TY - THES A1 - Kalb, Reinhard T1 - Fanconi anemia and RAD50 deficiency : genetic and functional analysis T1 - Fanconi Anämie und RAD50-Defizienz : genetische und funktionelle Analysen N2 - Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex. N2 - Die sogenannten “Caretaker”-Gene spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Antwort auf DNA Schäden. Mutationen in diesen Genen führen zur Ausprägung von einigen seltenen Erbkrankheiten, die sich durch genetische Instabilität und in vielen Fällen durch erhöhtes Krebsrisiko auszeichnen. Eine dieser Erkrankungen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, ist Fanconi Anämie (FA). Dabei handelt es sich um eine sehr seltene chromosomale Instabilitätserkrankung, die einem rezessiven Erbgang folgt. Der klinische Phänotyp von FA ist gekennzeichnet durch ein variables Spektrum von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarksversagen und einer Prädisposition für Neoplasien. Durch somatische Zellfusionstudien und in einigen Fällen durch direkte genetische Zuordnung konnten bisher 13 Komplementationsgruppen definiert werden (FAA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), von denen jede einen Defekt in einem bestimmten Gen widerspiegelt. Inzwischen sind, mit Ausnahme von FANCI, alle korrespondierenden FA Gene identifiziert. Ein Überblick über den aktuellen Stand ist in den Kapiteln 1 und 2 dieser Arbeit zu finden. Zellen von FA-Patienten zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität gegenüber DNA quervernetzenden Substanzen und einer hohen Empfindlichkeit gegenüber einer erhöhten Sauerstoffkonzentration aus. Zur Frage der Radiosensitivität von FA-Zellen gab es bisher nur widersprüchliche Daten. Mit Hilfe einer systematischen Analyse von primären Fibroblasten aller (zum Zeitpunkt der Untersuchung) bekannten Komplementationsgruppen konnte gezeigt werden, dass unter physiologischen Sauerstoffkonzentrationen keine erhöhte Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und ultraviolettem Licht (UV) besteht (Kapitel 3). Trotz einigen Zellinien-spezifischen Schwankungen waren die Unterschiede zwischen Patientenzellen und gesunden Kontrollen marginal, verglichen mit der eindeutig erhöhten Sensitivität von Zellen positiver Kontrollen (Ataxia telangiactasia (IR Kontrolle) bzw. Cockayne Syndrom (UV-Kontrolle)). Die in Kapitel 3 nachgewiesene fehlende Radiosensitivität von FA-Zellen ist im Kontext des FANCD2-Gens von besonderem Interesse, da diesem Gen eine Schlüsselposition im FA/BRCA Doppelstrangbruch-Reparaturweg zukommt. Das Screening von FA-Patienten, bei denen bereits eine Zuordnung zu den Komplementationsgruppen FA-A, C, E, F, G und L ausgeschlossen war, führte zur Identifikation einer Reihe von FA-D2 Patienten. In einer großen Kohortenstudie wurden 29 FA-D2 Patienten mit klinischen Informationen sowie 3 zusätzliche FA-D2 Patienten hinsichtlich ihrer Mutationen in FANCD2 untersucht (Kapitel 4). Für alle 32 Patienten konnten biallelische Mutationen nachgewiesen werden, auch wenn das Vorhandensein von pseudogenen Regionen die Mutationsanalyse erschwerte. Wie in keinem der anderen FA-Gene führt die Mehrzahl der Mutationen in FANCD2 zu verändertem Spleißenverhalten, wie zum Beispiel zur Exklusion eines Exons, zur Exonisation intronischer Bereiche, der Aktivierung von kryptischen oder der Erzeugung von neuen 3´ Spleißstellen. Viele Allele wurden mehrfach gefunden und konnten einem ethnischen Hintergrund zugeordnet werden. In allen verfügbaren lymphoblastoiden Patienten-Zelllinien wurde residuales FANCD2-Protein detektiert, wobei das Vorhandensein der monoubiquitinylierten Isoform auf ein funktionelles Protein hindeutet. Zusammen mit der Tatsache, dass in keinem der Patienten eindeutige biallelische Nullmutationen nachgewiesen werden konnten, ist somit offenbar das Vorhandensein von hypomorphen Mutationen und entsprechendem Restprotein für die Lebensfähigkeit von FA-D2 Patienten essentiell. In Kapitel 5 wird der weltweit zweite FA Patient vorgestellt, welcher der Komplementationsgruppe FA-L zugeordnet werden konnte. Die genetische Analyse von primären Fibroblasten dieses Patienten führte zum Nachweis einer 5 Basen umfassenden Deletion in Exon 7 sowie zu einer Missense-Mutation in Exon 11. Im Gegensatz zu den untersuchten Fibroblasten zeigten zwei unabhängig etablierte lymphoblastoide Zellinien keine erhöhte Sensitivität gegenüber Mitomycin C, was auf einer somatische Reversion beruhen kann. Diese Vermutung wurde durch den Nachweis einer induzierbaren Monoubiquitinylierung von FANCD2 in Lymphoblasten bestätigt. Die funktionelle Reversion basiert auf einer zur Deletion in cis befindlichen kompensatorischen Mutation im Spleiß-Akzeptor von Exon 7, die zu einem veränderten Spleißprodukt und der Wiederherstellung des Leserahmens führt. Die somatische Reversion beschränkt sich jedoch auf die lymphatischen Zellreihen und hatte daher nur einen partiellen Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Ein allgemeines Knochenmarksversagens machte eine Transplantation unumgänglich. Die Konditionierung wurde jedoch auf das vorhandene hämatopoietische Mosaik abgestimmt, um eine Graft vs. Host Reaktion zu vermeiden. Die Identifizierung des BRCA1 interagierenden Proteins 1 (BRIP1/BACH1) als ein bona fide FA-Gen (Kapitel 6) verdeutlicht die direkte Verknüpfung des FA/BRCA DNA Reparaturweges mit anderen DNA Reparaturwegen. Trunkierende Mutationen in BRIP1 wurden in zwei blutsverwandten Eskimofamilien mittels genetischer Positionsanalysen gefunden. Im Gegensatz zu den meisten anderen FA Patienten war die Monoubiquitinylierung von FANCD2 trotz MMC Empfindlichkeit intakt, was für eine Zuordnung zur Komplementationsgruppe FA-J sprach. Biallelische Mutationen in BRIP1 wurden in 8 weiteren Patienten gefunden, von denen einer ursprünglich durch somatische Zellfusion zu FA-J zugeordnet wurde. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das postulierte FANCJ Gen mit BRIP1 identisch ist. Als eines der wenigen FA Gene besitzt BRIP1 bekannte funktionelle Domänen (DNA Helikase), die somit biochemisch für die Entschlüsselung des FA/BRCA Weges genutzt werden können. Biallelische Muatationen in FANCD1, welches identisch mit dem bekannten Brustkrebsgen BRCA2 ist, führen zu einer besonders schweren Form von Fanconi Anämie, die bereits im frühen Kindesalter mit einem sehr hohen Krebsrisko verbunden ist. Kurz vor Abschluss dieser Arbeit gelang die Charakterisierung eines mit BRCA2 interagierendes Proteins, welches als „partner und localizer of BRCA2“ (kurz PALB2) bezeichnet wurde und offenbar zelluläre Resistenz gegenüber Mitomycin C (MMC) bedingt. Ein genetischer Screen von bisher nicht-klassifizierten FA-Patienten führte zur Identifizierung von sieben Patienten mit biallelischen Mutationen in PALB2 (Kapitel 7). Alle Patienten entwickelten bereits im frühen Kindesalter bösartige Tumore. Der zelluläre Phänotyp von PALB2- defizienten Zellen weist eine Störung der MMC induzierten RAD51 Foci-Bildung auf. Darüberhinaus zeigen PALB2-defiziente Zellen eine spontane chromosomale Instabilität, die durch eine MMC-Gabe stark erhöht werden kann. Die Transduktion von PALB2 cDNA führt zur Reduktion der MMC induzierten G2 Phasen Arretierung und zur Reversion des MMC-sensitiven Phänotyps. Biallelische Mutationen in PALB2 verursachen somit eine Form von Fanconi Anämie, die mit hohem Krebsrisiko verbunden ist. PALB2 wird nach der gängigen FA-Nomenklatur als FANCN