased recurrence rate in patients with advanced carcinoma.
KW  - p53
KW  - IL-10
KW  - kolorektales Karzinom
KW  - regulatorische T-Zellen
KW  - tumorassoziiertes Antigen
KW  - p53
KW  - IL-10
KW  - colorectal carcinoma
KW  - regulatory T cells
KW  - tumor-associated antigen
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22204
ER  - 
TY  - THES
A1  - Cam, Hakan
T1  - The role of p53 family members in myogenic differentiation and rhabdomyosarcoma development
N2  - Krebserkrankungen zeichnen sich häufig durch Störungen zellulärer Differenzierungsprozesse aus. So weisen Rhabdomyosarkome, die aus Muskelvorläuferzellen hervorgehen, Differenzierungsdefekte auf, die zur unkontrollierten Proliferation der Tumorzellen führen. Bislang ist ungeklärt, ob die Differenzierungsdefekte auf der verstärkten Expression von Inhibitoren, der defekten Funktion von Aktivatoren oder einer Kombination von beidem beruht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Unterschied zu normalen Muskelzellen RMS-Zellen verstärkt DeltaNp73, einen Pan-Inhibitor der p53-Tumorsuppressorfamilie, exprimieren. Die experimentelle Überexpression von DeltaNp73 in normalen Myoblasten blockierte die Muskeldifferenzierung und förderte in Kombination mit klassischen RMS-Onkogenen wie IGF2 oder PAX3/FKHR die maligne Transformation. Umgekehrt führte die Hemmung von DeltaNp73 durch RNAi zur Reduktion der Tumorigenität von RMS-Tumorzellen. Da DeltaNp73 als dominant-negativer Inhibitor der p53-Familie wirkt, lies die Hemmung von Differenzierungsprozessen durch DeltaNp73 vermuten, dass die p53-Familienmitglieder (p53, p63, und p73) an der Regulation der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei p53-Familienmitglieder bei der Induktion später Differenzierungsstadien kooperieren, indem sie die Aktivität des Retinoblastoma-Proteins RB regulieren. Die Funktion von RB ist bekanntermassen sowohl für den permanenten Zellzyklusarrest als auch für die Aktivierung Muskel-spezifischer Gene notwendig. Während p53 die Proteinspiegel von RB reguliert, kontrollieren p63 und p73 den Aktivierungsgrad von RB, indem sie dessen Phoshphorylierungszustand über den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p57KIP2 modifizieren. Eine Hemmung dieser Funktionen blockiert das Differenzierungsprogramm und fördert die Tumorentstehung. Die Aktivierung zellulärer Differenzierungsprozesse stellt somit einen entscheidenden Bestandteil der Tumorsuppressoraktivität der p53-Familie dar und liefert eine Erklärung für die Häufigkeit von Mutationen im p53-Signalweg bei Rhabdomyosarkom-Patienten.
N2  - Disruption of differentiation pathways is one of the hallmarks of cancer. In rhabdomyosarcoma (RMS), a human tumor arising from myogenic precursors, the muscle differentiation program is disabled resulting in uncontrolled proliferation. Whether the differentiation block is due to overexpression of inhibitors, deficient function of activators, or both remained unknown. This study shows that RMS cells but not non-neoplastic muscle cells overexpress DeltaNp73, a pan-inhibitor of the p53 family of tumor suppressor genes. Experimental overexpression of DeltaNp73 in normal muscle precursor cells inhibited myogenic differentiation and promoted malignant transformation in cooperation with the RMS oncogenes IGF2 and PAX3/FKHR. Vice versa, RNAi knockdown of DeltaNp73 reduced the tumorigenicity of established RMS tumor cells. As DeltaNp73 is a dominant-negative inhibitor of the p53 family, inhibition of differentiation by DeltaNp73 suggests that the p53 family members (p53, p63 and p73) are critically involved in myogenic differentiation control. Indeed, this study demonstrates that all three p53 family members cooperate to activate the late stages of the differentiation process by regulating the activity of the retinoblastoma protein RB. The function of RB is known to be required for both the permanent cell cycle exit and the activation of muscle-specific genes. Whereas p53 regulates RB protein levels, p63 and p73 control the activation state of RB by modifying its phosphorylation via the cyclin-dependent kinase inhibitor p57KIP2. Ablation of these p53 family functions blocks the differentiation program and promotes malignant transformation. Induction of cellular differentiation therefore contributes to the tumor suppressor activities of the p53 family and provides an explanation for the high frequency of p53 pathway alterations in rhabdomyosarcoma patients.
