TY - THES A1 - Gromova, Kira V. T1 - Visualization of the Smad direct signaling response to Bone Morphogenetic Protein 4 activation with FRET-based biosensors T1 - Visualisierung der Smad-vermittelten Signaltransduktion nach Aktivierung mit "Bone Morphogenetic Protein" 4 mittels FRET-basierter Biosensoren N2 - The Transforming Growth Factor (TGF) superfamily of cytokines and their serine/threonine kinase receptors play an important role in the regulation of cell division, differentiation, adhesion, migration, organization, and death. Smad proteins are the major intracellular signal transducers for the TGF receptor superfamily that mediate the signal from the membrane into the nucleus. Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-4) is a representative of the TGF superfamily, which regulates the formation of teeth, limbs and bone, and also plays a role in fracture repair. Binding of BMP-4 to its receptor stimulates phosphorylation of Smad1, which subsequently recruits Smad4. A hetero-oligomeric complex consisting of Smad1 and Smad4 then translocates into the nucleus and regulates transcription of target genes by interacting with transcription factors. Although the individual steps of the signaling cascade from the receptor to the nucleus have been identified, the exact kinetics and the rate limiting step(s) have remained elusive. Standard biochemical techniques are not suitable for resolving these issues, as they do not offer sufficiently high sensitivity and temporal resolution. In this study, advanced optical techniques were used for direct visualization of Smad signaling in live mammalian cells. Novel fluorescent biosensors were developed by fusing cyan and yellow fluorescent proteins to the signaling molecules Smad1 and Smad4. By measuring Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between the two fluorescent proteins, the kinetics of BMP/Smad signaling was unraveled. A rate-limiting delay of 2 - 5 minutes occurred between BMP receptor stimulation and Smad1 activation. A similar delay was observed in the complex formation between Smad1 and Smad4. Further experimentation indicated that the delay is dependent on the Mad homology 1 (MH1) domain of Smad1. These results give new insights into the dynamics of the BMP receptor – Smad1/4 signaling process and provide a new tool for studying Smads and for testing inhibitory drugs. N2 - Die Transforming Growth Factor" (TGF)-Superfamilie der Cytokine und ihrer Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Zellteilung, -differenzierung, -adhäsion, -migration, -organisation, und beim Zelltod. Die Smad-Proteine sind die wichtigsten intrazellulären Signalüberträger für die TGF-Rezeptor-Familie, da sie das Signal von der Zellmembran zum Kern übermitteln. Das ,,Bone Morphogenetic Protein4" (BMP-4) ist ein Vertreter der TGF-Familie, der die Bildung von Zähnen, Gliedmaßen und Knochen reguliert und darüber hinaus eine Rolle bei der Frakturheilung spielt. Das Binden von BMP-4 an seinen Rezeptor stimuliert die Phosphorylierung von Smad1, welches in der Folge Smad4 rekrutiert. Ein hetero-oligomerer Komplex bestehend aus Smad1 und Smad4 verlagert sich dann in den Zellkern, wo er durch Interaktion mit Transkriptionsfaktoren die Transkription von Zielgenen reguliert. Obwohl die einzelnen Schritte der Signalkaskade vom Rezeptor bis in den Zellkern bereits identifiziert wurden, blieben die Kinetik und die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte bisher unbekannt. Gängige biochemische Methoden eignen sich nicht um diese Fragen zu lösen, da sie nicht über ausreichende Empfindlichkeit und zeitliches Auflösungsvermögen verfügen. In der vorliegenden Arbeit wurden hochentwickelte optische Techniken angewandt, um die Smad-vermittelte Signaltransduktion direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Neue fluoreszierende Biosensoren wurden konstruiert, indem gelb- und cyan-fluoreszierende Proteine mit den Signalmoleküle Smad1 und Smad4 fusioniert wurden. Durch Messung des "Fluorescent Resonance Energy Transfer" (FRET) zwischen den zwei fluoreszierenden Proteinen konnte die Kinetik der BMP-Smad-Signalkaskade bestimmt werden. Zwischen der Stimulation des Rezeptors und der Aktivierung von Smad1 trat eine geschwindigkeitsbegrenzende Verzögerung von 2-5 Minuten auf. Eine ähnliche Verzögerung wurde bei der Bildung des Komplexes aus Smad1 und Smad4 beobachtet. Weitere Experimente zeigten, dass die Verzögerung von der Mad-Homologie-Domäne 1 (MH1) von Smad1 abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben neue Einblicke in die Dynamik der BMP-Rezeptor-Smad1/4 Signaltransduktion und stellen neue Werkzeuge zur Untersuchung von Smads und zur Austestung inhibitorischer Wirkstoffe zur Verfügung. KW - FRET KW - Mikroskopie KW - Signaltransduktion KW - Smad KW - BMP KW - FRET KW - microscopy KW - signaling KW - Smad KW - bone morphogenetic protein KW - fluorescent protein Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25855 ER - TY - THES A1 - Wawrowsky, Kolja Alexander T1 - Analysis and Visualization in Multidimensional Microscopy T1 - Analyse und Visualisierung in der multidimensionalen Mikroskopie N2 - The live sciences currently undergo a paradigm shift to computer aided discoveries. Discoveries in the live sciences were historically made by either direct observation or as a result of chemical assays. Today we see a growing shift toward computer aided analysis and visualization. This gradual process happens in microscopy. Multidimensional laser scanning microscopy can acquire very complex multichannel data from fixed or live specimen. New probes such as visible fluorescent proteins let us observe the expression of genes and track protein localization. Ion sensitive dyes change intensity with the concentration of ions in the cell. The laser scanning confocal allows us to record these processes in three dimensions over time. This work demonstrates the application of software analysis to multidimensional microscopy data. We introduce methods for volume investigation, ion flux analysis and molecular modeling. The visualization methods are based on a multidimensional data model to accommodate complex datasets. The software uses vector processing and multiple processors to accelerate volume rendering and achieve interactive rendering. The algorithms are based on human visual perception and allow the observer a wide range of mixed render modes. The software was used to reconstruct the pituitary development in zebrafish and observe the degeneration of neurons after injury in a mouse model. Calicum indicator dyes have long been used to study calcium fluxes. We optimized the imaging method to minimize impact on the cell. Live cells were imaged continuously for 45 minutes and subjected to increasing does of a drug. We correlated the amplitude of calcium oscillations to increasing doses of a drug and obtain single cell dose response curves. Because this method is very sensitive and measures single cell responses it has potential in drug discovery and characterization. Microtubules form a dynamic cytoskeleton, which is responsible for cell shape, intracellular transport and has an integral role in mitosis. A hallmark of microtubule organization is lateral interactions. Microtubules are bundles by proteins into dense structures. To estimate the contribution of this bundling process, we created a fractal model of microtubule organization. This model demonstrates that morphology of complex microtubule arrays can be explained by bundling alone. In summary we showed that advances in software for visualization, data analysis and modeling lead to new discoveries. N2 - Die biologische Forschung befindet sich