TY  - THES
A1  - Lerch, Maike Franziska
T1  - Characterisation of a novel non-coding RNA and its involvement in polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-mediated biofilm formation of \(Staphylococcus\) \(epidermidis\)
T1  - Charakterisierung einer neuen nicht-kodierenden RNA und deren Beteiligung an der PIA-vermittelten Biofilmbildung von \(Staphylococcus\) \(epidermidis\)
N2  - Coagulase-negative staphylococci, particularly Staphylococcus epidermidis, have been recognised as an important cause of health care-associated infections due to catheterisation, and livestock-associated infections. The colonisation of indwelling medical devices is achieved by the formation of biofilms, which are large cell-clusters surrounded by an extracellular matrix. This extracellular matrix consists mainly of PIA (polysaccharide intercellular adhesin), which is encoded by the icaADBC-operon. The importance of icaADBC in clinical strains provoking severe infections initiated numerous investigations of this operon and its regulation within the last two decades. The discovery of a long transcript being located next to icaADBC, downstream of the regulator gene icaR, led to the hypothesis of a possible involvement of this transcript in the regulation of biofilm formation (Eckart, 2006). Goal of this work was to characterise this transcript, named ncRNA IcaZ, in molecular detail and to uncover its functional role in S. epidermidis. 
The ~400 nt long IcaZ is specific for ica-positive S. epidermidis and is transcribed in early- and mid-exponential growth phase as primary transcript. The promotor sequence and the first nucleotides of icaZ overlap with the 3' UTR of the preceding icaR gene, whereas the terminator sequence is shared by tRNAThr-4, being located convergently to icaZ. Deletion of icaZ resulted in a macroscopic biofilm-negative phenotype with highly diminished PIA-biofilm. Biofilm composition was analysed in vitro by classical crystal violet assays and in vivo by confocal laser scanning microscopy under flow conditions to display biofilm formation in real-time. The mutant showed clear defects in initial adherence and decreased cell-cell adherence, and was therefore not able to form a proper biofilm under flow in contrast to the wildtype. Restoration of PIA upon providing icaZ complementation from plasmids revealed inconsistent results in the various mutant backgrounds. 
To uncover the functional role of IcaZ, transcriptomic and proteomic analysis was carried out, providing some hints on candidate targets, but the varying biofilm phenotypes of wildtype and icaZ mutants made it difficult to identify direct IcaZ mRNA targets. Pulse expression of icaZ was then used as direct fishing method and computational target predictions were executed with candidate mRNAs from aforesaid approaches. The combined data of these analyses suggested an involvement of icaR in IcaZ-mediated biofilm control. Therefore, RNA binding assays were established for IcaZ and icaR mRNA. A positive gel shift was maintained with icaR 3' UTR and with 5'/3' icaR mRNA fusion product, whereas no gel shift was obtained with icaA mRNA. From these assays, it was assumed that IcaZ regulates icaR mRNA expression in S. epidermidis. S. aureus instead lacks ncRNA IcaZ and its icaR mRNA was shown to undergo autoregulation under so far unknown circumstances by intra- or intermolecular binding of 5' UTR and 3' UTR (Ruiz de los Mozos et al., 2013). Here, the Shine-Dalgarno sequence is blocked through 5'/3' UTR base pairing and RNase III, an endoribonuclease, degrades icaR mRNA, leading to translational blockade. In this work, icaR mRNA autoregulation was therefore analysed experimentally in S. epidermidis and results showed that this specific autoregulation does not take place in this organism. An involvement of RNase III in the degradation process could not be verified here. GFP-reporter plasmids were generated to visualise the interaction, but have to be improved for further investigations.
In conclusion, IcaZ was found to interact with icaR mRNA, thereby conceivably interfering with translation initiation of repressor IcaR, and thus to promote PIA synthesis and biofilm formation. In addition, the environmental factor ethanol was found to induce icaZ expression, while only weak or no effects were obtained with NaCl and glucose. Ethanol, actually is an ingredient of disinfectants in hospital settings and known as efficient effector for biofilm induction. As biofilm formation on medical devices is a critical factor hampering treatment of S. epidermidis infections in clinical care, the results of this thesis do not only contribute to better understanding of the complex network of biofilm regulation in staphylococci, but may also have practical relevance in the future.
