TY - THES A1 - Fröschel, Christian T1 - Genomweite Analyse der zellschichtspezifischen Expression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit pathogenen und mutualistischen Mikroorganismen T1 - Genome-wide analysis of cell-type specific expressed genes in the Arabidopsis-root after inoculation with pathogenic and mutualistic microorganisms N2 - Obwohl Pflanzenwurzeln mit einer Vielzahl von Pathogenen in Kontakt kommen, sind induzierbare Abwehrreaktionen der Wurzel bisher kaum beschrieben. Aufgrund der konzentrischen Zellschicht-Organisation der Wurzel wird angenommen, dass bei einer Immunantwort in jeder Zellschicht ein spezifisches genetisches Programm aktiviert wird. Eine Überprüfung dieser Hypothese war bisher wegen methodischen Limitierungen nicht möglich. Die zellschichtspezifische Expression Epitop-markierter ribosomaler Proteine erlaubt eine Affinitätsaufreinigung von Ribosomen und der assoziierten mRNA. Diese Methodik, als TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) bezeichnet, ermöglicht die Analyse des Translatoms und wurde dahingehend optimiert, pflanzliche Antworten auf Befall durch bodenbürtige Mikroorganismen in Rhizodermis, Cortex, Endodermis sowie Zentralzylinder spezifisch zu lokalisieren. Die Genexpression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit drei Bodenorganismen mit unterschiedlichen Lebensweisen wurde vergleichend betrachtet: Piriformospora indica kann als mutualistischer Pilz pflanzliches Wachstum und Erträge positiv beeinflussen, wohingegen der vaskuläre Pilz Verticillium longisporum für erhebliche Verluste im Rapsanbau verantwortlich ist und der hemibiotrophe Oomycet Phytophthora parasitica ein breites Spektrum an Kulturpflanzen befällt und Ernten zerstört. Für die Interaktionsstudien zwischen Arabidopsis und den Mikroorganismen während ihrer biotrophen Lebensphase wurden sterile in vitro-Infektionssysteme etabliert und mittels TRAP und anschließender RNA-Sequenzierung eine zellschichtspezifische, genomweite Translatomanalyse durchgeführt (Inf-TRAP-Seq). Dabei zeigten sich massive Unterschiede in der differentiellen Genexpression zwischen den Zellschichten, was die Hypothese der zellschichtspezifischen Antworten unterstützt. Die Antworten nach Inokulation mit pathogenen bzw. mutualistischen Mikroorganismen unterschieden sich ebenfalls deutlich, was durch die ungleichen Lebensweisen begründbar ist. Durch die Inf-TRAP-Seq Methodik konnte z.B. im Zentralzylinder der Pathogen-infizierten Wurzeln eine expressionelle Repression von positiven Regulatoren des Zellzyklus nachgewiesen werden, dagegen in den mit P. indica besiedelten Wurzeln nicht. Dies korrelierte mit einer Pathogen-induzierten Inhibition des Wurzelwachstums, welche nicht nach Inokulation mit P. indica zu beobachten war. Obwohl keines der drei Mikroorganismen in der Lage ist, den Zentralzylinder direkt zu penetrieren, konnte hier eine differentielle Genexpression detektiert werden. Demzufolge ist ein Signalaustausch zu postulieren, über den äußere und innere Zellschichten miteinander kommunizieren. In der Endodermis konnten Genexpressionsmuster identifiziert werden, die zu einer Verstärkung der Barriere-Funktionen dieser Zellschicht führen. So könnte etwa durch Lignifizierungsprozesse die Ausbreitung der Mikroorganismen begrenzt werden. Alle drei Mikroorganismen lösten besonders im Cortex die Induktion von Genen für die Biosynthese Trp-abhängiger, antimikrobieller Sekundärmetaboliten aus. Die biologische Relevanz dieser Verteilungen kann nun geklärt werden. Zusammenfassend konnten in dieser Dissertation erstmals die durch Mikroorganismen hervorgerufenen zellschichtspezifischen Antworten der pflanzlichen Wurzel aufgelöst werden. Vergleichende bioinformatische Analyse dieses umfangreichen Datensatzes ermöglicht nun, gezielt testbare Hypothesen zu generieren. Ein Verständnis der zellschichtspezifischen Abwehrmaßnahmen der Wurzel ist essentiell für die Entwicklung neuer Strategien zur Ertragssteigerung und zum Schutz von Nutzpflanzen gegen Pathogene in der Landwirtschaft. N2 - Although plant roots are surrounded by a plethora of microorganisms, their interactions are poorly characterized on a molecular level. Due to the concentric organization of the root cell-layers, it is anticipated that these layers contribute to pathogen defense by providing specific genetically defined programs, which build up barriers to restrict infection. Because of methodical limitations, this theory was not confirmed, yet. Immunoprecipitation of cell-layer specific expressed epitope-tagged ribosomes allows an isolation of ribosome/mRNA complexes that subsequently can be analyzed. This approach is called “Translating Ribosome Affinity Purification” (TRAP). It was optimized to identify cell-layer specific induced defenses and to be combined with a system to inoculate plant roots directly with soil-born microorganisms. Hence, this method enables molecular dissection of infected Arabidopsis-roots to unravel expression patterns found in rhizodermis, cortex, endodermis and central cylinder, respectively. Comparative studies were performed with three species of microorganisms having different life-styles: On the one hand the beneficial fungus Piriformospora indica, that can promote plant growth and crop yield and on the other hand two pathogens with the vascular fungus Verticillium longisporum, causing damage in oilseed rape production and the hemibiotrophic Oomycet Phytophthora parasitica, which causes plant damage on many crop plants. After performing TRAP with infected roots, the cell-type specific mRNA was analyzed via RNA-Sequencing resulting in a genome-wide impression of differentially expressed genes (Inf-TRAP-Seq). Massive differences occurred among the cell-layers approving the theory of cell-type specific immune responses. Moreover the defense responses varied according to inoculation with pathogenic or beneficial microorganisms probably due to their life-style. For example by using the newly established Inf-TRAP-Seq approach it was shown that positive