bezeichnet und liegt der neu definierten Komplementationsgruppe FA-N zugrunde. Die vorliegende Arbeit hat in mehreren Punkten zur Verbesserung des derzeitigen Wissenstandes über die komplexe genetisch bedingte Erkrankung Fanconi Anämie beigetragen 1. trotz molekularer Wechselwirkung von FA-Proteinen mit Komponenten aus anderen DNA-Reparatursystemen zeigen Zellen von FA Patienten unabhängig von der Komplentationsgruppe weder Strahlen- noch UV-Sensitivität; 2. die Existenz von hypomorphen Mutationen in FANCD2 und das Auftreten von Restprotein korreliert offenbar mit der Lebensfähigkeit von biallelischen Mutationen im FANCD2 Gen. 3. unter den bisher nicht klassifizierten Patienten wurde der weltweit zweite Patient der Komplementationsgruppe FA-L gefunden, in dessen Blutzellen ein neuartiger Mechanismus von somatischer Reversion nachgewiesen werden konnte 4. die Beteiligung an der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von zwei neuen FA-Genen (FANCJ und FANCN), welche die FA-abhängigen DNA-Reparaturwege direkt mit den Brustkrebsgenen BRCA1 und BRCA2 in Verbindung bringen. Das letzte Kapitel der Arbeit befasst sich mit einem DNA-Reparaturweg, der insbesondere nach Strahlenexposition aktiviert wird. Eines der zentralen Proteine, das an der Erkennung von strahleninduzierten DNA Schäden beteiligt ist, ist die Kinase ATM. Eine Reihe von Proteinen wird von ATM phosphoryliert, womit eine DNA Schadensantwort bei Doppelstrangbrüchen ausgelöst wird. Der NMR-Proteinkomplex, bestehend aus NBS1, MRE11 und RAD50, ist an der Aktivierung der ATM Kinase beteiligt und wird daher als ein Sensor für DNA Doppelstrangbrüche angesehen. Biallelische Mutationen in MRE11 und NBS1 führen zu den Radiosensitivitätssyndromen „Ataxia telangiectasia-like disease“ (AT-LD) bzw. „Nijmegen breakage syndrome“ (NBS). In Kapitel 8 wird der erste Patient mit RAD50 Defizienz vorgestellt. Bei einer 18 jährigen Patientin mit einem NBS- ähnlichem klinischem Phänotyp, jedoch ohne Immundefizienz, wurden eine prämature Stopp- Mutation und der Verlust des natürlichen Translationsterminations-Signals gefunden. Die Expression von RAD50 ist in Fibroblasten und Lymphozyten der Patientin auf weniger als 10% reduziert. Auf zellulärer Ebene ist eine hohe Chromosomenbruchrate, eine dosisabhängige Arretierung in der G2 Phase des Zellzyklus, Defekte in den G1 und S Phase Kontrollpunkten, sowie das Fehlen der IR-induzierten Relokalisation von NBS1 und MRE11 zu beobachten. Korrekte Relokalisation und normale Phosphorylierungsmuster wurden experimentell durch transiente Transfektion von RAD50 cDNA wiederhergestellt, was die Bedeutung von RAD50 für diese Prozesse belegt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass RAD50, ebenso wie NBS1 und MRE11, die ATM abhängige DNA Schadensantwort und die G1/S Zellzykluskontrolle moduliert. RAD50 scheint für die nukleäre Lokalisation von MRE11, sowie für die induzierte Relokalisation von MRE11 und NBS1 in nukleäre Foci notwendig zu sein. Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann die RAD50-Defizienz zu der wachsenden Liste von Caretaker-Syndromen als eine neue Radiosensitivität-Erkrankung hinzugefügt werden. Das Krankheitsbild unterscheidet sich trotz enger molekularer Interaktion zwischen RAD50, NBS1 und MRE11 im NMR-Komplex von den Defekten in diesen Genen. KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi-Anämie KW - Erbkrankheit KW - Genmutation KW - chromosomale Instabilität KW - FA KW - RAD50-Defizienz KW - Fanconi anemia KW - chromosomal instability KW - DNA repair KW - FA KW - mutation analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25823 ER - TY - THES A1 - Neveling, Kornelia T1 - Molecular causes and consequences of genetic instability with respect to the FA/BRCA Caretaker Pathway T1 - Molekulargenetische Ursachen und Folgen genetischer Instabilität am Beispiel des FA/BRCA Caretaker Pathways N2 - In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5’-3’ helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as “partner and localizer of BRCA2”. In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research. N2 - Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden molekulare Ursachen und funktionale Konsequenzen genetischer Instabilität am Beispiel der menschlichen Erbkrankheit Fanconi Anämie (FA) untersucht. FA Patienten zeigen einen sehr variablen klinischen Phänotyp, der in der Regel angeborene Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und ein hohes Risiko für Tumorerkrankungen beinhaltet. Der zelluläre Phänotyp der FA ist durch eine spontane und induzierbare chromosomale Instabilität und einen typischen S/G2-Phasen-Arrest nach Exposition mit DNA-schädigenden Agentien charakterisiert. Biallelische oder -im Fall des X-chromosomalen FANCB- hemizygote Mutationen, die zu dieser Erkrankung führen, wurden in bislang 13 Genen identifiziert. Die FA Proteine arbeiten in einem gemeinsamen Netzwerk und sind essentiell beteiligt an der zellulären Antwort auf DNA Schädigung. Eine umfassendere Übersicht über Fanconi Anämie und ihre vielfältigen klinischen, zellulären und molekularen Erscheinungsformen ist in der Einleitung dieser Dissertation gegeben. Die Ergebnisse meiner experimentellen Arbeiten sind in Form von publizierten Fachartikeln und fertigen Manuskripten dargestellt. In der ersten Publikation habe ich den Zusammenhang von FA Genen und Harnblasentumoren untersucht. Die Frage, die ich zu beantworten versucht habe, war, ob ein Defekt im FA/BRCA Weg eine mögliche Ursache für die Entstehung von Blasentumoren sein könnte. Aufgrund meiner experimentellen Daten bin ich zu dem Schluss gekommen, dass ein Defekt im FA/BRCA Weg für einen Tumor vermutlich eher schädlich als vorteilhaft ist, da so ein Defekt den Tumor gegenüber DNA-schädigenden Agentien und oxidativem Stress anfällig machen würde. Meine zweite Publikation befasst sich mit dem Kern-Komplex Protein FANCE und versucht die Frage zu beantworten, warum das FANCE Gen in so wenigen FA Patienten betroffen ist. Die Schlussfolgerung dieser Arbeit war, dass FANCE vermutlich genauso wie FANCF im Kern-Komplex die Rolle eines Adaptor-Proteins mit einer hohen Toleranz gegenüber Aminosäure-Austauschen innehat, was die relative Seltenheit von Patienten dieser Untergruppe erklären könnte. Ich habe weiterhin das FANCL Gen untersucht, dessen Produkt als katalytische Untereinheit der E3-Ligase fungiert. Die dritte Publikation in dieser Dissertation befasst sich mit diesem Thema und enthält eine umfassende Beschreibung von genetischen Veränderungen und phänotypischen Auswirkungen in einer Gruppe von 3 FA-L Patienten. Die Ergebnisse meiner Arbeit haben allerdings gezeigt, dass genetische Veränderungen in FANCL mit dem Leben vereinbar sind, dass diese Veränderungen sehr große Deletionen beinhalten können, was bisher nur für FANCA gezeigt werden konnte, dass FA-L Phänotypen von mild bis schwer betroffen reichen können und dass FANCL zu den Genen gehört, in denen somatische Reversionen stattfinden. Das Schlüsselprotein des FA/BRCA Netzwerks, FANCD2, ist das Thema der vierten Publikation in dieser Dissertation. Insbesondere konnten wir zeigen, dass es keine biallelischen Nullmutationen in FANCD2 zu geben scheint. Dementsprechend war Restprotein von beiden FANCD2-Isoformen, FANCD2-L und FANCD2-S, in allen verfügbaren Patienten-Zelllinien nachweisbar. Dies ließ vermuten, dass ein komplettes Fehlen des FANCD2 Proteins nicht tolerierbar