TY - THES A1 - Mourad, Caroline T1 - RNA-Interferenz humaner Natürlicher Killer-Zellen unter Einführung von siRNA mittels Lipofektion und Elektroporation T1 - RNA interference in human natural killer cells by introduction of siRNA by lipofection and electroporation N2 - Als Teil des angeborenen Immunsystems spielen Natürliche Killer(NK)- Zellen eine entscheidende Rolle in der Interaktion mit Pathogenen und Tumorzellen. Mithilfe der RNA-Interferenz bestimmter Gene wie beispielsweise CD56 könnten Hinweise auf die genaue Funktionsweise der NK-Zellen gewonnen werden. Ziel dieser Arbeit war es eine geeignete Transfektionsmethode zum Einführen von siRNA in NK-Zellen zu finden, welche eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zellviabilität aufweist. Hierfür wurden drei verschiedene Lipofektionsreagenzien und sechs verschiedene Elektroporationsprogramme verglichen. Zunächst wurde die Transfektionseffizienz mit an AF488 gekoppelter negativer siRNA per Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie evaluiert und jeweils das effizienteste Lipofektionsreagenz bzw. Elektroporationsprogramm ausgewählt. Mit diesen wurde anschließend eine Herunterregulation des CD56-Gens mit CD56-siRNA per RNA-Interferenz versucht. Die CD56-Gen-Expression wurde auf Proteinebene per Durchflusszytometrie und auf mRNA-Ebene per PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) evaluiert. N2 - As a part of the innate immune system Natural Killer (NK) cells play a crucial role in the interaction with pathogens and tumor cells. Using RNA interference of special genes like CD56 may lead to a better understanding of the function of NK cells. The aim of this work was to find a suitable transfection method to introduce siRNA into NK cells which shows a high transfection efficiency and at the same time a high cell viability. Three different lipofection reagents and six different electroporation programs were compared. Initially, the transfection efficiency was evaluated with AF488-tagged negative siRNA by fluorescence microscopy and flow cytometry and the most efficient lipofection reagent and electroporation program were chosen. Using these a knockdown of the CD56 gene was tried by RNA interference with CD56 siRNA. The CD56 gene expression was evaluated on the protein level by flow cytometry and on the mRNA level by PCR (polymerase chain reaction). KW - RNS-Interferenz KW - Transfektion KW - Natürliche Killer-Zellen KW - natural killer cells KW - RNA interference KW - Elektroporation KW - electroporation KW - Lipofektion KW - lipofection KW - transfection KW - siRNA Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185458 ER - TY - THES A1 - Hohloch, Silke T1 - Etablierung eines hochsensitiven liposomalen Transfektionssystems zur Untersuchung der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in ß-Zelllinien und primären ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen T1 - Introduction of a highly sensitive transfection system to investigate human insulin promoter activity in beta-cell lines and in primary cultured beta-cells of the human endocrine pancreas N2 - Die Insulinbiosynthese in ß-Zellen des endokrinen Pankreas wird auf transkriptioneller Ebene durch die Aktivität des Insulingenpromotors reguliert. Die detaillierte Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors erfolgte bisher nur in speziesdifferenten ß-Zelllinien, da glukosesensitive ß-Zelllinien aus dem Pankreas des Menschen nicht verfügbar sind. Es ist jedoch bekannt, dass signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation der Genexpression in unterschiedlichen Spezies existieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die spezifische Untersuchung der Regulation des humanen Insulingenpromotors hochsensitiv in primären humanen ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen möglich ist. Dazu wurde ein Vektor kloniert, der das SEAP (secreted alkaline phosphatase)-Reportergen unter der Kontrolle des -336 bp langen humanen Insulingenpromotors enthält. Im Laufe verschiedener Transfektionsexperimente mit dem Vektor p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (Positivkontrolle) und pSEAP2-Basic (Negativkontrolle) sowohl in INS-1-ß-Zellen, in beta-TC3-Zellen als auch in primären humanen ß-Zellen, zeigten sich in den luminometrisch bestimmten SEAP-Aktivitäten, die als Maß für die Aktivität des humanen Insulingenpromotors dienen, deutliche Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der einzelnen Vektoren. Dieses System eignet sich also ausgezeichnet für die hochsensitive Analyse der Insulingenpromotoraktiviät. Zur detaillierteren Analyse wurden 5’-Deletionskonstrukte des Vektors p-336hInsP-SEAP konstruiert und damit INS-1- und beta-TC3-Zellen transient transfiziert. In beiden Zelllinien wurden Experimente bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen durchgeführt, um daraus Rückschlüsse auf die Glukoseresponsivität