N2  - Koagulase-negative Staphylokokken besiedeln die menschliche und tierische Haut, sowie die Schleimhäute. Durch Läsionen oder das Einbringen von medizinischen Instrumenten wie Kathetern gelangen sie in tiefere Hautschichten oder die Blutbahn und können dort schwerwiegende Infektionen auslösen, vor Allem bei Risikopersonen. Besonders Staphylococcus epidermidis hat sich als Verursacher von nosokomialen Infektionen, aber auch als Pathogen in der Tierhaltung etabliert. Die Bakterien bilden bei der Besiedlung sogenannte Biofilme aus (d.h. eine Akkumulation der Keime, die von einer extrazellulären Matrix umgeben sind). Diese Matrix besteht neben Proteinen und eDNA hauptsächlich aus einem Polysaccharid, dem interzellulären Adhäsin PIA (engl.: polysaccharide intercellular adhesin). Dieses wird durch die Ica-Proteine synthetisiert, die im icaADBC-Operon (engl.: intercellular adhesin operon) kodiert sind. Das Operon hat große Bedeutung in klinischen Stämmen und wurde daher innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte eingehend untersucht, auch im Hinblick auf seine Regulation. In der unmittelbaren Umgebung des icaADBC-Operons, stromabwärts des icaR Gens, das für den Repressor des ica-Operons (IcaR) kodiert, wurde ein großes Transkript identifiziert, von dem vermutet wird, dass es möglicherweise an der Regulation der Biofilmbildung beteiligt ist (Eckart, 2006). Ziel dieser Arbeit war es, dieses Transkript zu charakterisieren und seine Funktion in S. epidermidis aufzudecken.
Die nicht-kodierende RNA, genannt IcaZ, hat eine Länge von ~400 nt und ist spezifisch für ica-positive S. epidermidis. Sie wird in der frühen bis mittleren exponentiellen Phase temperaturabhängig exprimiert. Stromaufwärts überlappt das icaZ-Gen und dessen Promotor mit der 3' UTR vom icaR-Gen. Stromabwärts wird das icaZ-Gen vom einem Transkriptionsterminator begrenzt, der auch für das tRNAThr-4-Gen benutzt wird, das auf dem gegenüberliegenden Strang in Richtung des icaZ-Gens lokalisiert ist. Die Deletion der RNA führte zu einem makroskopisch sichtbaren Biofilm-negativen Phänotyp mit deutlich verminderter PIA Bildung. Die Biofilmzusammensetzung wurde in vitro mittels eines klassischen Kristallviolett-Assays gemessen und die Biofilmbildung in vivo in Echtzeit mittels konfokaler Mikroskopie (CLSM) betrachtet. Dabei wurde mit einer peristaltischen Pumpe ein Mediumfluss appliziert. Die Mutante zeigte klare Defekte in der initialen Adhärenz und in der Zell-Zell Adhäsion. Sie bildete im Gegensatz zum Wildtyp keinen strukturierten Biofilm aus. Zur Komplementierung des Biofilms wurde die IcaZ von einem Plasmid exprimiert und die Biofilmzusammensetzung nach 18-20 Stunden Wachstum gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen in den verschiedenen Mutanten waren nicht eindeutig.