in einem Paradigmenwandel, in dem Endeckungen immer mehr von Computeranalyse ermöglicht werden. Entdeckungen in der biologischen Forschung wurden historisch gesehen durch direkte Beobachtung and mit Hilfe chemischer Analysemethoden gemacht. Heute sehen wir einen wachsenden Trend zur computerunterstützten Analyse und Visualisierung. Dieser graduelle Umschwung spielt sich auch in der Mikroskopie ab. Multidimensionale Laser Scanning Mikroskopie kann sehr komplexe Multikanalbilder von fixierten oder lebenden Präparaten aufnehmen. Neue Methoden (wie z.B. fluoreszierende Proteine) erlauben es, Genexpression und Proteinlokalisierung direkt sichtbar zu machen. Ionensensitive Farbstoffe ändern ihre Helligkeit mit der Konzentration der Ionen in der Zelle. Die konfokale Mikroskopie erlaubt es, diese Änderungen dreidimensional über die Zeit aufzunehmen. Die hier vorgestellte Arbeit demonstriert die Anwendung speziell entwickelter Software für die Analyse multidimensionaler Daten. Die hierbei entwickelten Methoden wurden für Volumendarstellung, Ionenfluxanalyse und zur molekularen Modellierung eingesetzt. Die Visualisierungsmethoden basieren auf einem multidimensionalen Datenmodel, um auch komplexe Daten verarbeiten zu können. Die Software benutzt Vektorverarbeitung und Multiprozessorunterstützung um Volumendarstellung schneller und interaktiv zu machen. Die Algorithmen beruhen auf Erkenntnissen der Wahrnehmungsforschung und erlauben es dem Anwender, eine Reihe von verschiedenen Darstellungsmodi zu kombinieren. Die Software wurde erstmals verwendet, um einerseits die Entwicklung der Hypophyse im Zebrafisch zu rekonstruieren, und andererseits die Degenerierung von Neuronen im Mausmodell bildlich zu verfolgen. Kalziumfarbstoffe wurden schon länger zum Studium von Kalziumoszillationen in Zellen eingesetzt. Wir optimierten die Bildaufnahmemethode um Schädigungen der Zelle zu minimieren. Zellen wurden kontinuierlich in 45 Minuten Zeitintervallen aufgenommen und dabei wachsenden Dosen der zu untersuchenden Substanz ausgesetzt. Durch Korrelation von Dosis und Oszillationsamplitude konnten pharmakologische Wirkungskurven für jede einzelne Zelle ermittelt werden. Diese Methode hat wegen der hohen Sensitivität und Auflösung bis zur einzelnen Zelle Potential für pharmakologische Untersuchungen. Mikrotubuli formen ein dynamisches Zytoskelett, das für Zellform und intrazellularen Transport zuständig ist und eine integrale Rolle bei der Mitose spielt. Eine besondere Eigenschaft der Mikrotubuli ist die laterale Interaktion. Mikrotubuli werden von Motorproteinen zu dichten Strukturen gebündelt. Um den möglichen Einfluß dieses Vorgangs auf die Organisation der Mikotubuli zu testen, wurde ein fraktales Model erstellt. Dieses Modell demonstriert, daß die komplexe Organisation der Mikrotubuli in einigen Fällen allein mit dem Bündelungsprozess erklärt werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit demonstriert werden, daß der Einsatz speziell entwickelter Software für Visualisierung, Datenanalyse und Modellierung zu neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen führen kann. KW - Konfokale Mikroskopie KW - Laser-Rastermikroskopie KW - Leica-Mikroskopie und -Systeme GmbH KW - Mikroskopie KW - Visualisierung KW - Bildverarbeitung KW - Mikrotubuli KW - Visualization KW - Image Processing KW - Microtubules Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23867 ER - TY - THES A1 - Angermeier, Hilde Gabriele T1 - Molecular and ecological investigations of Caribbean sponge diseases T1 - Molekulare und ökologische Untersuchungen zu Krankheiten Karibischer Meeresschwämme N2 - Während gewinnbringende Assoziationen von Schwämmen mit Mikroorganismen in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit erhalten haben, wurde weit weniger in die Interaktion von Schwämmen mit möglicherweise pathogenen Mikroben investiert. Somit war es das Ziel dieser Studie zwei ausgewählte Karibische Schwammkrankheiten namens „Sponge Orange Band“ und „Sponge White Patch“ mittels ökologischer und molekularer Methoden zu untersuchen. Die Sponge Orange Band (SOB) Erkrankung befällt den bedeutenden karibischen Fass-Schwamm Xestospongia muta, der zu den bakterienhaltigen (HMA) Schwämmen gezählt wird, während die Sponge White Patch (SWP) Erkrankung den häufig vorkommenden Seil-Schwamm Amphimedon compressa betrifft, der zu den bakterienarmen (LMA) Schwämmen gehört. Für beide Karibischen Schwammkrankheiten konnte ich einen Krankheitsverlauf beschreiben, der mit massiver Gewebszerstörung und dem Verlust charakteristischer mikrobieller Signaturen einhergeht. Obwohl ich zeigen konnte, dass zusätzliche Bakterienarten die gebleichten Schwammbereiche kolonisieren, lieferten meine Infektionsversuche in beiden Fällen keinen Beweis für die Beteiligung eines mikrobiellen Pathogens als Krankheitserreger. Somit liegen die eigentlichen Auslöser der Erkrankungen Sponge Orange Band als auch Sponge White Patch noch immer im Dunkeln. N2 - While beneficial sponge-microbe associations have received much attention in recent years, less effort has been undertaken to investigate the interactions of sponges with potentially pathogenic microorganisms. Thus, the aim of this study was to examine two selected Caribbean disease conditions, termed “Sponge Orange Band” and “Sponge White Patch”, via ecological and molecular methods. Sponge Orange Band (SOB) disease affects the prominent Caribbean barrel sponge Xestospongia muta that is counted among the high-microbial-abundance (HMA) sponges, whereas Sponge White Patch (SWP) disease affects the abundant rope sponge Amphimedon compressa that belongs to the low-microbial-abundance (LMA) sponges. I have documented for both Caribbean sponge diseases a disease progression going along with massive tissue destruction as well as loss of the characteristic microbial signatures. Even though new bacteria were shown to colonize the bleached areas, the infection trials revealed in both cases no indication for the involvement of a microbial pathogen as an etiologic agent of disease leaving us still in the dark about the cause of Sponge Orange Band as well as Sponge White Patch disease. KW - Meeresschwämme KW - Pathogene Bakterien KW - Porifera KW - Schwamm KW - Bakterien KW - Cyanobakterien KW - Pathologie KW - Mikroskopie KW - Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese KW - Symbiose KW - Sponge diseases KW - Porifera KW - Bacteria KW - Cyanobacteria KW - Pathogens KW - Symbionts KW - Pathology KW - Microscopy KW - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56855 N1 - weitere Originalveröffentlichungen: Angermeier H, Glöckner V, Pawlik JR, Lindquist NL & Hentschel U (2012). Sponge white patch disease affecting the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Diseases of Aquatic Organisms 99 (2): 95-102. ER - TY - THES A1 - Zelman-Femiak, Monika T1 - Single Particle Tracking ; Membrane Receptor Dynamics T1 - Einzelpartikelverfolgung ; Dynamik der Membranrezeptoren N2 - Single-molecule microscopy is one of the decisive methodologies that allows one to clarify cellular signaling in both spatial and temporal dimentions by tracking with nanometer precision the diffusion of individual microscopic particles coupled to relevant biological molecules. Trajectory analysis not only enables determination of the mechanisms that drive and constrain the particles motion but also to reveal crucial information about the molecule interaction, mobility, stoichiometry, all existing subpopulations and unique functions of particular molecules. Efficacy of this technique depends on two problematic issues the usage of the proper fluorophore and the type of biochemical attachment of the