KW  - Rhabdomyosarkom
KW  - Muskelzelle
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Genexpression
KW  - p53
KW  - p63
KW  - p73
KW  - myogenic differentiation
KW  - rhabdomyosarcoma development
KW  - p53
KW  - p63
KW  - p73
KW  - myogenic differentiation
KW  - rhabdomyosarcoma development
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20240
ER  - 
TY  - THES
A1  - Beitzinger, Michaela
T1  - Regulierung der Telomerase durch das p53-Homolog p73
T1  - Regulation of telomerase activity by the p53-homologue p73
N2  - Das Ribonukleoprotein, Telomerase wird vor allem für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge benötigt und ist normalerweise nur in Keimbahnzellen, Stammzellen und anderen Zellen mit erhöhter Regenerationsfähigkeit aktiv. Die Aktivierung der Telomerase ist darüber hinaus ein wichtiger Faktor während der Krebsentstehung. Fast das komplette Spektrum humaner Tumore zeichnet sich durch hohe Telomerase-Aktivität aus. Vor allem maligne Tumore besitzen eine sehr aktive Telomerase, unlimitiertes Wachstum und Immortalität ermöglicht. Die Aktivität der Telomerase wird vor allem über die Expression der katalytischen Untereinheit hTERT reguliert, die unter der strikten Kontrolle verschiedener Tumorsuppressorgene liegt. Zu den wichtigsten Regulatoren der hTERT-Expression gehört auch der bekannte Tumorsuppressor p53. Über die Rolle des p53-Familienmitglieds p73 in der Regulation der Telomerase-Aktivität war bisher nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein regulatorischer Einfluss von p73 nachgewiesen werden. Dabei wurden deutliche Unterschiede in der Funktion der N-terminalen Isoformen TAp73 und DeltaNp73 beobachtet. TAp73 erwies sich sowohl nach Überexpression als auch nach Induktion des endogenen TAp73 als ein effizienter Repressor der hTERT-Expression. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hemmung des endogenen TAp73 mittels RNAi die Expression von hTERT in verschiedenen Zelllinen induziert werden. Zusätzlich zu der Funktion als Tumorsuppressor scheint p73 auch in verschiedene Differenzierungsprozesse involviert zu sein. Die Expression von p73 korreliert zwar mit der Hemmung der Telomerase-Aktivität während der myeloischen Differenzierung von HL60-Zellen, hat hier aber keine Bedeutung für die Repression von hTERT. Die N-terminal verkürzte Isoform DeltaNp73 wirkt im Gegensatz zu TAp73 als effizienter Aktivator der hTERT-Expression. DeltaNp73 induziert die hTERT-Expression einerseits über seine dominant-negative Funktion auf die pro-apoptotischen p53-Familienmitglieder und andererseits über die Hemmung repressiver RB-E2F-Komplexe. Im Rahmen dieser Studie erwies sich p73 somit als ein wichtiger Regulator der Telomerase Aktivität, wobei sich eine duale Rolle als negativer (TAp73) und auch als positiver (DeltaNp73) Regulator der Telomerase Aktivität herausstellte.
N2  - The ribonucleoprotein Telomerase is primarily responsible for the maintenance of the telomeric ends of the chromosomes and normally expressed in germ cells, stem cells and other cells with enhanced proliferative capacity. Furthermore, activation of telomerase is an important factor for cancer development. Almost all human tumors express active telomerase which mediates unlimited growth and immortality. Telomerase activity is mainly regulatedon the levels of its, which is strictly repressed by various tumorsuppressor genes. One of the most important regulators of the hTERT-Expression is the well known tumorsuppressor p53. So far there not much is known about the role of the p53 family member p73 in regulation of telomerase activity. This study confirmed the regulatory influence of p73 and revealed fundamental differences between the N-terminally isoforms TAp73 and DeltaNp73. Overexpression as well as induction of the endogenous p73 was sufficient to inhibit hTERT expression. In contrast, siRNA mediated knock-down of the endogenous p73 enhances hTERT expression in various cell lines. In addition to its role as tumorsuppressor p73 is also involved in the control of cellular differentiation processes. Expression of p73 correlates with the repression of telomerase activity during myeloid differentiation of HL60 cells but is not essential for inhibition of the hTERT. The N-terminal truncated isoform DeltaNp73 acts, in contrast to TAp73, as an efficient activator of hTERT. DeltaNp73 induces hTERT by its dominant negative function against all pro apoptotic p53 family members and by inhibition of repressive RB-E2F complexes at the hTERT promoter. This study revealed p73 as an important regulator of hTERT expression and demonstrated a dual role as a negative (TAp73) and positive (DeltaNp73) regulator of telomerase activity.