ist und frühe embryonale Letalität verursacht. Es mindestens drei Proteine, die nicht für diese posttranslationale Modifikation benötigt werden. Eines dieser Proteine ist die 5’-3’ Helikase BRIP1 (BRCA1-interagierendes Protein 1), ein Protein, das direkt mit dem Brustkrebs-assoziierten Protein BRCA1 interagiert. Ich war an der Identifizierung von BRIP1 als FA Protein (FANCJ) beteiligt. Diese Entdeckung ist in der fünften Publikation meiner Dissertation beschrieben. Das neu entdeckte Protein BRIP1/FANCJ, das direkt mit BRCA1 interagiert, scheint als einer der Mediatoren zur Aufrechterhaltung genomischer Stabilität downstream von FANCD2 zu wirken. Ein weiteres Protein downstream von FANCD2 ist PALB2. PALB2 wurde ursprünglich als „Partner und Lokalisierer von BRCA2“ entdeckt. In einer Kandidatengen-Studie haben wir Patienten mit frühkindlichen Tumoren, aber ohne Mutationen in BRCA2, auf Mutationen in PALB2 untersucht (Publikation 6). Aufgrund unserer Ergebnisse haben wir PALB2 als ein neues FA Gen identifiziert und haben es FANCN genannt. Genauso wie FA-D1 Patienten sind FA-N Patienten sehr schwer betroffen. Die letzte Publikation meiner Dissertation beschreibt die Identifikation des FA Genes FANCI, dessen Produkt das zweite monoubiquitinierte Mitglied des FA/BRCA Weges darstellt (Publikation 7). Wir haben in vier Patienten biallelische Mutationen in KIAA1794 gefunden, und so zeigen können, dass KIAA1794 wirklich ein FA Gen ist. Die generelle Diskussion birgt eine Synopsis der Ergebnisse und Schlussfolgerungen meiner Forschung mit dem aktuellen Wissensstand über FA. KW - Fanconi-Anämie KW - DNS-Reparatur KW - Chromosomenbruch KW - Blasentumor KW - Brustkrebs KW - Methylierung KW - DNA-Instabilitätssyndrom KW - Mutationsanalyse KW - DNA-Quervernetzung KW - Genetik KW - Zellzyklus KW - Fanconi anemia KW - DNA repair KW - chromsomal instability KW - interstrand crosslink Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27383 ER - TY - THES A1 - Fronczek, David Norman T1 - Integration of fluorescence and atomic force microscopy for single molecule studies of protein complexes N2 - The scope of this work is to develop a novel single-molecule imaging technique by combining atomic force microscopy (AFM) and optical fluorescence microscopy. The technique is used for characterizing the structural properties of multi-protein complexes. The high-resolution fluorescence microscopy and AFM are combined (FIONA-AFM) to allow for the identification of individual proteins in such complexes. This is achieved by labeling single proteins with fluorescent dyes and determining the positions of these fluorophores with high precision in an optical image. The same area of the sample is subsequently scanned by AFM. Finally, the two images are aligned and the positions of the fluorophores are displayed on top of the topographical data. Using quantum dots as fiducial markers in addition to fluorescently labeled proteins, fluorescence and AFM information can be aligned with an accuracy better than 10 nm, which is sufficient to identify single fluorescently labeled proteins in most multi-protein complexes. The limitations of localization precision and accuracy in fluorescence and AFM images are investigated, including their effects on the overall registration accuracy of FIONA-AFM hybrid images. This combination of the two complementary techniques opens a wide spectrum of possible applications to the study of protein interactions, because AFM can yield high resolution (5–10 nm) information about the conformational properties of multi-protein complexes while the fluorescence can indicate spatial relationships of the proteins within the complexes. Additionally, computer simulations are performed in order to validate the accuracy of the registration algorithm. N2 - Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde ein bildgebendes Verfahren zur Identifizierung einzelner Proteine in rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen entwickelt. Dazu wird ein integrierter Versuchsaufbau aus einem Rasterkraft- und einem optischen Mikroskop verwendet. Ziel der Technik ist die Identifizierung einzelner Proteine im biologischen Kontext (z. B. in Proteinkomplexen). Dazu werden ausgewählte Proteine fluoreszierend markiert und parallel zur Rasterkraftmessung optisch abgebildet. Für dieses Verfahren werden transparente und zugleich nano-glatte Substrate benötigt. Dazu wurden Probenträger aus Glas und Mica (Muskovit) verwendet und evaluiert. Als Fluoreszenzfarbstoffe kommen Quantenpunkte zum Einsatz, bestehend aus 5–10 nm großen Nanokristallen, die vermittels Antikörper stabil an Proteine gebunden werden können, ohne deren Funktion zu beeinträchtigen. Die optische Anregung erfolgt durch einen Argon-Laser, unter Verwendung des Prinzips der Totalreflektions-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF). Im optischen Bild erscheinen die Fluorophore als einzelne Beugungsscheibchen. Durch eine Ausgleichsrechnung, bei der eine 2D-Gaußfunktion an die Daten angepasst wird, werden die Positionen der Fluorophore mit hoher Genauigkeit ermittelt (Superlocalization). Anschließend werden die Bilder durch eine affine Transformation ausgerichtet. Diese Transformation wird durch ein merkmalbasiertes Bildregistrierungsverfahren numerisch bestimmt, welches die Koordinaten einiger identischer Punkte in den Rasterkraft- und Fluoreszenzbildern als Eingabe benötigt. Die Programmierung und Evaluierung des zur Auswertung erforderlichen Algorithmus war Teil der Arbeit. Die Positionen der Fluorophore werden anschließend farbkodiert im topografischen Bild ausgegeben, was die Identifizierung einzelner Proteine/Objekte ermöglicht. Zur experimentellen Realisierung des Verfahrens wurden Abbildungen mit ungebundenen Quantenpunkten erstellt, wobei eine Überlagerungsgenauigkeit von ca. 6 nm (Glas) bzw. ca. 9 nm (Mica) erreicht werden konnte. Ergänzend dazu wurden Simulationen durchgeführt, um die Validität des Auswertungsalgorithmus zu bestätigen. Diese ermöglichen zusätzlich Vorhersagen über die zu erwartende Genauigkeit unter verschiedenen Abbildungsbedingungen. Schließlich wurde die Technik exemplarisch auf ein biologisches System angewendet. Dazu wurde der Schadenserkennungsapparat des bakteriellen DNS-Reparatursystems NER herangezogen. Bei gleichzeitig deutlicher Sichtbarkeit einzelner DNS-Moleküle und Proteine im Topographiebild konnte eine Überlagerungsgenauigkeit von 8.8 nm erreicht werden. KW - Kraftmikroskopie KW - Fluoreszenz KW - DNS-Reparatur KW - Registrierung KW - Multiproteinkomplex KW - AFM KW - Fluorescence imaging with one nanometer accuracy KW - FIONA KW - hybrid imaging Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70731 ER - TY - THES A1 - Roth, Heide Marie T1 - Nucleotide Excision Repair: From Recognition to Incision of damaged DNA T1 - Nukleotid-Exzisions-Reparatur: Vom Erkennen zum Schneiden der geschädigten DNA N2 - The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is able to remove a vast diversity of structurally unrelated DNA lesions and is the only repair mechanism in humans responsible for the excision of UV induced DNA damages. The NER mechanism raises two fundamental questions: 1) How is DNA damage recognition achieved discriminating damaged from non damaged DNA? 2) How is DNA incision regulated preventing endonucleases to cleave DNA non specifically but induce and ensure dual incision of damaged DNA? Thus, the