des humanen Insulingenpromotors ziehen zu können. Dabei zeigte der humane Insulingenpromotor die aus Versuchen mit dem RattenInsulingenpromotor 1 erwartete Glukoseresponsivität. Allerdings ließ sich keine Abnahme der transkriptionellen Aktivität des Promotors bei Abnahme der Länge der Konstrukte beobachten. Unter Verwendung von Effectene® als Transfektionsreagenz eignet sich das SEAP-System zur Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in primären insulinproduzierenden Zellen aus dem menschlichen Pankreas. N2 - Insulin biosynthesis in pancreatic beta-cells is primarily regulated at the transcriptional level by the activity of the insulin promoter. Due to the lack of human pancreatic beta-cell lines, detailed analysis of the regulation of the human insulin promoter was restricted in the past to heterologous rat, mouse and hamster pancreatic beta-cell lines, although it is known, that substantial differences exist in transcriptional regulation of genes in different species. Here the development of a method for specific investigation of the regulation of the human insulin promoter in primary human pancreatic beta-cells in isolated pancreatic islets from human donor organs is described. A vector was constructed, that expresses secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a reporter gene under the control of -336 base pairs of the human insulin promoter. Doing different transfection experiments using the vectors p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (positive control) and pSEAP2-Basic (negative control) in INS1-beta-cells, beta-TC3-cells and also in primary human pancreatic beta-cells, distinct differences between the activity of the several vectors were shown through SEAP activity monitored by a fluorescent assay in the culture supernatant. To get more detailed information, 5’-deletions of the human insulin promoter were made and used for transfection of INS1- and beta-TC3-cells. It was possible to demonstrate glucose dependent activation of the human insulin promoter in both cell-lines. Using Effectene® as transfection reagent it is possible to analyse the regulation of the human insulin promoter activity in primary human pancreatic beta-cells. This will help to elucidate the molecular mechanisms of insulin biosynthesis in the human endocrine pancreas in physiology and diabetes mellitus. KW - Insulin KW - Transfektion KW - B-Zelle KW - Bauchspeicheldrüse KW - Glucose KW - Diabetes mellitus KW - insulin KW - transfection KW - beta-cell KW - pancreas KW - glucose KW - diabetes mellitus Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36407 ER - TY - THES A1 - Telkamp, Myriam T1 - Untersuchung der funktionellen Interaktion zwischen der sarkolemmalen Calcium-ATPase und der neuronalen NO-Synthase T1 - Research on the functionel interaction between the sarcolemmal calcium-ATPase and the neuronal no-synthase N2 - Die Plasmamembrancalcium-ATPase (PMCA) konnte als Interaktionspartner und Inhibitor der neuronalen NO-Synthase (nNOS) in Kardiomyozyten identifiziert werden. PMCA und nNO-Synthase kommen in Caveolae von Kardiomyocyten vor. Humane PMCA4b überexprimierende Rattenherzen zeigen ex vivo eine signifikant höhere cGMP-Konzentration als wildtypische Rattenherzen. Das Ergebnis kann in mit PMCA4b und nNOS transfizierten wildtypischen und PMCA4b-überexprimierenden Kardiomyozyten bestätigt werden. Je höher die PMCA-Konzentration während der Transfektion ist, desto niedriger wird die Induktion von cGMP bei gleichbleibender nNOS-Transfektionskonzentration. Auffällig sind die absolut höheren Werte bei einer deutlich niedrigeren x-fachen Induktion von cGMP in PMCA4b-überexprimierenden Zellen. Dies deutet auf eine Anpassungsreaktion der transgenen Kardiomyozyten auf den inhibitorischen Effekt der PMCA auf die neuronale NO-Synthase. N2 - In cardiomyocytes the plasma membrane calcium/calmodulin-dependent calcium-ATPase (PMCA) interacts with the neuronal NO-synthase (nNOS) as a downregulator. PMCA and nNOS are localized to caveolae in cardiomyocytes. Human PMCA4b overexpressing rathearts show a significant higher concentration of cGMP than wildtyp hearts. The result was proved in cardiomyocytes transfected with PMCA4b and nNOS expression constructs. Increasing PMCA4b expression reduced nNOS-dependent cGMP dramatically in a dose-dependent manner. The results show that PMCA4b overexpressing cardiomyocytes are producing more cGMP than wildtyp cells. On the other hand is the induction of cGMP in PMCA4b overexpressing cardiomyocytes much lower than in wildtyp cells. These results indicate that an adaptation of the PMCA4b overexpressing cardiomyocytes concerning the downregulation of neuronal NO-synthase takes place. KW - PMCA KW - NO-Synthase KW - Kardiomyozyten KW - cGMP KW - Transfektion KW - PMCA KW - NO-Synthase KW - cardiomyocyte KW - cGMP KW - transfection Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5386 ER -