KW  - Telomerase
KW  - hTERT
KW  - p73
KW  - p53
KW  - telomerase
KW  - hTERT
KW  - p73
KW  - p53
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17985
ER  - 
TY  - THES
A1  - Scherer, Stefan
T1  - Regulation und funktionelle Analyse der menschlichen Mismatchreparaturgene /-proteine am speziellen Beispiel von hMSH2
T1  - Regulation and Functinal Analysis of the Human MIsmatch Repair Genes/Proteines
N2  - Das menschliche MHS2 Gen ist eine sehr gut charakterisierte Komponente des Mismatch-Reparatur-Systems (MMR) und häufig mit der HNPCC Erkrankung assoziiert. Der Mechanismus über den MSH2 an der Karzinomentwicklung beteiligt ist, sind Defekte in der DNA-Reparatur. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen in den kodierenden Regionen dieses Gens direkt in die Mikrosatelliteninstabilität involviert sind. Generell ist MSH2 ein Teil des postreplikativen Reparatursystems der Zellen, und schützt so vor der Akkumulation von Mutationen. Dadurch wird die genetische Stabilität und Integrität gewährleistet. Ein anderer Teil der zellulären Krebsabwehr ist das p53 Tumorsuppressorgen. Ein möglicher DNA Schaden, der in der Lage ist, p53 zu aktivieren, ist UV-Licht. Eine weitere gut charakterisierte Komponente der zellulären UV Reaktion ist der Transkriptionsfaktor c-Jun. Ziel der Arbeit war es die Regulation und Signalfunktion von MSH2 näher zu charakterisieren. Dazu wurde der Promotor des Gens in ein Luziferase Promotorgenkonstrukt kloniert. Dieses Konstrukt wurde in menschliche Keratinozyten transfiziert, die nachfolgend mit UV bestrahlt wurden. Es konnte eine zeit- und dosisabhängige Hochregulation von MSH2 gezeigt werden. Diese Transkriptionserhöhung wurde von p53 initiiert, denn durch eine gezielte Mutation der p53-Bindungsstelle im MSH2 Promotor war dieser Effekt vollkommen aufgehoben. Interessanterweise war dieser Effekt von einem zusätzlichen Faktor abhängig, ohne den keine Hochregulation erkennbar war. Verantwortlich hierfür war der Transkriptionsfaktor c-Jun. Dadurch konnte eine funktionelle Interaktion von p53 und c-Jun in der transkriptionellen Aktivierung von hMSH2 gezeigt werden. Dieser zeit- und dosisabhängige Effekt war sowohl auf RNA als auch auf Proteinebene nachvollziehbar. Der größte Anstieg war bei 50 J/m2 zu verzeichnen, wohin gegen bei Verwendung von 75 J/m2 die Transkriptmenge geringer wurde, um bei 100 J/m2 erneut anzusteigen. Um diesen erneuten Anstieg des Proteins näher zu beschreiben wurden bei den stark bestrahlten Zellen TUNEL-Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an MSH2 Protein und an TUNEL-positiven apoptotischen Zellen. Um weiter zu zeigen, dass der zweite Anstieg des Proteins nicht mit einer Reparaturfunktion verbunden ist, wurde ein biochemisch basierter Test durchgeführt, welcher die Reparaturkapazität semiquantitativ beschreibt. Dabei konnte klar gezeigt werden, dass die mit 100 J/m2 bestrahlten Zellen keine Reparaturfunktion mehr erfüllen. FACS-Analysen und Zellfärbungen gegen Annexin V und mit Propidiumiodid bestätigten die stattfindende Apoptose in den Zellen. Eine weitere Komponente des MMR-Systems ist MSH6. MSH6 bildet mit MSH2 ein Dimer, welches den Fehler in der DNA erkennt und das weitere Reparaturprogramm einleitet. Die Expression dieses Proteins konnte nur bis zu einer Dosis von 50-75 J/m2 UV nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu MSH2 war MSH6 nicht in 100 J/m2 bestrahlten Keratinozyten detektierbar. Um über die Lokalisation dieser Proteine mehr zu erfahren wurden Immunfärbungen gegen MSH2 durchgeführt. Es zeigte sich eine Translokation des Proteins vom Kern in das Zytoplasma in Korrelation zum zunehmenden DNA-Schaden durch höhere Dosen an UV-Licht. Dies stellt eine mögliche Verbindung zwischen dem Mismatch-Reparatursystem und apoptotischen Signalwegen dar.