aim of this work was to investigate the mechanisms leading from recognition to incision of damaged DNA. To decipher the underlying process of damage recognition in a prokaryotic model system, the intention of the first part of this work was to co crystallize the helicase UvrB form Bacillus caldotenax together with a DNA substrate comprising a fluorescein adducted thymine as an NER substrate. Incision assays were performed to address the question whether UvrB in complex with the endonuclease UvrC is able to specifically incise damaged DNA employing DNA substrates with unpaired regions at different positions with respect to the DNA lesion. The results presented here indicate that the formation of a specific pre incision complex is independent of the damage sensor UvrA. The preference for 5’ bubble substrate suggests that UvrB is able to slide along the DNA favorably in a 5’ → 3’ direction until it directly encounters a DNA damage on the translocating strand to then recruit the endonuclease UvrC. In the second part of this work, the novel endonuclease Bax1 from Thermoplasma acidophilum was characterized. Due to its close association to archaeal XPB, a potential involvement of Bax1 in archaeal NER has been postulated. Bax1 was shown to be a Mg2+ dependent, structure specific endonuclease incising 3’ overhang substrates in the single stranded region close to the ssDNA/dsDNA junction. Site directed mutagenesis of conserved amino acids was employed to identify putative active site residues of Bax1. In complex with the helicase XPB, however, incision activity of Bax1 is altered regarding substrate specificity. The presence of two distinct XPB/Bax1 complexes with different endonuclease activities indicates that XPB regulates Bax1 incision activity providing insights into the physical and functional interactions of XPB and Bax1. N2 - Die Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER) ist in der Lage, eine Vielfalt an strukturell unterschiedlichen DNA Schädigungen zu entfernen, und ist überdies der einzige DNA-Reparaturmechanismus im Menschen, der UV induzierte DNA-Schädigungen entfernen kann. Der NER Mechanismus impliziert zwei grundlegende Fragen: 1) Wie wird geschädigte DNA erkannt und worauf gründet sich die Unterscheidung zwischen geschädigter und nicht geschädigter DNA? 2) Wie wird das Schneiden der DNA reguliert? Wie wird unspezifisches Schneiden verhindert und sichergestellt, dass die geschädigte DNA auf beiden Seiten der Schädigung herausgeschnitten wird? Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die Mechanismen zu untersuchen, die vom Erkennen zum Herausschneiden geschädigter DNA führen. Um im bakteriellen Modelsystem den zugrundeliegenden Prozess der Schadenserkennung zu entschlüsseln, sollte im ersten Teil dieser Arbeit die Helikase UvrB aus Bacillus caldotenax zusammen mit einem geschädigten DNA Substrat kristallisiert werden. Als Schädigung wurde ein Fluorescein-Molekül genutzt, das an eine Thymin-Base gekoppelt wurde. Biochemische Experimente wurden durchgeführt um herauszufinden, ob UvrB im Komplex mit der Endonuklease UvrC spezifisch geschädigte DNA schneiden kann. Dafür wurden DNA-Substrate eingesetzt, die ungepaarte Basen an verschiedenen Stellen bezüglich der DNA-Schädigung enthielten. Die hier gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein spezifischer Komplex gebildet werden kann, der auch unabhängig von dem Schadenssensor UvrA zum Schneiden der DNA befähigt ist. Die Schnitt-Präferenz für die 5‘ ungepaarte Region lässt vermuten, dass UvrB bevorzugt in 5‘→3‘ Richtung an der DNA entlanggleiten kann. Sobald UvrB auf eine Schädigung auf diesem DNA Strang trifft, wird die Endonuklease UvrC rekrutiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die neuartige Endonuklease Bax1 aus Thermoplasma acidophilum charakterisiert. Aufgrund der engen Assoziation zu archaischem XPB wurde eine Beteiligung an der archaischen NER postuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Bax1 eine Mg2+ abhängige, strukturspezifische Endonuklease ist, die 3‘-Überhang Substrate im Einzelstrangbereich nahe des Einzelstrang/Doppelstrang Überganges schneidet. Konservierte Aminosäuren wurden gezielt verändert, um diejenigen Reste zu identifizieren, die möglicherweise das aktive Zentrum bilden. Im Komplex mit der Helikase XPB veränderte sich jedoch das Schneideverhalten im Hinblick auf die Substratspezifizität. Die Existenz von zwei verschiedenen XPB/Bax1 Komplexen mit unterschiedlicher Aktivität bezüglich des Schnittverhaltens könnte darauf hinweisen, dass XPB Bax1 reguliert. Diese Beobachtung erlaubt zugleich Einblicke in die Interaktion von XPB und Bax1 auf physikalischer und funktioneller Ebene. KW - DNS-Reparatur KW - Nucleasen KW - Helicasen KW - Archaebakterien KW - DNA Repair KW - Nuclease KW - Helicase KW - Archaea Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57098 ER - TY - THES A1 - Wolski, Stefanie Carola T1 - Structural and functional characterization of nucleotide excision repair proteins T1 - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Nucleotid-Exzisions-Reparatur Proteinen N2 - XPD is a 5‘-3‘ helicase of the superfamily 2. As part of the transcription factor IIH it functions in transcription initiation and nucleotide excision repair. This work focus on the role of XPD in nucleotide excision repair. NER is a DNA repair pathway unique for its broad substrate range. In placental mammals NER is the only repair mechanism able to remove lesions induced by UV-light. NER can be divided into four different steps that are conserved between pro- and eukaryotes. Step 1 consists of the initial damage recognition, during step 2 the putative damage is verified, in step 3 the verified damage is excised and in the 4th and final step the resulting gap in the DNA is refilled. XPD was shown to be involved in the damage verification step. It was possible to solve the first apo XPD structure by a MAD approach using only the endogenous iron from the iron sulfur cluster. Based on the apo XPD structure several questions arise: where is DNA bound? Where is DNA separated? How is damage verification achieved? What is the role of the FeS cluster? These questions were addressed in this work. Hypothesis driven structure based functional mutagenesis was employed and combined with detailed biochemical characterization of the variants. The variants were analyzed by thermal unfolding studies to exclude the possibility that the overall stability could be affected by the point mutation. DNA binding assays, ATPase assays and helicase assays were performed to delineate amino acid residues important for DNA binding, helicase activity and damage recognition. A structure of XPD containing a four base pair DNA fragment was solved by molecular replacement. This structure displays the polarity of the translocated strand with respect to the helicase framework. Moreover the properties of the FeS cluster were studied by electron paramagnetic resonance to get insights into the role of the FeS cluster. Furthermore XPD from Ferroplasma acidarmanus was investigated since it was shown that it is stalled at CPD containing lesions. The data provide the first detailed insight into the translocation mechanism of a SF2B helicase and reveal how polarity is achieved. This provides a basis for further anlayses understanding the combined action of the helicase and the 4Fe4S cluster to accomplish damage verification within