regulators of cell proliferation were expressionally repressed in central cylinder of pathogen-infected roots but not in P. indica colonized roots. This correlates with the observation that root growth is suppressed after inoculation with pathogens but not after inoculation with P. indica. Although none of the three microorganisms is able to penetrate the central cylinder, differentially expressed genes were detected in this layer suggesting an exchange of signals to enable communication between inner and outer layers. Expression patterns were identified in the endodermis, that could lead to reinforcement of barrier functions of this cell-layer for example by lignification-processes. By this means the propagation of the microorganisms is restricted. All three microorganisms elicited induction of genes involved in biosynthesis of Trp-derived secondary metabolites, especially in the cortex. Now the biological relevance of these distributions can be investigated additionally. Hence, within this thesis for the first time a cell-type specific resolution was obtained regarding defense responses in the Arabidopsis-root triggered by microorganisms. A huge dataset was generated. This can be analyzed extensively by bioinformatics and its applications to set up new hypotheses, which can be tested by further approaches. An understanding of cell-type defined root defense responses is essential to facilitate new strategies for protecting crop plants against pathogens and to increase crop yield in agriculture. KW - Schmalwand KW - Wurzel KW - Phytophthora KW - Piriformospora indica KW - Verticillium KW - Wurzelzellschichten KW - Zellschichtspezifische Expression KW - Zentralzylinder KW - Cortex KW - Rhizodermis KW - Endodermis KW - cell-type specific KW - Inf-TRAP-Seq Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146439 ER - TY - THES A1 - Ferber, Elena T1 - Transkriptionelle, metabolische und physiologische Anpassung nach Selbstintoxikation mit reaktiven Sekundärstoffen: die Glukosinolat-Bombe in Arabidopsis thaliana T1 - Transcriptional, metabolic and physiological adaptation after self-intoxication with reactive secondary substances: the glucosinolate bomb in Arabidopsis thaliana N2 - In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung. Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein. Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar. N2 - In Brassicaceae, unreactive glucosinolates are hydrolyzed by the enzyme myrosinase during tissue destruction. Reactive substances such as isothiocyanates (ITCs) are formed. Since this reaction takes place very quickly, it is also called mustard oil bomb. In Arabidopsis thaliana, after wounding and pathogen infection, a massive accumulation of the ITC Sulforaphan (SF) occurs, which is a reactive electophilic species (RES). The group of RES also includes some oxylipins with a α,β-unsaturated carbonyl group such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) or phytoprotane A1 (PPA1). The ability to covalently modify peptides and proteins is considered essential for the toxic and gene inducing properties of RES. In addition to their reactivity, lipophilia also plays a role in the ability to diffuse across membranes and bind unspecifically to proteins. The transcriptome analyses performed on Arabidopsis-seedlings with sub-toxic concentrations of SF, benzylisothiocyanate (BITC) and oxylipin prostaglandin A1 (PGA1) showed that structurally very different RES induce a common set of 55 genes. Among the induced genes were several heat shock, stress associated and detoxification genes. These observations suggest that activation is via pattern-specific recognition of RES. As a possible mechanism of RES-mediated gene induction, regulation by alteration of the cellular redox potential as result of covalent modification of GSH by RES is discussed. However, the study of GSH levels and redox potential after treatment with sub-toxic RES concentrations in Arabidopsis-seedlings showed no change under the tested conditions. In addition to the recognition and signal transduction mechanism for RES, the biological significance of RES for the mediation of stress tolerance is still largely unclear. By studying the gene expression of Arabidopsis-plants after wounding, it was shown that wound induced accumulation of SF led to the induction of some genes of heat shock response (HSR) in the wild type, but not in the myrosinase-deficient tgg1tgg2-mutant. Also in transcriptome analysis a strong induction of heat-responsive genes could be observed after RES administration, whose regulation is mediated by the master regulator of the heatshock-TF A1 (HSFA1). In particular, the induction of HSPs, which act as chaperones and can thus protect thiol groups of proteins from modification, presumably have protective properties for the cells during chemical intoxication. In fact, under the conditions tested, the hsfa1a,b,d,e-mutants were more sensitive to ITCs than the wild type. The ability to form HSR seems to play an important role in chemical intoxication in Arabidopsis. Pretreatment with RES such as SF, BITC or the HSP90 inhibitor radicicol in Arabidopsis-seedlings could mediate a protective effect against chemical intoxication. However, this was not done after treatment with moderate heat (two hours, 37 °C). Thus, HSR alone does not seem to be sufficient to provide effective protection against BITC intoxication. As a metabolic response of Arabidopsis-seedlings to intoxication with RES, a concentration-dependent reduction of the maximum quantum yield at the photosystem II (PSII), as well as an accumulation of TAG species could be observed. This metabolic reaction is already described in the literature as protection against heat stress. The significance of TAG accumulation after chemical stress in the form of ITC intoxication is still unclear. KW - Ackerschmalwand KW - Glucosinolate KW - Isothiocyanate KW - reaktive elektrophile Spezies KW - Sulforaphan KW - Schmalwand Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185116 ER -