N2  - MSH2 is a well-characterized component of the DNA mismatch repair system (MMR) frequently associated with Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). The mechanism of MSH2-induced cancer is via defects in DNA mismatch repair. Mutations in the coding region of the human gene (hMSH2) have been shown to be directly involved in microsatellite instability in HNPCC. The MSH2 gene is part of the post-replicative mismatch repair system that prevents the accumulation of spontaneous mutations, and thereby ensures the integrity and stability of the genome. Another component of the cancer prevention machinery is the p53 tumor suppressor. A relevant stress that activates p53 is UV-light. Another well known component of the mammalian UV response is the transcription factor c-Jun. To study the stress regulation and signaling function of hMSH2, we cloned the promoter region of hMSH2 in a luciferase reportergene construct. This construct was transfected in human keratinocytes. The cells were then irradiated with UV light. A time and dosage dependent upregulation of hMSH2 was seen. The transcription of the human mismatch repair gene was activated by p53. This activation was lost upon mutation of the p53 binding site. Interestingly this upregulation critically depends on functional interaction of p53 with c-Jun in the transcriptional control of the hMSH2 promoter. The same effect was seen in analyses of the endogenous hMSH2 gene on the RNA level as well as on the protein level. The highest hMSH2-expression was seen at 50 J/m2. At 75 J/m2 the hMSH2 expression level decreased. Surprisingly, at 100 J /m2 hMSH2 expression increased again. The same dosage dependent function was seen on the protein level. To address the question of a second function of hMSH2 in cells irradiated at high dose, TUNEL-assays were performed. A positive correlation between the level of hMSH2 protein and the number of apoptotic cells was found. To study the repair function of hMSH2 in highly irradiated cells, we used a biochemical mismatch repair assay system. Cells treated with high dosage of UV showed no repair activity in contrast to non-irradiated cells. Annexin V staining and FACS analysis confirmed the apoptotic status of these cells. It is well-known that hMSH6 is necessary for dimer formation with hMSH2 (MutSa) to detect DNA mismatches. So far there are little data on a possible involvement of hMSH6 in apoptosis. Therefore was performed an analysis of hMSH6 protein levels in irradiated cells, revealed that hMSH6 was expressed at doses up to 50 – 75 J/m2. In contrast no hMSH6 was detectable in UV-irradiated cells treated with 100 J/m2. In addition fluorescence immuno labelling of MSH2 revealed the subcellular translocation of the protein from the nucleus to the cytoplasm in apoptotic cells. This effect may indicate a possible link between the mismatch repair system and apoptotic pathways.