the NER cascade. N2 - XPD ist eine 5‘-3‘ Helicase der Superfamilie 2. Als Untereinheit des Transkriptionsfaktors IIH ist XPD in Transkriptionsinitiation und Nucleotid-Exzisions-Reparatur involviert. Diese Arbeit fokusiert auf die Rolle von XPD in der NER. NER ist ein DNA Reparatur Weg der bekannt ist für seine breite Substratspezifität. In Säugetieren ist NER der einzige Reparaturmechanismus, der fähig ist Läsionen zu reparieren, die durch UV Strahlung induziert werden. NER kann man in vier unterschiedliche Schritte aufteilen die zwischen Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Schritt 1 besteht aus der initialen Schadenserkennung, während des zweiten Schrittes wird der mögliche Schaden verifiziert, im dritten Schritt wird der verifizierte Schaden ausgeschnitten und im vierten und letzten Schritt wird die resultierende Lücke in der DNA geschlossen. Es wurde gezeigt, dass XPD in die Schadensverifizierung involviert ist. Ein MAD Versuch, bei dem nur das endogene Eisen des Eisen-Schwefel-Clusters verwendet wurde ermöglichte die Strukturlösung der ersten apo XPD Struktur. Basierend auf der Struktur ergeben sich verschiedene Fragen: wo wird DNA gebunden? Wo wird DNA aufgetrennt? Wie wird Schadenserkennung ermöglicht? Was ist die Rolle des Eisen-Schwefel-Clusters? Diese Fragen werden in dieser Arbeit angesprochen. Strukturbasierte funktionelle Mutagenesestudien, die auf Hypothesen basiert sind, wurden angewendet und mit einer detailierten biochemischen Charakterizierung der Varianten kombiniert. Die Varianten wurden mittels thermischen Entfaltungsstudien analysiert, um die Möglichkeit auszuschliessen, dass die Stabilität durch die Punktmutation betroffen ist. DNA-Bindungs- Assays, ATPase Assays und Helikase Assays wurden durchgeführt um Aminosäurereste zu identifizieren, die für DNA Bindung, Helikase Aktivität und Schadenserkennung wichtig sind. Eine Struktur von XPD, die ein DNA Fragment mit vier Basen enthält, wurde mittels Molekularem Ersatz gelöst. Diese Struktur zeigt die Polarität des translozierenden DNA- Stranges im Verhältnis zu der Helikasestruktur auf. Desweiteren wurden die Eigenschaften des FeS Clusters mittels paramagnetischen Elektronenresonanz Studien untersucht, um Einblicke in die Rolle des FeS Clusters zu bekommen. Ausserdem wurde XPD aus Ferroplasma acidarmanus erforscht, da gezeigt wurde, dass es an CPD enthaltenden Läsionen hängen bleibt. Diese Daten stellen die ersten detailierten Einblicke in den Translokationsmechanismus einer SF2B Helikase dar und zeigen wie Polarität erzielt wird. Das ist eine Basis für weitere Analysen, um die kombinierte Aktion von Helikase und dem 4Fe4S Cluster zu verstehen, die zur Schadenserkennung in der NER Kaskade führt. KW - DNS-Reparatur KW - Helicasen KW - Kristallographie KW - XPD KW - Xeroderma pigmentosum KW - TFIIH KW - Nukleotid-Exzisions-Reparatur KW - X-ray Crystallography KW - XPD KW - TFIIH KW - Nucleotide-Excision-Repair KW - FeS cluster Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67183 ER - TY - THES A1 - Schuster, Beatrice T1 - Genotyping Fanconi Anemia : From Known to Novel Genes -From Classical Genetic Approaches to Next Generation Sequencing T1 - Genotypisierung der Fanconi Anämie N2 - Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS. N2 - Die Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessiv oder X-chromosomal vererbte Erkrankung, deren charakteristisches diagnostisches Merkmal das progressive Versagen des Knochenmarks darstellt. Viele, jedoch nicht alle Patienten leiden zusätzlich an kongenitalen Fehlbildungen, wie Radialstrahl-Anomalien oder Minderwuchs. Im Vergleich zur normalen Bevölkerung steigt zu¬dem im jungen Erwachsenenalter das Risiko für hämatologische und auch solide Tumoren um ein Vielfaches. Verantwortlich hierfür ist sehr wahrscheinlich der zugrunde liegende Defekt in der Reparatur von DNA-Interstrang-Quervernetzungen. Diese Art der Läsion blockiert wich¬tige zelluläre Prozesse wie Transkription und Replikation, und kann daher nicht nur zur Ent¬artung oder vorzeitigen Alterung der Zellen, sondern auch zu stark erhöhten Apoptose-Raten führen. Zur Entfernung dieser Quervernetzungen hat die Evolution ein komplexes Netzwerk an verschiedenen Reparaturwegen hervorgebracht, das nur in Vertebraten vollständig konserviert ist. Der sogenannte FA/BRCA-Reparaturweg ist in der Lage Quervernetzungen an stagnierten Replikationsgabeln zu erkennen und zu entfernen. Heute kennen wir 15 Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O und -P), deren Produkte in diesem Weg involviert sind und deren pathogene Veränderung zur Ausprägung des FA-Phänotyps führen. Rund 80% aller Fälle können durch biallelische Mutationen in FANCA, FANCC und FANCG erklärt werden. Pa¬thogene Varianten in anderen Genen werden weitaus seltener gefunden und ein kleiner Anteil der Patienten kann keiner der bekannten Komplementationsgruppen zugeordnet werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, den ursächlichen genetischen Defekt in diesen Patienten aufzudecken. Untersuchungen an den Kandidatengenen FAN1, MHF1 und MHF2 konnten keine pathoge¬nen Veränderungen identifizieren. FAN1 konnte darüber hinaus gänzlich als Kandidatengen aus¬geschlossen werden, da Patienten mit einer homozygoten FAN1-Deletion keinen FA-Phänotyp zeigten. Im Fall von MHF1 und MHF2 sind Mutationsträger wahrscheinlich sehr selten oder unterscheiden sich in ihrem Phänotyp von den bisher bekannten FA Patienten. Nichtsdestotrotz trug diese Arbeit maßgeblich zur Aufklärung der genetischen Ursache in den Untergruppen FA-O, FA-P und FA-Q bei. Ursächlich für den Subtyp FA-O sind biallelische Mutationen in RAD51C, einem Paralog der Rekombinase RAD51, mit offenbar entscheidender Funktion in der homolo¬gen Rekombinationsreparatur. Da der einzige bislang beschriebene Patient zum Zeitpunkt der Veröffentlichung zwar charakteristische Fehlbildungen, aber weder hämatologische Auffälligkei¬ten, noch maligne Veränderungen zeigte, wird RAD51C (FANCO) bisher als zugrunde liegendes Gen einer FA-ähnlichen Krankheit bezeichnet. Bei der Identifizierung von SLX4 als ursächliches Gen der Untergruppe FA-P gab es hingegen keine Zweifel; alle Patienten zeigten einen sehr ty¬pischen Phänotyp. SLX4 (FANCP) scheint eine entscheidende Rolle bei der Exzision von DNA-Quervernetzungen zu spielen, indem es die Funktion oder richtige Positionierung von Struktur-spezifischen Nukleasen koordiniert. Eine dieser Nukleasen ist das Heterodimer XPF/ERCC1. XPF liegt wahrscheinlich der Komplementationsgruppe FA-Q zugrunde und ist das erste FA-Gen, das mittels Next Generation Sequencing (NGS) identifiziert wurde. Interessanterweise wurde es zuvor bereits als genetische Ursache von Xeroderma pigmentosum und segmentärer Progerie beschrieben. Diese Studie konnte jedoch belegen, dass die jeweiligen Mutationen die Proteinfunktion derart unterschiedlich beeinflussen, dass es tatsächlich zur Ausprägung von drei divergenten Phänotypen kommen kann. Neben der Kandidatengensuche war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Implementierung neuer Techniken für die FA-Genotypisierung. Klassische Methoden der Molekulargenetik sollten hier¬für durch Anwendungen des NGS ergänzt oder gänzlich ersetzt werden. Die Hochdurchsatz- Sequenzierung des gesamten Exoms erwies sich als geeignet und kann Komplementationsgrup¬pen-Zuordnung und Mutationsanalyse in einem Schritt vereinen. Durch die Etablierung einer