Um die Funktion von IcaZ aufzudecken, wurden Transkriptom- und Proteomvergleiche zwischen Wildtyp und Mutante gemacht. Diese lieferten einige Hinweise, aber da der metabolische Unterschied eines Biofilmbildners zu einem Nicht-Biofilmbildner zu groß war, wurde eine direktere Methode angewandt, die induzierte Expression (Pulsexpression). Zudem wurden potentielle Interaktionspartner der IcaZ mittels computer-basierter Bindungsvorhersagen analysiert. Die icaR mRNA kristallisierte sich dabei als Target heraus und die Interaktion zwischen IcaZ und icaR mRNA wurde mit Gelshift-Assays (EMSA) untersucht. Eine Bandenverschiebung wurde mit icaR 3' UTR und mit dem icaR-5'-3' UTR-Fusionsprodukt detektiert, wohingegen keine Interaktion zwischen IcaZ und icaA mRNA stattfand. Aufgrund dieser Assays wurde vermutet, dass IcaZ die Translation von icaR in S. epidermidis reguliert. In S. aureus fehlt die nicht-kodierende RNA IcaZ und für icaR mRNA wurde eine Autoregulation gezeigt, bei der die icaR 5' UTR mit der icaR 3' UTR intramolekular oder intermolekular durch Basenpaarung interagiert, wodurch die Shine-Dalgarno Sequenz blockiert wird und es aufgrund dessen zu einer Hemmung der Translation kommt. Die Umweltfaktoren, die dazu führen sind bisher unbekannt. Der Komplex wird durch eine Endoribonuklease, RNase III, abgebaut (Ruiz de los Mozos et al., 2013). In S. epidermidis wurde eine solche Interaktion theoretisch ausgeschlossen. Experimentelle Analysen dieser Arbeit haben gezeigt, dass diese Autoregulation in S. epidermidis nicht stattfinden kann und es wird angenommen, dass IcaZ diese Regulation übernimmt. Um die Interaktion zu visualisieren wurden GFP-Reporter Plasmide generiert, die aber für weitere Experimente noch zu verbessern sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IcaZ mit der icaR mRNA interagiert, was höchstwahrscheinlich zu einer Hemmung der Translation des Repressors IcaR führt und damit letztlich PIA-Synthese und Biofilmbildung positiv reguliert. Zusätzlich wurde gefunden, dass Ethanol die Expression der IcaZ-RNA induziert, während NaCl nur schwache Effekte zeigte und Glucose keinen Einfluss auf die Expression von icaZ hatte. Ethanol ist ein Bestandteil von Desinfektionsmitteln, die in Krankenhäusern verwendet werden und ist bekannt dafür Biofilmbildung auszulösen. Da die Bildung von Biofilmen auf medizinischen Geräten kritisch ist und diese die Behandlung von S. epidermidis Infektionen erschweren, tragen die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur zu einem besseren Verständnis des komplexen Netzwerks der Biofilmregulation bei, sondern haben möglicherweise auch praktischen Nutzen in der Zukunft.
KW  - Biofilm
KW  - Staphylococcus epidermidis
KW  - Non-coding RNA
KW  - Hospitalismus <Hygiene>
KW  - icaADBC
KW  - Nosocomial Infections
KW  - Polysaccharide intercellular adhesin (PIA)
KW  - Biofilm formation
KW  - non-coding RNA
KW  - ncRNA
KW  - Nosokomiale Infektionen
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155777
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bauchart, Philippe Michel Paul
T1  - Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC
T1  - Evaluierung des Zoonotischen Risikos von Escherichia coli Stämmen assoziiert mit Extraintestinalen Infektionen bei Menschen und Tieren. Charakterisierung Neuer Virulenzfaktoren von ExPEC
N2  - Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.
N2  - Vogelpathogene Escherichia coli (APEC) sind eine Untergruppe der sogenannten extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC), welche Infektionen außerhalb des Verdauungstraktes beim Menschen und vielen Tieren verursachen können. ExPEC sind durch eine Vielzahl Virulenz-assoziierter Faktoren charakterisiert, die zur Pathogenese beitragen können. Haupt-Virulenzfaktoren, die eine eindeutige Zuordnung zu diesem Pathotyp erlauben, wurden jedoch noch nicht identifiziert. Die Virulenz bei ExPEC und somit auch bei APEC scheint auf der kombinierten Expression von Virulenzfaktoren zu beruhen. Beide Pathotypen können daher nicht eindeutig aufgrund des Genomgehaltes sowie molekularer