KW  - Mensch
KW  - Mismatch
KW  - DNS-Reparatur
KW  - Mismatchreparatur
KW  - MSH2
KW  - p53
KW  - AP-1
KW  - Mismatchrepair
KW  - MSH2
KW  - p53
KW  - AP-1
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8317
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hanke, Maria Annegret
T1  - Die Notwendigkeit der Doppelfärbung für Zytokeratin und DNA in der Durchflusszytometrie sowie ihre Bedeutung für die durchflusszytometrische Erfassung von p53 am Beispiel des Mammakarzinoms
T1  - Necessity of double-staining for Cytokeratin and DNA and importance of detection of p53 in flow cytometry from breast cancer
N2  - Die DNA-Durchflusszytometrie ist eine anerkannte Methode zur Erfassung genetischer Abweichungen und Änderungen der Proliferationsfraktion von Tumorzellen. Die Aufarbeitung von Tumorzellen mit vorhandenen Begleitpopulationen bewirkt allerdings bei der Einfachfärbung der DNA eine Ungenauigkeit der Zellzyklusanalyse. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Begleitpopulationen auf die Analyse von Ploidie und Zellzyklus mit Hilfe der DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung am Mammakarzinom untersucht. Zum anderen wird auf Zusammenhänge zwischen p53, Proliferation und Ploidie von Mammakarzinomen eingegangen. Von 28 untersuchten Fällen waren 26 für die DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung komplett auswertbar. Bei 9 dieser 26 ausgewerteten Fälle konnte immunhistochemisch p53 nachgewiesen werden. Die Zellen wurden aus Gefriermaterial mechanisch vereinzelt und mit Propidium Jodid und FITC-konjugiertem anti-Zytokeratin-Antikörper bzw. anti-p53-Antikörper gefärbt. Die Messungen wurden mit einem FACScan durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Multicycle Software AV. Die Auswertung der Zytokeratin-Doppelfärbung ergab im Vergleich zur Einfachfärbung einen Anstieg sowohl des Anteiles aneuploider Tumoren als auch des mittleren DNA-Index. Die Proliferationsrate, insbesondere die S-Phasen-Fraktion erhöhte sich ebenfalls signifikant. Die vergleichenden Zellzyklusanalysen der Zytokeratin-positiven und der p53-positiven Tumorzellen zeigte eine geringere Proliferationsfraktion der p53-positiven Zellen, verglichen mit den p53-negativen Tumorzellen. Der überwiegende Anteil der p53-positiven Zellen zeigte eine Aneuploidie. Weiterhin ergaben sich in dieser Untersuchung Hinweise auf eine Zellzyklusabhängige Expression des p53-Proteins. Durch die Nutzung der Doppelfärbung für DNA und Zytokeratin in der Durchflusszytometrie gelingt die exaktere Wiedergabe der Biologie von Tumoren. Es ist zu erwarten, dass dies die prognostische Aussagekraft der DNA-flowzytometrischen Parameter Ploidie und Proliferationsfraktion erhöht.
N2  - DNA flow cytometry is a well established technique in tumor pathology for the assessment of prognostic factors, genetic alteration and the determination of the proliferative fractions. However, it suffers from a contamination of non-tumor cells. This doctoral thesis investigated by cytokeratin-DNA double staining flow cytometry of breast cancers the influence of non-tumor cells on these parameters. In addition to that the connection between p53, proliferation and ploidy of breast cancer cells was discussed. 26 out of 28 cases of breast cancer were investigated whis cytokeratin-DNA double staining. In 9 out of those 26 p53 was detectable. Tumor cell nuclei from fresh frozen tumor tissues were mechanically separated, stained with propidium iodide and fluorescein isothiocyanate conjugated cytokeratin antibody and than measured by a FACScan. Statistical analysis was done by Multicycle software AV. A significant difference (p<0,001) was shown for the proportion of anoiploid tumors and the DNA-index, which were increased for the gated populations. Further more a significant increase was shown for the mean SPF. In comparison between p53-negative and -positive tumor cells, the positive-cells had a lower proliferation fraction. The most of p53-positive cells were aneuploid. There was a indication to suspect a cellcycle-dependent expression of p53-protein. By using cytokeratin-DNA double staining in flow cytometry reflection of tumor biology is more exactly. This is why this methode increases the prognostic value of cellcycle parameters like ploidy and proliferation fraction.
KW  - Durchflusszytometrie
KW  - nukleare DNA-Inhalt
KW  - Zytokeratin
KW  - Brustkrebs
KW  - Aneuploidie
KW  - S-Phase-Fraktion
KW  - Prognose
KW  - p53
KW  - flow cytometry
KW  - nuclear DNA content
KW  - cytokeratin
KW  - breast carcinoma
KW  - aneuploidy
KW  - S-phase fraction
KW  - prognosis
KW  - p53
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181814
ER  -