TY - THES A1 - Schwab, Steffen T1 - Die Rolle regulatorischer T-Zellen bei der Masernviruspathogenese T1 - The role of regulatory T-cells in measles virus pathogenesis N2 - Tregs dienen zur Aufrechterhaltung der Balance im Immunsystem. Die Infektion, Aktivierung oder Induktion von Tregs durch Pathogene kann diese Balance empfindlich stören, eine Immunsuppression zur Folge haben und zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Persistenzen beitragen. Das MV verfügt nicht nur über vielfältige Mechanismen der Immunsuppression, während einer MV-Infektion herrschen zudem Bedingungen vor, welche die Zahl und Aktivität von Tregs beeinflussen könnten. Aufgrund der Expression von Reifungsmarkern auf Trn ist zudem eine präferenzielle Infektion dieser Zellpopulation denkbar. MV-Infektionen können sowohl die akute MV-Enzephalitis, eine Autoimmunerkrankung, nach sich ziehen, als auch die Persistenz SSPE ausbilden. Ob diese Komplikationen mit spezifischen Aberrationen in der Menge und Aktivität von Tregs im Zusammenhang stehen, war bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auf unstimulierten Trn der Reifungsmarker und MV-Rezeptor CD150 exprimiert wird und es in Folge dessen in vitro zu einer präferentiellen nicht produktiven Infektion und Depletion von Trn kommt. Ex vivo ließ sich ein deutlicher Depletionseffekt während der frühen akuten MV-Enzephalitis nachweisen, der nach Vaczinierung eines gesunden Probanden und Challenge eines immunisierten Affen nicht auftrat. Ob dieser Depletionseffekt ursächlich für die Enzephalitis ist, oder es sich um einen Begleiteffekt handelt ließe sich an Modellorganismen durch mitogene Manipulation der Trn während einer MV-Infektion untersuchen. Auch bei SSPE kann es zu einer Depletion von Trn kommen, dies scheint jedoch nicht mit der Progression dieser Erkrankung im Zusammenhang zu stehen. Wahrscheinlich ist dagegen ein Zusammenhang mit der Induktion von Tregs. In MV-stimulierten Proben von SSPE-Patienten wurde im Mittel signifikant mehr IL-10 exprimiert als in den Kontrollen. In Proben seropositiver gesunder Spender wurde IL-10 in den ersten Stunden nach MV-Stimulation fast ausschließlich von induzierten Tregs exprimiert. Weitere Versuche sind nötig, um die Evidenz zu steigern und zu ermitteln, ob auch in Patientenproben die frühe IL-10 Expression nach MV-Stimulation von induzierten Tregs dominiert wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sowohl bei der MV-Enzephalitis als auch bei SSPE zu signifikanten Wechselwirkungen mit Tregs kommt. Ob sich eine MV-Enzephalitis auch ohne Depletion von Trn ausbilden kann und ob die Ausbildung von SSPE erhöhte IL-10 Expression voraussetzt, werden weitere Untersuchungen ergründen müssen. N2 - Treg are supposed to keep the balance throughout the immune system. Infection, activation and induction of Treg by pathogens can interrupt with this balance. Immunosuppression autoimmunity and viral persistence can result from this interference. MV does not only cause immunosuppression during infection by multifaceted mechanisms, but also effects circumstances known to interfere with the frequency and activity of Treg. Due to the expression of maturity markers on the surface of Trn a preferential infection of this cell population by MV seems possible. MV-infection can involve both, acute MV-encephalitis, an autoimmune disease, and the virus persistence SSPE. It was not investigated until now, if thous complications are associated to specific aberrations in the frequency and activity of Treg. In this paper it was demonstrated that CD150, which is both a maturity marker and a MV-receptor, is expressed on unstimulated Trn. Due to this expression the Trn are infected preferentially and non productively in vitro leading to apoptosis. Ex vivo a noticeable depletion effect was detected during the early acute MV-encephalitis. This effect did not accure after vaccination of a healthy proband, and the challenge of an immunised monkey. Mitogenic manipulation of Trn in model organisms during MV-infection could give advice, if this depletion effect is causal to MV-Encephalitis or rather a concomitant effect. Depletion of Trn can also arise in the presence of SSPE, but this seems not to interfere with the progression of disease. By contrast there is presumable an interrelation of SSPE with the induction of Tregs. In MV-stimulated probes from SSPE-patients the median IL-10 expression was significantly higher than in