fluorophore to a biomolecule. The goal of this study was to evolve a highly specific labeling method suitable for single molecule tracking, internalization and trafficking studies that would attain a calculable 1:1 fluorophore-to-receptor stoichiometry. A covalent attachment of quantum dots to transmembrane receptors was successfully achieved with a techinque that amalgamates acyl carrier protein (ACP) system as a comparatively small linker and coenzyme A (CoA)-functionalized quantum dots. The necessity of optimization of the quantum dot usage for more precise calculation of the membrane protein stoichiometries in larger assemblies led to the further study in which methods maximizing the number of signals and the tracking times of diverse QD types were examined. Next, the optimized techniques were applied to analyze behavior of interleukin-5 β-common chain receptor (IL-5Rβc) receptors that are endogenously expressed at low level on living differentiated eosinophil-like HL-60 cells. Obtained data disclosed that perused receptors form stable and higher order oligomers. Additionally, the mobility analysis based on increased in number (>10%) uninterrupted 1000-step trajectories revealed two patterns of confined motion. Thereupon methods were developed that allow both, determination of stoichiometries of cell surface protein complexes and the acquisition of long trajectories for mobility analysis. Sequentially, the aforementioned methods were used to scrutinize on the mobility, internalization and recycling dynamics characterization of a G protein-coupled receptor (GPCRs), the parathyroid hormone receptor (PTHR1) and several bone morphogenetic proteins (BMPs), a member of the TGF-beta superfamily of receptors. These receptors are two important representatives of two varied membrane receptor classes. BMPs activate SMAD- and non-SMAD pathways and as members of the transforming growth factor β (TGF-β) superfamily are entailed in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis, and apoptosis. For effective ligand induced and ligand independent signaling, two types of transmembrane serine/threonine kinases, BMP type I and type II receptors (BMPRI and BMPRII, respectively) are engaged. Apparently, the lateral mobility profiles of BMPRI and BMPRII receptors differ markedly, which determinate specificity of the signal. Non-SMAD signaling and subsequent osteoblastic differentiation of precursor cells particularly necessitate the confinement of the BMP type I receptor, resulting in the conclusion that receptor lateral mobility is a dominative mechanism to modulate SMAD versus non-SMAD signaling during differentiation. Confined motion was also predominantly observed in the studies devoted to, entailed in the regulation of calcium homeostasis and in bone remodeling, the parathyroid hormone receptor (PTHR1), in which stimulation with five peptide ligands, specific fragments of PTH: hPTH(1–34), hPTHrP(107–111)NH2; PTH(1–14); PTH(1–28) G1R19, bPTH(3–34), first four belonging to PTH agonist group and the last to the antagonist one, were tested in the wide concentration range on living COS-1 and AD293 cells. Next to the mobility, defining the internalization and recycling rates of the PTHR1 receptor maintained in this investigation one of the crucial questions. Internalization, in general, allows to diminish the magnitude of the receptor-mediated G protein signals (desensitization), receptor resensitization via recycling, degradation (down-regulation), and coupling to other signaling pathways (e.g. MAP kinases). Determinants of the internalization process are one of the most addressed in recent studies as key factors for clearer understanding of the process and linking it with biological responses evoked by the signal transduction. The internalization of the PTH-receptor complex occurs via the clathrin-coated pit pathway involving β-arrestin2 and is initiated through the agonist occupancy of the PTHR1 leading to activation of adenylyl cyclase (via Gs), and phosphatidylinositol-specific phospholipase Cβ (via Gq). Taken together, this work embodies complex study of the interleukin-5 β-common chain receptor (IL-5Rβc) receptors, bone morphogenetic proteins (BMPs) and the parathyroid hormone receptor with the application of single-molecule microscopy with the newly attained ACP-quantum dot labeling method and standard techniques. N2 - Die Einzelmolekül-Mikroskopie, das Verfolgen der Diffusion einzelner, mikroskopischer Partikel, welche an relevanten biologischen Molekülen gekoppelt sind, ist eine der entscheidenden Verfahren zur räumlichen und zeitlichen Quantifizierung der Zellsignalisierung und hat eine Genauigkeit im Nanometerbereich. Die so gewonnene Trajektorienanalyse ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Mechanismen, die der Bewegung der Partikel zugrunde liegen, sondern liefert auch wichtige Informationen über die molekulare Wechselwirkungen, Bewegungsfreiheit und Stöchiometrie sowie über alle existierenden Subpopulationen und besondere Funktionen der einzelnen Moleküle. Die Wirksamkeit dieser Technik hängt von der Verwendung des geeigneten Flurophors und der Art seiner biochemischen Anhaftung ab. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines hochspezifischen Markierungsverfahrens, das zur Verwendung der Einzelmolekül-Mikroskopie für Studien im Bereich Endozytose geeignet ist und gleichzeitig eine Fluorophore-Rezeptor Stöchiometrie von 1:1 erreicht. Eine kovalente Anhaftung von Quantenpunkten an Membranrezeptoren wurde erfolgreich in einer Methode realisiert, die ACP-Systeme (Engl. Acyl-Carrier-Protein) mit Koenzym A (CoA-) funktionalisierten Quantenpunkten amalgamiert. Die notwendige Optimierung der Verwendung von Quantenpunkten mit dem Ziel einer genaueren Berechnung der Stöchiometrie von Membranproteinen sehr großer Anzahl führte zu weiteren Studien. In diesem Zusammenhang wurden Methoden zur Maximierung der Signalanzahl und Beobachtungszeiten diverser Quantenpunktentypen untersucht. Im nächsten Schritt wurden die optimierten Verfahren angewendet, um das Verhalten von IL-5Rßc (Engl. Interleukin-5 ß-common chain receptor) Rezeptoren, die endogen auf niedriger Stufe auf lebende differenzierte eosinophile-ähnlichen HL-60 Zellen existieren, zu analysieren. Die gewonnenen Daten haben gezeigt, dass die Rezeptoren sich in stabilen Oligomeren hoher Ordnung bilden, was zusätzlich mit den Ergebnissen der Analyse der Mobilität, die auf einer hohen Anzahl unterbrochener 1000-Schritt Trajektorien basiert, zwei abgegrenzte Bewegungsmuster ergab. Daraufhin wurden Methoden entwickelt, die eine Bestimmung der Stöchiometrie von Zelloberflächen-Proteinkomplexen und die Erfassung umfangreicher Trajektorien zur Bewegungsanalyse ermöglichen. Im Weiteren wurden die zuvor genannten Methoden zur genauen Überprüfung der Mobilität, Endozytose und der Charakterisierung der rückläufigen Dynamik der repräsentativen Rezeptoren von zwei verschiedenen Membranrezeptoren Klassen, des Parathormon-Rezeptors (Engl. the parathyroid hormone receptor), der zu der G-Protein-gekoppelter Rezeptor Gruppe (GPCRs) gehört und der Rezeptoren der knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs) verwendet. BMPs aktivieren SMAD- und non-SMAD Signalkaskaden und als ein Bestandteil des TGF-β-Signalszstem sind sie in die Proliferation, die Differenyiation, die Chemotaxis und die Apoptose involviert. Zwei BMP Rezeptor Typen, BMP Typ I und BMP Typ II (BMPRI und BMPRII) sind nötig für die effektive Signalwirkung. Offenbar sind die Bewegungsmuster für BMPRI und BMPRII sehr unterschiedlich, was hier die Genauigkeit des Signals festlegt. Non-SMAD Kaskade und die nachfolgende Differenzierung