FA-spezifischen bioinformatischen Datenanalyse konnte im Rahmen dieser Arbeit der genetische Defekt bereits mehrerer Patienten aufgeklärt werden. Im Besonderen konnte ein weiterer Patient der neuen, noch wenig charakterisierten Untergruppe FA-P zugeordnet werden. Insgesamt trug diese Arbeit also nicht nur zur weiteren Vervollständigung des FA/BRCA-Re-paraturweges bei, indem drei neue FA-Gene hinzugefügt wurden; sie zeigte außerdem, dass klas¬sische Methoden der Molekulargenetik sowohl in Forschung als auch Diagnostik künftig durch das NGS ersetzt werden könnten. KW - Fanconi Anämie KW - DNA Reparatur KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi Anemia KW - DNA repair KW - Next generation sequencing Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85515 ER - TY - JOUR A1 - Djuzenova, Cholpon S. A1 - Elsner, Ines A1 - Katzer, Astrid A1 - Worschech, Eike A1 - Distel, Luitpold V. A1 - Flentje, Michael A1 - Polat, Bülent T1 - Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci JF - Radiation Oncology N2 - Background High expression of constitutive histone γ-H2AX, a sensitive marker of DNA damage, might be indicative of defective DNA repair pathway or genomic instability. 53BP1 (p53-binding protein 1) is a conserved checkpoint protein with properties of a DNA double-strand breaks sensor. This study explores the relationship between the clinical radiosensitivity of tumor patients and the expression/induction of γ-H2AX and 53BP1 in vitro. Methods Using immunostaining, we assessed spontaneous and radiation-induced foci of γ-H2AX and 53 BP1 in peripheral blood mononuclear cells derived from unselected breast cancer (BC) patients (n=57) undergoing radiotherapy (RT). Cells from apparently healthy donors (n=12) served as references. Results Non-irradiated cells from controls and unselected BC patients exhibited similar baseline levels of DNA damage assessed by γ-H2AX and 53BP1 foci. At the same time, the γ-H2AX assay of in vitro irradiated cells revealed significant differences between the control group and the group of unselected BC patients with respect to the initial (0.5 Gy, 30 min) and residual (2 Gy, 24 h post-radiation) DNA damage. The numbers of 53BP1 foci analyzed in 35 BC patients were significantly higher than in controls only in case of residual DNA damage. A weak correlation was found between residual foci of both proteins tested. In addition, cells from cancer patients with an adverse acute skin reaction (grade 3) to RT showed significantly increased radiation-induced γ-H2AX foci and their protracted disappearance compared to the group of BC patients with normal skin reaction (grade 0–1). The mean number of γ-H2AX foci after 5 clinical fractions was significantly higher than that before RT, especially in clinically radiosensitive patients. Conclusions The γ-H2AX assay may have potential for screening individual radiosensitivity of breast cancer patients. KW - DNA damage KW - DNA repair KW - Peripheral blood lymphocytes KW - Radiosensitivity KW - DNS-Schädigung KW - DNS-Reparatur Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96110 UR - http://www.ro-journal.com/content/8/1/98 ER - TY - THES A1 - Rohleder, Florian T1 - The Intricate Network of Replication-dependent Interstrand Crosslink DNA Repair T1 - Das komplexe Netzwerk der replikationsabhängigen Reparatur von DNA-Quervernetzungen N2 - The Fanconi anemia (FA) pathway is a replication-dependent DNA repair mechanism which is essential for the removal of interstrand crosslink (ICL) DNA damages in higher eukaryotes (Moldovan and D’Andrea, 2009). Malfunctions in this highly regulated repair network lead to genome instability (Deans and West, 2011). Pathological phenotypes of the disease FA which is caused by mutations in the eponymous pathway are very heterogeneous, involving congenital abnormalities, bone-marrow failure, cancer predisposition and infertility (Auerbach, 2009). The FA pathway comprises a complex interaction network and to date 16 FA complementation groups and associated factors have been identified (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Additionally, components of nucleotide excision repair (NER), homologous recombination repair (HRR), and translesion synthesis (TLS) are involved and coordinated by the FA proteins (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). One of the FA proteins is the DEAH helicase FANCM. In complex with its binding partners FAAP24 and MHF1/2 it binds the stalled replication fork and activates the FA damage response (Wang et al., 2013). However, the exact steps towards removal of the ICL damage still remain elusive. To decipher the underlying process of FA initiation by FANCM, this thesis mainly focuses on the archaeal FANCM homolog helicase-associated endonuclease for fork-structured DNA (Hef). Hef from the archaeal organism Thermoplasma acidophilum (taHef) differs from other archaeal Hef proteins and exclusively comprises an N-terminal helicase entity with two RecA and a thumb-like domain while others additionally contain a nuclease portion at the C-terminus. I solved the crystal structure of full-length taHef at a resolution of 2.43 Å. In contrast to the crystal structure of the helicase domain of Hef from Pyrococcus furiosus (pfHef), taHef exhibits an extremely open conformation (Nishino et al., 2005b) which implies that a domain movement of the RecA-like helicase motor domains of 61° is possible thus highlighting the flexibility of helicases which is required to translocate along the DNA. However, small-angle x-ray scattering (SAXS) measurements confirm an intermediate conformation of taHef in solution indicating that both crystal structures represent rather edge states. Most importantly, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was identified as an interaction partner of Hef. This interaction is mediated by a highly conserved canonical PCNA interacting peptide (PIP) motif. Intriguingly, the presence of PCNA does not alter the ATPase nor the helicase activity of taHef, thus suggesting that the interaction is entirely dedicated to recruit taHef to the replication fork to fulfill its function. Due to a high level of flexibility the taHef-taPCNA complex could not be crystallized and therefore SAXS was utilized to determine a low-resolution model of this quaternary structure. This newly discovered PCNA interaction could also be validated for the eukaryotic FANCM homolog Mph1 from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum (ctMph1). As the first step towards the characterization of this interaction I solved the crystal structure of PCNA from Chaetomium thermophilum (ctPCNA). Furthermore, it was possible to achieve preliminary results on the putative interaction between the human proteins FANCM and PCNA (hsFANCM, hsPCNA). In collaboration with Detlev Schindler (Human Genetics, Würzburg) and Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) co-immunoprecipitation (CoIP) experiments were performed using hsFANCM and hsPCNA expressed in HEK293 cells. Although an interaction was reproducibly observed in hydroxyurea stimulated cells further experiments and optimization procedures are required and ongoing. N2 - Der Fanconi Anämie (FA) Signalweg ist ein replikationsabhängiger DNA-Reparaturmechanismus, der grundlegend zur Beseitigung von DNA-Schäden in Form von intermolekularen Quervernetzungen (ICL) beiträgt (Moldovan and D’Andrea, 2009). Fehlfunktionen in