controls. Probes from seropositive healthy donators were used to identify the IL-10 expressing cells. During the first hours after MV-stimulation IL-10 was mainly expressed by induced Treg. Subsequent investigations are necessary to enhance the evidence and to determine if induced Treg also dominate the early IL-10 expression after MV-stimulation in patient probes. To give a resume you could claim that there are significant interrelations between MV-encephalitis respectively SSPE and Treg. If a depletion of Trn is necessary for the development of MV-encephalitis and if increased levels of IL-10 expression are required for the formation of SSPE has to be examined in further experiments. KW - Masern KW - T-Lymphozyt KW - Pathogenese KW - Immunsuppression KW - Inhibition KW - Encephalitis KW - Interleukin 2 KW - Interleukin 10 KW - Antigen CD25 KW - Persistenz KW - FoxP3 KW - induzierte regulatorische T-Zellen KW - natürliche regulatorische T-Zellen KW - SSPE KW - FoxP3 KW - SSPE KW - regulatory T-cells KW - immunsuppression KW - encephalitis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72979 ER - TY - THES A1 - Zinke, Michael Benedikt T1 - Hemmung der Masernvirusreplikation durch RNA-Interferenz T1 - Inhibition of Measles Virus replication by RNA interference N2 - Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. Ätiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich während des Krankheitsverlaufes eine ausgeprägte Immunantwort des natürlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt führt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiemöglichkeit diesbezüglich könnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen für einen möglichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgewählt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgewählt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden für weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgewählten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine äußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und führten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die Fähigkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung“ stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird. N2 - Subacute sclerosing panencephalitis is a demyelinating disease of the CNS caused by a persistent infection of Measles Virus (MV) of neurons and glial cells. Up to the present day there is no specific therapy available and in spite of a distinct innate and adaptive immune response, SSPE leads inevitably to death. Options in therapy could be the effects of RNA-Interference (RNAi). In order to select effective sequences for a possible gene knockdown, we established a plasmid-based test system expressing the mRNA of the fluorescence protein DsRed2 fused with mRNA sequences of single viral genes to which certain siRNAs were directed. siRNA sequences were expressed as short hairpin RNA (shRNA) from a lentiviral vector additionally expressing enhanced green fluorescent protein (eGFP) as an indicator. Evaluation by flow cytometry of the dual-color system (DsRed2 and eGFP) allowed us to find optimal shRNA sequences, chosed by a decrease of red fluorescing cells. Using the most effective shRNA constructs, we transduced persistently infected human NT2 cells expressing virus-encoded HcRed (piNT2-HcRed) as an indicator of infection. shRNAs against N, P, and L mRNAs of MV led to a reduction of the infection below detectable levels in a high percentage of transduced piNT2-HcRed cells within 1 week. The fraction of virus-negative cells in these cultures remained constant over at least 3 weeks posttransduction in the presence of a fusion-inhibiting peptide (Z-Phe-Phe-Gly), preventing the cell fusion of potentially cured cells with persistently infected cells. Transduced piNT2 cells that lost HcRed did not fuse or showed syncytial formations with underlying Vero cells, indicating that these cells do not express viral proteins any more and are “cured.” This demonstrates in tissue culture that NT2 cells persistently infected with MV can be cured by the transduction of lentiviral vectors mediating the long-lasting expression of anti-MV shRNA. KW - RNS-Interferenz KW - Masern KW - Masernvirus KW - Masernvirus KW - Masern KW - RNA-Interferenz KW - RNAi KW - SSPE KW - Measlesvirus KW - Measles KW - RNA interference KW - RNAi KW - SSPE Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83933 ER -