von den Osteoblastenzellen benötigt das abgegrenzte Bewegungsmuster von BMPRI. Daraus folgert, dass die laterale Mobilität ein Hauptmechanismus in der SMAD gegen non-SMAD Signalwirkung während der Differenziation ist. Das abgegrenzte Bewegungsmuster war auch für den Parathormon Rezeptor (Engl. the parathyroid hormone receptor) (PTHR1), der in die Calcium Homeostase und den Knochenumbau involviert ist, in den Studien zu beobachten. In diesen Studien wurden fünf Peptide Ligande, spezifische Teile von dem PTH: hPTH(1–34), hPTHrP(107–111)NH2; PTH(1–14); PTH(1–28) G1R19, bPTH(3–34), von denen die ersten vier zu der Agonistengruppe und der Letzte zu der Antagonistengruppe gehören, in verschiedenen Konzentrationen mit lebenden COS-1 und AD293 Zellen verwendet. (oder aufgebracht) Eine der Hauptfragen war die Festlegung der Rate der PTHR1 Internalisierung und des Recycling in dieser Forschung. Im Allgemeinen reduziert Internalisierung die Stärke der Signale, die von den G Proteinen kommen und durch die Rezeptoren übermittelt (die Desensibilisierung) werden. Durch den Rücklauf werden die Rezeptoren wieder sensibilisiert, degradiert und können somit an anderen Signalkaskaden ankoppeln (zB. MAP-Kinase ). Die Determinanten der Internalisierung sind das Hauptthema in den aktuellen Studien, da sie der Schlüssel zum besseren Verständnis der Internalisierung und zu den nachfolgenden biologischen Antworten sind. Die Internalisierung von dem PTH Rezeptor verläuft entsprechend des Clathrin-coated Pit Weges mit der Teilnahme von β-arrestin2 und ist durch den Ligand eingeleitet, der zur Aktivierung von adenylyl cyclase (via Gs), und phosphatidylinositol-specific phospholipase Cβ (via Gq) führt. Zusammenfassend ist diese Arbeit unter Verwendung von Einzelmolekül-Mikroskopie mit der neuen ACP-Quantumpunktmethoden sowie standard Markierungsmethoden ein komplexes Studium über die IL-5Rßc Rezeptoren, die BMP Rezeptoren und den PTH Rezeptor. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Membranrezeptor KW - Dynamik KW - Einzelpartikelverfolgung KW - Dynamik von Membranrezeptoren KW - Mikroskopie KW - Single Particle Tracking KW - Membrane Receptor Dynamics KW - Microscopy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65420 ER - TY - THES A1 - Proppert, Sven Martin T1 - Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging T1 - Design, Implementierung und Charakterisierung eines Mikroskops für dreidimensionale zwei Farben superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung N2 - This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. N2 - In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt. KW - Dimension 3 KW - aberration KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - single molecule microscopy KW - 3D KW - super-resolution KW - Mikroskopie KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Aberration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905 ER - TY - THES A1 - van Eeuwijk, Judith Martina Maria T1 - Studies on thrombopoiesis and spleen tyrosine kinase-mediated signaling in platelets T1 - Untersuchungen der Thrombopoese und der spleen tyrosine kinase-vermittelten Signaltransduktion in Thrombozyten N2 - In mammals, anucleate blood platelets are constantly produced by their giant bone marrow (BM) progenitors, the megakaryocytes (MKs), which originate from hematopoietic stem cells. Megakaryopoiesis and thrombopoiesis have been studied intensively, but the exact mechanisms that control platelet generation from MKs remain poorly understood. Using multiphoton intravital microscopy (MP-IVM), thrombopoiesis and proplatelet formation were analyzed in the murine BM in real-time and in vivo, identifying an important role for several proteins, including Profilin1, TRPM7 and RhoA in thrombopoiesis. Currently, it is thought that blood cell precursors, such as MKs, migrate from the endosteal niche towards the vascular niche during maturation. In contrast to this paradigm, it was shown that MKs are homogeneously distributed within the dense BM blood vessel network, leaving no space for vessel-distant niches. By combining results from in vivo MP-IVM, in situ light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) of the intact BM as well as computational simulations, surprisingly slow MK migration, limited intervascular space and a vessel-biased MK pool were revealed, contradicting the current concept of directed MK migration during thrombopoiesis. Platelets play an essential role in hemostasis and thrombosis, but also in the pathogenesis of ischemic stroke. Ischemic stroke, which is mainly caused by thromboembolic occlusion of brain arteries, is among the leading causes of death and disability worldwide with limited treatment options. The platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI is a key player in arterial thrombosis and a critical determinant of stroke outcome, making its signaling pathway an attractive target for pharmacological intervention. The spleen tyrosine kinase (Syk) is an essential signaling mediator downstream of GPVI, but also of other platelet and immune cell receptors. In this thesis, it was demonstrated that mice lacking Syk specifically in platelets are protected from arterial thrombus formation and ischemic stroke, but display unaltered hemostasis. Furthermore, it was shown that mice treated with the novel, selective and orally bioavailable Syk inhibitor BI1002494 were protected in a model of arterial thrombosis and had smaller infarct sizes and a significantly better neurological outcome 24 h after transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO), also when BI1002494 was administered therapeutically, i.e. after ischemia. These results provide direct evidence that pharmacological Syk inhibition might become a safe therapeutic strategy. The T cell receptor  chain-associated protein kinase of 70 kDA (Zap-70) is also a spleen tyrosine kinase family member, but has a lower intrinsic activity compared to Syk and is expressed in T cells and natural killer (NK) cells, but not in platelets. Unexpectedly, arterial thrombus formation in vivo can occur independently of Syk kinase function as revealed by studies in Sykki mice, which express Zap-70 under the control of intrinsic Syk promoter elements. N2 - In Säugetieren werden kernlose Thrombozyten durch ihren riesigen Knochenmark- (KM-) Vorläuferzellen, die Megakaryozyten (MK), die von hämatopoetischen Stammzellen stammen, ständig produziert. Megakaryopoese und Thrombopoese wurden schon intensiv untersucht, aber die genauen Mechanismen, die die Thrombozytenproduktion aus MK kontrollieren, bleiben weitgehend unverstanden. Mittels Multiphotonen-Intravitalmikroskopie (MP-IVM) wurden Thrombopoese und Proplättchenbildung im murinen KM in Echtzeit in vivo untersucht. Dadurch wurde eine wichtige Rolle für die Proteine Profilin1, TRPM7 und RhoA in der Thrombopoese identifiziert. Derzeit wird angenommen, dass Blutzellvorläufer, wie MK, während der Reifung von der endostalen Nische in Richtung der Gefäßnische migrieren. Im Gegensatz zu diesem Paradigma wurde hier gezeigt, dass MK homogen innerhalb des dichten KM Blutgefäßnetzes verteilt sind, so dass kein Raum für Gefäß-ferne Nischen besteht. Durch Ergebnisse von in vivo MP-IVM, in situ Licht-Blatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) des intakten KM sowie Computersimulationen wurden eine überraschend langsame MK-Migration, ein begrenzter intervaskulärer Raum und eine asymmetrische MK-Verteilung gezeigt, was im Widerspruch zum derzeitig akzeptierten Konzept der gerichteten MK-Migration während der Thrombopoese steht. Die Thrombozyten spielen eine wesentliche Rolle nicht nur bei der Hämostase