Epidemiologie voneinander unterschieden werden. In der vorliegenden Arbeit sollten Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede bei ausgewählten APEC- und humanen ExPEC-Isolaten des gleichen Serotyps untersucht werden, um nähere Hinweise auf ein Zoonoserisiko zu erhalten oder um Faktoren zu charakterisieren, die zur Wirtsspezifität beitragen können. Vergleichende Analysen des Genomgehaltes zeigten, dass diese Varianten nicht aufgrund (i) genereller Phänotypen, (ii) ihrer Phylogenie, (iii) der Anwesenheit typischer Virulenz-assoziierter Gene sowie (iv) pathoadaptiver Mutationen voneinander unterschieden werden können. Interessanterweise wurden bei manchen Isolaten Allelvariationen in Genen beobachtet, die für Adhäsine wie MatB und CsgA sowie für ihre Regulatoren (MatA und CsgD) kodieren. Ihre mögliche Bedeutung für die Virulenz muß jedoch weiter analysiert werden. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich eng verwandte Vogel- und humane ExPEC-Isolate hinsichtlich ihrer Genexpression unterscheiden. Um zu untersuchen, ob die Körpertemperatur des Menschen (37 °C) oder von Geflügel (41 °C) einen unterschiedlichen Einfluß auf die bakterielle Genexpression hat und somit zur Wirtsspezifität beitragen kann, wurden die Transkriptome des APEC-Stammes BEN374 und des humanen ExPEC-Stammes IHE3034 nach Anzucht in vitro bei 37 °C bzw. 41 °C miteinander verglichen. Wachstum bei 41 °C führte nur bei wenigen Genen zu einer Induktion der Genexpression, wohingegen die Anzahl der reprimierten Gene bei dieser Temperatur in beiden Stämmen deutlich höher war und vor allem auf eine reduzierte Beweglichkeit und Chemotaxis hindeutete. Die Ergebnisse von vergleichender Genomik, Transkriptomik und Phänotypisierung humaner ExPEC- und APEC-Stämme unterstützen somit die Annahme, dass es ein Zoonoserisiko zwischen manchen APEC- und humanen ExPEC-Isolaten gibt. Im dritten Teil dieser Arbeit stand die Charakterisierung der Mat Fimbrien- Expression in E. coli sowie ihre Rolle bei der Infektion im Mittelpunkt. Der Vergleich der kodierenden matABCDEF Determinanten im E. coli K-12 Stamm MG1655 und im humanen ExPEC O18:K1 Isolat IHE3034 zeigte Unterschiede in (i) der jeweiligen Nukleotidsequenz, (ii) der Anwesenheit von Transkriptionsstartpunkten und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sowie (iii) der Struktur der „Upstream“-Region des Genclusters auf, die zur unterschiedlichen Fimbrienexpression in beiden Stämmen beitragen können. Eine Repression der Mat Fimbrienexpression durch das H-NS Protein wurde nachgewiesen. Zudem wurde gezeigt, dass Mat Fimbrien signifikant zur Biofilmbildung beitragen, wohingegen ein Beitrag zur in vivo-Virulenz nicht festgestellt wurde. Interessanterweise beeinflusste der MatA Regulator, aber auch die Mat Fimbrien- Strukturgene, die Flagellenexpression: die Abwesenheit von matA bzw. von matBCDEF führte in beiden E. coli Stämmen zu einer Induktion der Flagellenexpression und Motilität. Der zugrundeliegende Mechanismus ist noch unbekannt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass es eine beträchtliche Überlappung des Genomgehaltes und der Phänotypen bei ExPEC-Stämmen, die von Menschen oder Tieren isoliert wurden, gibt. Das Vorhandensein eines gemeinsamen Virulenzgenpools, ihre Phylogenie und ähnliche Genexpressionsprofile legen nahe, dass ein Zoonoserisiko von APEC-Isolaten ausgehen kann. Die Identifizierung bislang unbekannter Virulenzfaktoren humaner ExPEC-Stämme kann sich daher auch auf das Verständnis der Pathogenese von APEC-Isolaten auswirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen auch, wie am Beispiel der Mat Fimbrien gezeigt, dass unterschiedliche E. coli-Phänotypen nicht nur auf einen unterschiedlichen Genomgehalt, sondern auch auf die unterschiedliche Regulation konservierter Determinanten zurückgeführt werden kann.
KW  - Escherichia coli
KW  - Virulenzfaktor
KW  - Zoonotisches Risiko
KW  - APEC
KW  - ExPEC
KW  - Mat Fimbrien
KW  - Biofilm
KW  - zoonotic risk
KW  - APEC
KW  - ExPEC
KW  - Mat fimbriae
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848
ER  -