diesem stringent regulierten Reparaturnetzwerk führen somit zu Genominstabilität (Deans and West, 2011). Der pathologische Phänotyp der Krankheit FA, die durch Mutationen in dem gleichnamigen DNA-Reparatur Signalweg verursacht wird, ist sehr heterogen und umfasst angeborene Deformationen, Knochenmarksversagen, eine erhöhte Tumor Disposition sowie Infertilität (Auerbach, 2009). Der FA Mechanismus ist ein komplexes Netzwerk und bisher wurden 16 FA Komplementationsgruppen sowie weitere beteiligte Faktoren identifiziert (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Zusätzlich sind Komponenten der Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER), der homologen Rekombinationsreparatur (HRR) und Transläsionssynthese (TLS) involviert, die durch FA Proteine koordiniert werden (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). Eines der FA Proteine ist die DEAH Helikase FANCM. Im Komplex mit seinen Interaktionspartnern FAAP24 und MHF1/2 bindet FANCM an die durch den ICL Schaden zum Stillstand gekommene Replikationsgabel und aktiviert die FA Schadensantwort (Wang et al., 2013). Die weiteren Schritte, die zur Entfernung des ICL Schadens führen, sind jedoch weitestgehend ungeklärt. Zur Aufklärung der Initiation des FA Mechanismus und der Rolle, die das FANCM dabei spielt, wurde in dieser Arbeit hauptsächlich das archaische FANCM Homolog Helicase-associated Endonuclease for Fork-structured DNA (Hef) analysiert. Hef aus dem archaischen Organismus Thermoplasma acidophilum (taHef) unterscheidet sich von anderen archaischen Hef Proteinen und besteht ausschließlich aus einem N-terminalen Helikase-Abschnitt mit zwei RecA und einer thumb-like Domäne, während andere Hef Proteine am C-Terminus zusätzlich eine Nuklease-Domäne besitzen. Ich habe die Kristallstruktur des taHef Proteins bei einer Auflösung von 2,43 Å gelöst. Im Gegensatz zur Kristallstruktur eines vergleichbaren Hef-Konstruktes aus Pyrococcus furiosus (pfHef) (Nishino et al., 2005b) liegt in taHef eine extrem offene Konformation der beiden RecA-Domänen vor, was impliziert, dass eine Bewegung der RecA-ähnlichen Helikase Motordomänen um 61° möglich ist und zudem die zur Translokation entlang der DNA notwendige Flexibilität von Helikasen verdeutlicht. Messungen mittels Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) deuten hingegen auf eine intermediäre Konformation des taHef Proteins in Lösung hin, wodurch beide Kristallstrukturen als eher Randzustände angesehen werden können. Besonders hervorzuheben ist, dass das Protein Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) als Hef Interaktionspartner identifiziert wurde. Diese Interaktion wird durch ein hoch-konserviertes kanonisches PCNA Interaktionspeptid-Motiv vermittelt. Interessanterweise beeinflusst PCNA aber weder die ATPase noch die Helikase Aktivität von taHef, was darauf hindeutet, dass diese Interaktion nur zur Rekrutierung des Hef Proteins zur Replikationsgabel dient. Wegen des hohen Maßes an Flexibilität konnte der taHef-taPCNA Komplex nicht kristallisiert werden, wohingegen SAXS Messungen erfolgreich waren und ein Model bei niedriger Auflösung konnte erhalten werden. Diese nachgewiesene Interaktion zwischen Hef und PCNA konnte auch für das eukaryotische FANCM Homolog Mph1 aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum (ctMph1) bestätigt werden. Als ersten Schritt zur Charakterisierung dieser Interaktion habe ich die Kristallstruktur von PCNA aus Chaetomium thermophilum (ctPCNA) gelöst. Weiterhin war es möglich, vorläufige Resultate bezüglich der mutmaßlichen Interaktion zwischen den humanen Proteinen FANCM und PCNA (hsFANCM, hsPCNA) zu erhalten. In Kooperation mit Detlev Schindler (Humangenetik, Würzburg) und Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) wurden Co-Immunopräzipitations-Experimente (CoIP) mit humanem FANCM und humanem PCNA aus HEK293-Zellen durchgeführt. Obwohl eine Interaktion in Hydroxyurea-stimulierten Zellen reproduzierbar nachgewiesen werden konnte, sind weitere Experimente notwendig, um diese Interaktion zu charakterisieren. KW - DNS-Reparatur KW - DNA Repair KW - Fanconi Anemia KW - Structural Biology KW - Fanconi-Anämie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113121 ER - TY - THES A1 - Graver, Shannon T1 - Molecular and cellular cross talk between angiogenic, immune and DNA mismatch repair pathways T1 - Molekulare und zellulare Interaktion zwischen Angiogenese, DNA Fehlerreparatur (Mismatch Repair) und Immunologischen Signalwegen N2 - VEGF is a main driver of tumor angiogenesis, playing an important role not only in the formation of new blood vessels, but also acts as a factor for cell migration, proliferation, survival and apoptosis. Angiogenesis is a universal function shared by most solid tumors and its inhibition was thought to have the potential to work across a broad patient population. Clinical evidence has shown that inhibiting pathological angiogenesis only works in a subset of patients and the identification of those patients is an important step towards personalized cancer care. The first approved antiangiogenic therapy was bevacizumab (Avastin®), a monoclonal antibody targeting VEGF in solid tumors including CRC, BC, NSCLC, RCC and others. In addition to endothelial cells, VEGF receptors are present on a number of different cell types including tumor cells, monocytes and macrophages. The work presented in this thesis looked at the in vitro cellular changes in tumor cells and leukocytes in response to the inhibition of VEGF signaling with the use of bevacizumab. In the initial experiments, VEGF was induced by hypoxia in tumor cells to evaluate changes in survival, proliferation, migration and changes in gene or protein expression. There was a minimal direct response of VEGF inhibition in tumor cells that could be attributed to bevacizumab treatment, with minor variations in some of the cell lines screened but no uniform or specific response noted. MMR deficiency often results in microsatellite instability (MSI) in tumors, as opposed to microsatellite stable (MSS) tumors, and accounts for up to 15% of colorectal carcinomas (CRCs). It has been suggested in clinical data that MMR deficient tumors responded better to bevacizumab regimens, therefore further research used isogenic paired CRC tumor cell lines (MMR deficient and proficient). Furthermore, a DNA damaging agent was added to the treatment regimen, the topoisomerase inhibitor SN-38 (the active metabolite of irinotecan). Inhibiting VEGF using bevacizumab significantly inhibited the ability of MMR deficient tumor cells to form anchor dependent colonies, however conversely, bevacizumab treatment before damaging cells with SN-38, showed a significant increase in colony numbers. Moreover, VEGF inhibition by bevacizumab pretreatment also significantly increased the mutation fraction in MMR deficient cells as measured by transiently transfecting a dinucleotide repeat construct, suggesting VEGF signaling may have an intrinsic role in MMR deficient cells. A number of pathways were analyzed in addition to changes in gene expression profiles resulting in the identification of JNK as a possible VEGF targeted pathway. JUN expression was also reduced in these conditions reinforcing this hypothesis, however the intricate molecular mechanisms remain to be elucidated. In order to remain focused on the clinical application of the findings, it was noted that some cytokines were