und Thrombose, sondern auch in der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Der ischämische Schlaganfall, der vor allem durch einen thromboembolischen Verschluss von Gehirnarterien verursacht wird, ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung weltweit und die Behandlungsmöglichkeiten sind sehr eingeschränkt. Der thrombozytäre Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP) VI ist ein wichtiger Faktor in der arteriellen Thrombose und trägt entscheidend zur Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls bei, sodass dessen Signalweg ein attraktives Ziel für pharmakologische Interventionen darstellen könnte. Die spleen tyrosine kinase (Syk) ist ein wichtiges Molekül im GPVI-Signalweg, aber auch in den Signalkaskaden von anderen Thrombozyten- und Immunzellrezeptoren. Es wurde nachgewiesen, dass Mäuse mit einer thrombozytären Syk-Defizienz, vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt sind, aber unveränderte Hämostase zeigen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit dem neuartigen, selektiven und oral bioverfügbaren Syk-Inhibitor BI1002494 behandelt wurden, geschützt sind in einem Modell der arteriellen Thrombose. Auch hatten sie kleinere Infarkte und eine deutlich bessere neurologische Funktion 24 Stunden nach der transienten Arteria cerebri media Okklusion (tMCAO), auch wenn BI1002494 therapeutisch, d.h. nach der Ischämie, verabreicht wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die pharmakologische Hemmung von Syk eine sichere therapeutische Strategie bei Schlaganfall sein könnte. Der T-Zell Rezeptor -chain-associated protein kinase of 70 kDa (Zap-70) ist auch ein spleen tyrosine kinase-Familienmitglied, hat aber eine geringere intrinsische Aktivität im Vergleich zu Syk und wird in T-Zellen und natural killer (NK) Zellen exprimiert, nicht aber in Thrombozyten. Studien in Sykki Mäusen, die unter der Kontrolle der intrinsischen Syk Promotorelemente Zap-70 exprimieren, ergaben, dass die arterielle Thrombusbildung in vivo unabhängig von der Syk-Kinasefunktion stattfinden kann. KW - Thrombose KW - Megakaryozyt KW - Thrombopoese KW - Mikroskopie KW - Hämostase KW - Thrombosis KW - Megakaryocyte KW - Hemostasis KW - Microscopy KW - Thrombopoiesis KW - Platelet KW - Ischemic stroke KW - Spleen tyrosine kinase Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142933 ER - TY - THES A1 - Chowdhury, Suvagata Roy T1 - The Role of MicroRNAs in \(Chlamydia\) Infection T1 - Die Rolle von MicroRNAs in der Chlamydien-Infektion N2 - The obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis is the causative agent of trachoma related blindness and the sexually transmitted pelvic inflammatory disease. Being an obligate intracellular pathogen, C. trachomatis has an intricate dependency on the survival of the host cell. This relationship is indispensible owing to the fact that the pathogen spends a considerable fraction of its biphasic lifecycle within a cytoplasmic vacuole inside the host cell, the so-called chlamydial inclusion. The cellular apoptotic-signalling network is governed by several finely tuned regulatory cascades composed of pro- and anti-apoptotic proteins that respond to changes in the cellular homeostasis. In order to facilitate its intracellular survival, Chlamydia has been known to inhibit the premature apoptosis of the host cell via the stabilization of several host anti-apoptotic proteins such as cIAP2 and Mcl-1. While the pro- and anti-apoptotic proteins are the major regulators of the host apoptotic signalling network, a class of the small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) has increasingly gained focus as a new level of regulatory control over apoptosis. This work investigates the changes in the host miRNA expression profile post Chlamydia infection using a high throughput miRNA deep sequencing approach. Several miRNAs previously associated with the modulation for apoptotic signalling were differentially expressed upon Chlamydia infection in human endothelial cells. Of the differentially regulated miRNAs, miR-30c-5p was of particular interest since it had been previously shown to target the tumor suppressor protein p53. Our lab and others have previously demonstrated that Chlamydia can downregulate the levels of p53 by promoting its proteasomal degradation. This work demonstrates that Chlamydia infection promotes p53 downregulation by increasing the abundance of miR-30c-5p and a successful infection cycle is hindered by a loss of miR-30c-5p. Over the last decade, dedicated research aimed towards a better understanding of apoptotic stimuli has greatly improved our grasp on the subject. While extrinsic stress, deprivation of survival signals and DNA damage are regarded as major proponents of apoptotic induction, a significant responsibility lies with the mitochondrial network of the cell. Mitochondrial function and dynamics are crucial to cell fate determination and dysregulation of either is decisive for cell survival and pathogenesis of several diseases. The ability of the mitochondrial network to perform its essential tasks that include ATP synthesis, anti-oxidant defense, and calcium homeostasis amongst numerous other processes critical to cellular equilibrium is tied closely to the fission and fusion of individual mitochondrial fragments. It is, thus, 8 unsurprising that mitochondrial dynamics is closely linked to apoptosis. In fact, many of the proteins involved regulation of mitochondrial dynamics are also involved in apoptotic signalling. The mitochondrial fission regulator, Drp1 has previously been shown to be transcriptionally regulated by p53 and is negatively affected by a miR- 30c mediated inhibition of p53. Our investigation reveals a significant alteration in the mitochondrial dynamics of Chlamydia infected cells affected by the loss of Drp1. We show that loss of Drp1 upon chlamydial infection is mediated by the miR-30c-5p induced depletion of p53 and results in a hyper-fused architecture of the mitochondrial network. While it is widely accepted that Chlamydia depends on the host cell metabolism for its intracellular growth and development, the role of mitochondria in an infected cell, particularly with respect to its dynamic nature, has not been thoroughly investigated. This work attempts to illustrate the dependence of Chlamydia on miR-30c-5p induced changes in the mitochondrial architecture and highlight the importance of these modulations for chlamydial growth and development. N2 - Das Gram-negative Humanpathogen Chlamydia trachomatis versursacht das Trachom, eine ansteckende follikuläre Bindehautentzündung, die letztlich zur Erblindung Infizierter führt, sowie sexuell übertragbare Entzündungen im Urogenitaltrakt. C. trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Bakterium mit einem biphasischen Lebenszyklus, der in einer spezialisierten Vakuole innerhalb des Wirtszellzytoplasmas durchlaufen wird, der sogenannten Chlamydien-Inklusion. C. trachomatis ist daher davon abhängig, dass die infizierte Wirtszelle überlebt, bis die Entwicklung des Erregers abgeschlossen ist und moduliert dazu das apoptotische Signalnetzwerk der Wirtszelle. Dieses besteht aus mehreren fein aufeinander abgestimmten regulatorischen Kaskaden aus pro- und anti- apoptotischen Proteinen, die normalerweise auf Veränderungen in der zellulären Homöostase reagieren und als Folge den programmierten Zelltod einleiten können. Es ist jedoch bekannt, dass Chlamydia die Apoptose der Wirtszelle durch Stabilisierung mehrerer anti-apoptotischer Wirtsproteine wie cIAP2 und Mcl-1 inhibiert. Während pro- und anti-apoptotische Proteine Hauptregulatoren des Apoptosesignalnetzwerks darstellen, wurde kürzlich eine neue Ebene der Apoptose- Regulation identifiziert, die durch kleine, nicht-kodierende microRNAs (miRNAs) gesteuert wird. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich die Veränderungen in dem miRNA Expressionsprofil von Wirtszellen nach einer Chlamydieninfektion. Mittels miRNA deep sequencing wurden dabei mehrere miRNAs identifiziert, die abhängig von der Infektion mit Chlamydia differentiell in menschlichen Endothelzellen exprimiert werden und deren Funktion mit der Modulation der Apoptose-Signalwege assoziiert sind. Dabei war miR-30c-5p von besonderem Interesse, da deren molekulares target das Tumorsuppressorprotein p53 ist. Unter anderem durch unser Labor wurde dabei bereits gezeigt, dass Chlamydia den Proteasom-vermittelten Abbau von p53 fördert und somit die Menge des Proteins in der Wirtszelle depletieren kann. In der hier vorliegenden Arbeit zeige ich darüberhinaus, dass eine Chlamydia-Infektion die p53 Mengen in den Wirtszellen senkt, indem miR-30c-5p verstärkt produziert wird, während das intrazelluläre Wachstum von C. trachomatis durch den Verlust von miR- 30c-5p inhibiert wird. Zusammen mit den apoptotischen Regulationskaskaden entscheiden auch die Integrität der Mitochondrien sowie die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks über das Schicksal der Zelle. Eine Dysregulation dieser Funktionen führt zur Einleitung des Zelltods und bildet die Grundlage der Pathogenese mehrerer Krankheiten. Zu den wesentlichen Aufgaben des mitochondrialen Netzwerkes gehören, neben zahlreichen anderen, die Synthese von ATP, die Detoxifizierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies sowie die Kalziumhomöostase. Die funktionelle Integrität des mitochondrialen Netzwerks ist dabei stark von Teilungs- und Fusionsraten mitochondrialer Fragmente abhängig und diese mitochondriale Dynamik ist wiederum eng mit der Apoptose verknüpft; so sind etwa viele Proteine, welche die mitochondriale Dynamik regulieren, auch an der apoptotischen Signalgebung beteiligt. Zum Beispiel wird die Transkription des an der Mitochondrienteilung beteiligten Proteins Drp1 durch p53 reguliert und eine miR-30c-vermittelte Inhibition von p53 senkt daher die Menge an Drp1 in der Zelle. In der hier vorliegenden Arbeit demonstriere ich die signifikante Veränderung der mitochondrialen Dynamik in menschlichen Zellen nach einer Chlamydieninfektion. Die entstehende hyperkondensierte Architektur des mitochondrialen Netzwerks ist dabei auf den Verlust von Drp1 zurückzuführen, welcher durch die miR-30c-5p- induzierte Depletion von p53 vermittelt wird. Während die Abhängigkeit des intrazellulären Wachstums von Chlamydia vom Stoffwechsel der Wirtszelle weitgegen akzeptiert ist, wurde die Rolle der Mitochondrien und die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks in infizierten Zellen bisher vernachlässigt. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal die Abhängigkeit von Chlamydia auf miR- 30c-5p induzierte Veränderungen in der mitochondrialen Architektur illustriert. KW - Chlamydia KW - MicroRNAs KW - Mitochondria KW - Microscopy KW - Chlamydienkrankheit KW - miRNS KW - Mitochondrium KW - Mikroskopie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155866 ER - TY - THES A1 - Schwedhelm, Ivo Peter T1 - A non-invasive microscopy platform for the online monitoring of hiPSC aggregation in suspension cultures in small-scale stirred tank bioreactors T1 - Entwicklung und Etablierung einer Mikroskopieplattform zur zerstörungsfreien Messung der Aggregierung von hiPSCs in kleinmaßstäbigen Bioreaktor-Suspensionskulturen N2 - The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large-scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Suspension cul- tures of hiPSCs are characterized by the self-aggregation of single cells into macroscopic cell aggre- gates that increase in size over time. The development of these free-floating aggregates is dependent on the culture vessel and thus represents a novel process parameter that is of particular interest for hiPSC suspension culture scaling. Further, aggregates surpassing a critical size are prone to spon- taneous differentiation or cell viability loss. In this regard, and, for the first time, a hiPSC-specific suspension culture unit was developed that utilizes in situ microscope imaging to monitor and to characterize hiPSC aggregation in one specific CSTR setup to a statistically significant degree while omitting the need for error-prone and time-intensive sampling. For this purpose, a small-scale CSTR system was designed and fabricated by fused deposition modeling (FDM) using an in-house 3D- printer. To provide a suitable cell culture environment for the CSTR system and in situ microscope, a custom-built incubator was constructed to accommodate all culture vessels and process control devices. Prior to manufacture, the CSTR design was characterized in silico for standard engineering parameters such as the specific power input, mixing time, and shear stress using computational fluid dynamics (CFD) simulations. The established computational model was successfully validated by comparing CFD-derived mixing time data to manual measurements. Proof for system functionality was provided in the context of long-term expansion (4 passages) of hiPSCs. Thereby, hiPSC aggregate size development was successfully tracked by in situ imaging of CSTR suspensions and subsequent automated image processing. Further, the suitability of the developed hiPSC culture unit was proven by demonstrating the preservation of CSTR-cultured hiPSC pluripotency on RNA level by qRT-PCR and PluriTest, and on protein level by flow cytometry. N2 - Die Vermehrung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) im Indus- triemaßstab wird durch skalierbare Bioprozesse in aktiv durchmischten Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) ermöglicht. Hierbei zeichnet sich das Wachstum von hiPSCs durch die charakteristische Bildung von sphäroidischen Zellaggregaten aus, deren Durchmesser sich im Laufe der Kultivierung vergrößert. Die Agglomeration von hiPSCs ist sowohl abhängig vom Grad der Durchmischung als auch vom jeweiligen Kulturgefäß, und stellt somit einen wichtigen Prozessparameter dar, welcher während der Prozessskalierung berücksichtigt werden muss. Weiterhin weisen hiPSCs in Aggregaten, welche eine kritische Größe überschreiten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, ihre Pluripotenz zu verlieren oder hinsichtlich ihrer Viabilität beeinträchtigt zu werden. Auf Grundlage dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Plattform für die Durchführung von hiPSCs-Suspensionskulturen en- twickelt, welche die zerstörungsfreie Überwachung des hiPSC-Aggregatwachstums in Echtzeit durch den Einsatz von in situ-Mikroskopie ermöglicht. Neben den eigens entworfenen Bioreaktoren, welche zum Großteil aus 3D-gedruckten Komponenten bestehen, wurde eine Peripherie in Form eines Inkubator-Prototyps entwickelt und konstruiert, welcher die Unterbringung der Bioreaktoren, der Systemkomponenten zur Erzeugung von Zellkulturbedingungen sowie einer in situ-Mikroskop- Spezialanfertigung gewährleistet. Als Ausgangspunkt der Entwicklung des CSTR Systems diente ein Strömungssimulationsmodell, welches dazu verwendet wurde, prozesstechnische Kennzahlen zu er- mitteln um das CSTR System hinsichtlich des spezifischen Leistungseintrags, der Mischzeit und der Scherbelastung zu charakterisieren. Das erstellte Simulationsmodell wurde zudem erfolgreich an- hand eines Messdatenabgleichs der Mischzeit hinsichtlich seiner Aussagekraft validiert. Des Weit- eren wurde die Funktionsfähigkeit des gesamten Systems durch Langzeitversuche belegt. Hierbei wurden hiPSCs in den entwickelten Bioreaktoren über einen Zeitraum von vier Passagen expandiert und das Aggregatwachstum mittels in situ-Mikroskopie in Kombination mit einer automatisierten Bildauswertung beschrieben. Überdies hinaus wurde die Qualität der kultivierten hiPSCs hinsichtlich ihrer Differenzierungskapazität durch den Nachweis von Pluripotenzmarkern auf RNA (qRT-PCR und PluriTest) sowie Proteinebene (Durchflusszytometrie) untersucht. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Mikroskopie KW - Suspensionskultur KW - Aggregation KW - in situ microscopy KW - bioreactor KW - hiPSC aggregation KW - Bioreaktor KW - iPSC Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192989 ER - TY - THES A1 - Götz, Ralph T1 - Super-resolution microscopy of plasma membrane receptors and intracellular pathogens T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Plasmamembran Rezeptoren und intrazellulären Pathogenen N2 - Humans tend to believe in what they can see with their own eyes. Hence, visualization methods like microscopy have always been extremely popular since their invention in the 17th century. With the advent of super-resolution microscopy, the diffraction limit of ~200 - 250 nm could be overcome to enable more detailed insights into biological samples. Especially the single molecule localization microscopy method dSTORM offers the possibility of quantitative bioimaging. Hereby, the repetitive photoswitching of organic dyes in the presence of thiols is exploited to enable a lateral resolution of 20 nm. Another, recently introduced super-resolution method is expansion microscopy (ExM) which physically expands the sample to increase the resolution by the expansion factor from four to even twenty. To enable this, the sample is embedded into a hydrogel, homogenized using an unspecific proteinase and expanded in distilled water. Within this thesis, both methods were used to shed light on plasma membrane receptor distributions and different bacterial and fungal pathogens. In the first part of this thesis dSTORM was used to elucidate the “Receptome”, the entirety of all membrane receptors, of the cell line Jurkat T-cells and primary T-cells. Within this project we could successfully visualize and quantify the distribution of the plasma membrane receptors CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 and CD105 with receptor densities ranging from 0.8 cluster/µm² in case of CD20 and 81.4 cluster/µm² for the highly abundant CD45 in activated primary T-cells at the basal membrane. Hereby, we could also demonstrate a homogeneous distribution of most receptors, while only few were clustered. In the case of CD3-clusters were detected in Jurkat T-cells and in primary activated T-cells, but not in naïve ones, demonstrating the activation of this receptor. This was followed by the application of dSTORM to three different clinical projects involving the receptors CD38, BCMA and CD20 which are immunotherapeutic targets by monoclonal antibodies and CAR T-cells. In the first two projects dSTORM was applied to determine the receptor upregulation upon exposure of various drugs to MM1.S cells or primary multiple myeloma patient cells. This increase in membrane receptor expression can subsequently enhance the efficacy of therapies directed against these receptors. Within the CD20-project, the superior sensitivity of dSTORM compared to flow cytometry could be demonstrated. Hereby, a substantially higher fraction of CD20-positive patient cells was detected by dSTORM than by flow cytometry. In addition, we could show that by dSTORM CD20-positive evaluated cells were eradicated by immunotherapeutic CAR T-cell treatment. These studies were followed by whole cell super-resolution imaging using both LLS-3D dSTORM and 10x ExM to exclude any artifacts caused by interactions with the glass surface. In 10x ExM signal amplification via biotinylated primary antibodies and streptavidin ATTO 643 was essential to detect even single antibodies directed against the heterodimer CD11a with standard confocal microscopes. Albeit probably not quantitative due to the process of gelation, digestion and expansion during the ExM protocol, even some putative dimers of the receptor CD2 could be visualized using 10x ExM-SIM, similar to dSTORM experiments. Within the second part of this thesis, expansion microscopy was established in bacterial and fungal pathogens. ExM enabled not only an isotropic fourfold expansion of Chlamydia trachomatis, but also allowed the discrimination between the two developmental forms by the chlamydial size after expansion into reticulate and elementary bodies. Hereafter, a new α-NH2-ω-N3-C6-ceramide was introduced enabling an efficient fixation and for the first time the use of lipids in both, 4x and 10x ExM, termed sphingolipid ExM. This compound was used to investigate the ceramide uptake and incorporation into the cell membrane of Chlamydia trachomatis and Simkania negevensis. For Chlamydia trachomatis the combined resolution power of 10x ExM and SIM even allowed the visualization of both bacterial membranes within a distance of ~30 nm. Finally, ExM was applied to the three different fungi Ustilago maydis, Fusarium oxysporum and Aspergillus fumigatus after enzymatic removal of the fungal cell wall. In case of Ustilago maydis sporidia this digestion could be applied to both, living cells resulting in protoplasts and to fixed cells, preserving the fungal morphology. This new protocol could be demonstrated for immunostainings and fluorescent proteins of the three different fungi. N2 - Menschen neigen schon immer dazu, vor allem das zu glauben, was sie mit eigenen Augen sehen können, weswegen mikroskopische Methoden seit ihrer Erfindung im 17. Jahrhundert schon immer sehr beliebt waren. Mit der Einführung der hochauflösenden Mikroskopie konnte das Auflösungslimit von ~200 - 250 nm durchbrochen werden, was genauere Einblicke in biologische Proben ermöglichte. Insbesondere die Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie Methode dSTORM bietet hierbei die Möglichkeit der quantitativen Bildgebung. Sie nutzt das wiederholte Schalten organischer Farbstoffe in Anwesenheit von Thiolen, was eine Auflösung von bis zu 20 nm möglich macht. Eine weitere kürzlich entwickelte hochauflösende Mikroskopiemethode ist die Expansionsmikroskopie (ExM), in welcher die Probe isotrop vier- bis sogar zwanzigfach vergrößert wird, womit sich auch die Auflösung um diesen Faktor vergrößert. Um dies zu ermöglichen, wird die Probe in ein Hydrogel eingebettet, mittels einer unspezifischen Proteinase homogenisiert und in destilliertem Wasser expandiert. Innerhalb dieser Arbeit wurden beide Methoden genutzt, um sowohl die Verteilung von Plasmamembran Rezeptoren als auch unterschiedliche bakterielle und pilzliche Pathogene zu beleuchten Im ersten Teil dieser Arbeit wurde dSTORM genutzt, um das „Rezeptom“, die Gesamtheit aller Membranrezeptoren, sowohl von Jurkat T-Zellen als auch von primären Patientenzellen zu entschlüsseln. In dieser Arbeit konnten die Rezeptoren CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 und CD105 erfolgreich visualisiert und quantifiziert werden, welche Dichten von 0,8 Cluster pro µm² im Falle von CD20 und 81,4 Cluster pro µm² für den stark exprimierten Rezeptor CD45 in aktivierten primären T-Zellen auf der basalen Membran aufwiesen. Hierbei konnten wir für einen Großteil der Rezeptoren eine homogene Verteilung nachweisen, wohingegen nur wenige andere Rezeptoren Cluster zeigten. Für CD3 konnten sowohl in Jurkat T-Zellen als auch in aktivierten primären Zellen Cluster detektiert werden, was auf deren Aktivierung hinweist, wohingegen CD3 in naiven Zellen homogen verteilt war. Im Weiteren wurde dSTORM im Rahmen von drei klinischen Fragestellungen angewandt, in welche die Rezeptoren CD38, BCMA und CD20 involviert waren, die in Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern oder auch CAR T-Zellen adressiert werden. In den beiden erstgenannten Projekten wurde dSTORM genutzt, um die Erhöhung der Rezeptoren-Expression nach Zugabe verschiedener Medikamente sowohl in der Zelllinie MM1.S als auch in primären Zellen von Patienten mit multiplen Myelomen zu bestimmen. Durch das CD20-Projekt hingegen wurde die überlegene Sensitivität von dSTORM gegenüber der Durchflusszytometrie unter Beweis gestellt. Hier konnte verglichen mit der Durchflusszytometrie eine deutlich höhere CD20-positive Fraktion in Patientenzellen detektiert werden, welche nach Behandlung mit CD20 CAR T-Zellen eliminiert wurde. Hierauf folgte hochauflösende Bildgebung ganzer Zellen sowohl mit LLS-3D dSTORM als auch 10x ExM, um Interaktionen mit der Glasoberfläche ausschließen zu können. Bei 10x ExM wurde eine Signalamplifikation mittels Biotin und Streptavidin ATTO 643 benötigt, wonach sogar einzelne Antikörper, welche gegen den Heterodimer CD11a gerichtet waren, an einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop detektiert werden konnten. Obwohl dies aufgrund der Prozesse von Gelierung, Verdau und Expansion während des ExM-Protokolls vermutlich nicht quantitativ ist, konnten sogar mutmaßliche Dimere des Rezeptors CD2 mit 10x ExM-SIM visualisiert werden, welche ähnlich in dSTORM Experimenten auftraten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expansionsmikroskopie für bakterielle und pilzliche Pathogene eingesetzt. ExM ermöglichte nicht nur eine isotrope vierfache Expansion von Chlamydia trachomatis, sondern auch die Unterscheidung der beiden Entwicklungsformen, der Retikulär- und Elementarkörperchen, aufgrund der Größe der einzelnen Chlamydien. Anschließend wurde ein neues α-NH2-ω-N3-C6-Ceramid eingeführt, was eine effiziente Fixierung und zum ersten Mal die Nutzung von Lipiden in 4x und 10x ExM ermöglichte, was wir Sphingolipid ExM nannten. Diese Verbindung wurde genutzt, um die Ceramid-Aufnahme und den -Einbau in die Zellmembran von Chlamydia trachomatis und Simkania negevensis zu untersuchen. Im Falle von Chlamydia trachomatis wurde die hohe Auflösung von 10x ExM mit SIM kombiniert, was die Visualisierung beider bakterieller Membranen in einem Abstand von ~30 nm ermöglichte. Hiernach wurde ExM bei den drei unterschiedlichen Pilzen Ustilago maydis, Fusarium oxysporum und Aspergillus fumigatus nach enzymatischen Verdau der pilzlichen Zellwand angewandt. Im Falle von Ustilago maydis Sporidien konnte der Verdau sowohl an lebenden Zellen, was in Protoplasten resultierte, als auch an fixierten Zellen verwendet werden, was die Morphologie erhielt. Mittels dieses neuen Protokolls konnten sowohl Immunfärbungen als auch fluoreszierende Proteine der drei genannten Pilze expandiert werden. KW - Mikroskopie KW - Microscopy KW - Super-resolution microscopy KW - Hochauflösende Mikroskopie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207165 ER - TY - THES A1 - Aigner, Max T1 - Establishing successful protocols and imaging pipelines for Expansion Microscopy in murine blood platelets T1 - Etablierung erfolgreicher Protokolle zur Probenpräparation und Bildgebung für die ‚Expansion Microscopy‘ in murinen Thrombozyten N2 - Platelets play an important role in the body, since they are part of the hemostasis system, preventing and stopping blood loss. Nevertheless, when platelet or coagulation system function are impaired, uncontrolled bleedings but also irreversible vessel occlusion followed by ischemic tissue damage can occur. Therefore, understanding platelet function and activation, mechanisms which are controlled by a variety of platelet membrane receptors and other factors is important to advance out knowledge of hemostasis and platelet malfunction. For a complete picture of platelet function and their modulating behavior it is desired to be able to quantify receptor distributions and interactions of these densely packed molecular ensembles in the membrane. This challenges scientists for several reasons. Most importantly, platelets are microscopically small objects, challenging the spatial resolution of conventional light microscopy. Moreover, platelet receptors are highly abundant on the membrane so even super-resolution microscopy struggles with quantitative receptor imaging on platelets. With Expansion microscopy (ExM), a new super-resolution technique was introduced, allowing resolutions to achieve super-resolution without using a super-resolution microscope, but by combining a conventional confocal microscopy with a highly processed sample that has been expanded physically. In this doctoral thesis, I evaluated the potential of this technique for super-resolution platelet imaging by optimizing the sample preparation process and establishing an imaging and image processing pipeline for dual-color 3D images of different membrane receptors. The analysis of receptor colocalization using ExM demonstrated a clear superiority compared to conventional microscopy. Furthermore, I identified a library of fluorescently labeled antibodies against different platelet receptors compatible with ExM and showed the possibility of staining membrane receptors and parts of the cytoskeleton at the same time. N2 - Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle im Körper, denn als Teil des Gerinnungssystems, sind sie daran beteiligt Blutverlust vorzubeugen und zu stoppen. Gleichwohl können sie bei Störungen des Gerinnungssystems zu unkontrollierbaren Blutungen und auch durch Aggregation zu kardiovaskulären Ereignissen, wie Herzinfarkt und Schlaganfällen führen. Für ein besseres Verständnis von Hämostase und Gerinnungsstörungen ist es deshalb nötig die Funktion und Aktivierung von Thrombozyten zu verstehen, welche durch eine Vielzahl von Membranrezeptoren und anderen Faktoren gesteuert wird. Eine Methode, um weitere Einblicke in diese Prozesse zu bekommen ist die mikroskopische Darstellung von Rezeptorverteilungen auf der Zellmembran und deren Interaktionen. Dies zu realisieren ist aus verschiedenen Gründen anspruchsvoll. Der mikroskopisch kleine Durchmesser der Thrombozyten macht es konventioneller Lichtmikroskopie schwer, einzelne Rezeptoren auf der Membran darzustellen. Außerdem befinden sich sehr viele Rezeptoren dicht gepackt auf der Membran, sodass sogar superhochauflösende Mikroskope Schwierigkeiten haben, die Rezeptoren quantitativ zu beurteilen. Mit ‚Expansion microscopy‘ (ExM) wurde eine relativ junge superhochaufösende Technik auf Thrombozyten angewendet. Diese Technik erreicht Auflösungen vergleichbar mit sogenannten ‚super-resolution‘ Mikroskopen, ohne die Benutzung selbiger, sondern durch die Kombination von konfokaler Mikroskopie mit einer physikalisch expandierten Probe. In dieser Arbeit evaluierte ich das Potential dieser Technik für superhochauflösende Bilder von Thrombozytenrezeptoren und optimierte die Probenvorbereitung, sodass zweifarbige 3D Bilder von verschiedenen Membranrezeptoren möglich waren. Die Ergebnisse der Kolokationsanalyse zeigten einen deutlich vergrößerten Dynamikumfang durch ExM. Außerdem katalogisierte ich fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen verschiedene Thrombozyten Rezeptoren bezüglich ihrer Tauglichkeit mit ExM und zeigte, dass es möglich ist Membranrezeptoren und Bestandteile des Zytoskeletts gleichzeitig zu färben. KW - Expansion Microscopy KW - platelets KW - Mikroskopie KW - Microscopy Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-309003 ER -