differentially regulated by bevacizumab between MMR proficient and deficient cells. Treatment regimens employed in vitro attempted to mimic the clinical setting by inducing DNA damage, then allowing cells to recover with or without VEGF using bevacizumab treatment. Inflammatory cytokines, CCL7 and CCL8, were found to have higher expression in the MMR deficient cell line with bevacizumab after DNA damage, therefore the cross talk via tumor derived factors to myeloid cells was analyzed. Gene expression changes in monocytes induced by tumor conditioned media showed CCL18 to be a bevacizumab regulated gene by MMR deficient cells and less so in MMR proficient cells. CCL18 has been described as a prognostic marker in gastric, colorectal and ovarian cancers, however the significance is dependent on tumor type. CCL18 primarily exerts its function on the adaptive immune system to trigger a TH2 response in T cells, but is also described to increase non-specific phagocytosis. The results of this study did show an increase in the phagocytic activity of macrophages in the presence of bevacizumab that was significantly more apparent in MMR deficient cells. Furthermore, after DNA damage MMR deficient cells treated with bevacizumab released a cytokine mix that induced monocyte migration in a bevacizumab dependent manner, showing a functional response with the combination of MMR deficiency and bevacizumab. In summary, the work in this thesis has shown evidence of immune cell modulation that is specific to MMR deficient tumor cells that may translate into a marker for the administration of bevacizumab in a clinical setting. VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. N2 - VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. KW - Angiogenesis KW - Immune KW - DNA Mismatch repair KW - Vascular endothelial Growth Factor KW - Inhibition KW - Angiogenese KW - Mismatch KW - DNS-Reparatur KW - Phagozytose Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108302 ER - TY - THES A1 - Wanzek, Katharina T1 - The investigation of the function of repair proteins at G-quadruplex structures in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) revealed that Mms1 promotes genome stability T1 - Die Untersuchung der Funktion von Reparaturproteinen an G-Quadruplex Strukturen in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) zeigte, dass Mms1 Genomstabilität fördert N2 - G-quadruplex structures are highly stable alternative DNA structures that can, when not properly regulated, impede replication fork progression and cause genome instability (Castillo Bosch et al, 2014; Crabbe et al, 2004; Koole et al, 2014; Kruisselbrink et al, 2008; London et al, 2008; Lopes et al, 2011; Paeschke et al, 2013; Paeschke et al, 2011; Piazza et al, 2015; Piazza et al, 2010; Piazza et al, 2012; Ribeyre et al, 2009; Sabouri et al, 2014; Sarkies et al, 2012; Sarkies et al, 2010; Schiavone et al, 2014; Wu & Spies, 2016; Zimmer et al, 2016). The aim of this thesis was to identify novel G-quadruplex interacting proteins in Saccharomyces cerevisiae and to unravel their regulatory function at these structures to maintain genome integrity. Mms1 and Rtt101 were identified as G-quadruplex binding proteins in vitro via a pull-down experiment with subsequent mass spectrometry analysis. Rtt101, Mms1 and Mms22, which are all components of an ubiquitin ligase (Rtt101Mms1/Mms22), are important for the progression of the replication fork following fork stalling (Luke et al, 2006; Vaisica et al, 2011; Zaidi et al, 2008). The in vivo binding of endogenously tagged Mms1 to its target regions was analyzed genome-wide using chromatin-immunoprecipitation followed by deep-sequencing. Interestingly, Mms1 bound independently of Mms22 and Rtt101 to G-rich regions that have the potential to form G-quadruplex structures. In vitro, formation of G-quadruplex structures could be shown for the G-rich regions Mms1 bound to. This binding was observed throughout the cell cycle. Furthermore, the deletion of MMS1 caused replication fork stalling as evidenced by increased association of DNA Polymerase 2 at Mms1 dependent sites. A gross chromosomal rearrangement assay revealed that deletion of MMS1 results in a significantly increased genome instability at G-quadruplex motifs compared to G-rich or non-G-rich regions. Additionally, binding of the helicase Pif1, which unwinds G4 structures in vitro (Paeschke et al, 2013; Ribeyre et al, 2009; Sanders, 2010; Wallgren et al, 2016), to Mms1 binding sites was reduced in mms1 cells. The data presented in this thesis, together with published data, suggests a novel mechanistic model in which Mms1 binds to G-quadruplex structures and enables Pif1 association. This allows for replication fork progression and genome integrity. N2 - Bei G-quadruplex Strukturen handelt es sich um stabile Sekundärstrukturen der DNA, welche das Fortschreiten der Replikationsgabel behindern und Genominstabilität verursachen können, falls sie nicht konsequent reguliert werden (Castillo Bosch et al, 2014; Crabbe et al, 2004; Koole et al, 2014; Kruisselbrink et al, 2008; London et al, 2008; Lopes et al, 2011; Paeschke et al, 2013; Paeschke et al, 2011; Piazza et al, 2015; Piazza et al, 2010; Piazza et al, 2012; Ribeyre et al, 2009; Sabouri et al, 2014; Sarkies et al, 2012; Sarkies et al, 2010; Schiavone et al, 2014; Wu & Spies, 2016; Zimmer et al, 2016). Ziel dieser Doktorarbeit war es, neue Proteininteraktionspartner dieser Strukturen in Saccharomyces cerevisiae zu identifizieren und zu untersuchen, wie diese Proteine die Strukturen regulieren um Genomstabilität zu gewährleisten. Mit Hilfe eines Pulldown Assays und anschließender massenspektrometrischer Analyse wurden Mms1 und Rtt101 in vitro als Interaktionspartner von G-quadruplex Strukturen identifiziert. Rtt101, Mms1 und Mms22, Komponenten der Ubiquitinligase Rtt101Mms1/Mms22, spielen eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Replikationsgabel, falls dieses durch Agenzien gehemmt wurde (Luke et al, 2006; Vaisica et al, 2011; Zaidi et al, 2008). Durch Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung wurden die Bindestellen von Mms1 identifiziert. Interessanterweise hat Mms1 genomweit an G-reiche Sequenzen gebunden. Diese G-reichen Sequenzen bildeten G-quadruplex Strukturen in vitro aus. Die Bindung von Mms1 erfolgte unabhängig von Rtt101 und Mms22 sowie während des gesamten Zellzyklus. Außerdem kam es zu einer Verlangsamung der Replikationsgabel in mms1 Zellen, was durch eine verstärkte Bindung der DNA Polymerase 2 nachgewiesen wurde. Ein gross chromsomal rearrangement assay zeigte, dass die Genominstabilität in mms1 Zellen signifikant erhöht ist, wenn G-quadruplex Motive, im Vergleich zu nicht-G-reichen oder G-reichen Kontrollregionen, vorhanden sind. Zudem war die Bindung der Helikase Pif1, welche G-quadruplex Strukturen in vitro entwindet (Paeschke et al, 2013; Ribeyre et al, 2009; Sanders, 2010; Wallgren et al, 2016), stark reduziert, wenn Mms1 fehlte. Mit Hilfe der in dieser Doktorarbeit gewonnenen Ergebnisse, sowie mit Hilfe publizierter Daten, lässt sich ein Model postulieren, in welchem Mms1 an G-quadruplexe bindet und somit die Bindung von Pif1 ermöglicht. Dadurch werden das Fortschreiten der Replikationsgabel und die Genomstabilität gewährleistet. KW - Quadruplex-DNS KW - DNS-Reparatur KW - genome stability KW - Bierhefe Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142547 ER -