TY  - THES
A1  - Liu, Ruiqi
T1  - Dynamic regulation of the melanocortin 4 receptor system in body weight homeostasis and reproductive maturation in fish
T1  - Dynamische Regulation des Melanocortin-4-Rezeptor Systems bei der Körpergewichtshomöostase und der Fortpflanzungsreifung bei Fischen
N2  - Puberty is an important period of life with physiological changes to enable animals to reproduce. Xiphophorus fish exhibit polymorphism in body size, puberty timing, and reproductive tactics. These phenotypical polymorphisms are controlled by the Puberty (P) locus. In X. nigrensis and X. multilineatus, the P locus encodes the melanocortin 4 receptor (Mc4r) with high genetic polymorphisms. 
Mc4r is a member of the melanocortin receptors, belonging to class A G-protein coupled receptors. The Mc4r signaling system consists of Mc4r, the agonist Pomc (precursor of various MSH and of ACTH), the antagonist Agrp and accessory protein Mrap2. In humans, MC4R has a role in energy homeostasis. MC4R and MRAP2 mutations are linked to human obesity but not to puberty. 
Mc4rs in X. nigrensis and X. multilineatus are present in three allele classes, A, B1 and B2, of which the X-linked A alleles express functional receptors and the male-specific Y-linked B alleles encode defective receptors. Male body sizes are correlated with B allele type and B allele copy numbers. Late-maturing large males carry B alleles in high copy number while early-maturing small males carry B alleles in low copy number or only A alleles. Cell culture co-expression experiments indicated that B alleles may act as dominant negative receptor mutants on A alleles. 
In this study, the main aim was to biochemically characterize the mechanism of puberty regulation by Mc4r in X. nigrensis and X. multilineatus, whether it is by Mc4r dimerization and/or Mrap2 interaction with Mc4r or other mechanisms. Furthermore, Mc4r in X. hellerii (another swordtail species) and medaka (a model organism phylogenetically close to Xiphophorus) were investigated to understand if the investigated mechanisms are conserved in other species. 
In medaka, the Mc4r signaling system genes (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) are expressed before hatching, with agrp1 being highly upregulated during hatching and first feeding. These genes are mainly expressed in adult brain, and the transcripts of mrap2 co-localize with mc4r indicating a function in modulating Mc4r signaling. Functional comparison between wild-type and mc4r knockout medaka showed that Mc4r knockout does not affect puberty timing but significantly delays hatching due to the retarded embryonic development of knockout medaka. Hence, the Mc4r system in medaka is involved in regulation of growth rather than puberty. 
In Xiphophorus, expression co-localization of mc4r and mrap2 in X. nigrensis and X. hellerii fish adult brains was characterized by in situ hybridization. In both species, large males exhibit strikingly high expression of mc4r while mrap2 shows similar expression level in the large and small male and female. Differently, X. hellerii has only A-type alleles indicating that the puberty regulation mechanisms evolved independently in Xiphophorus genus. Functional analysis of Mrap2 and Mc4r A/B1/B2 alleles of X. multilineatus showed that increased Mrap2 amounts induce higher cAMP response but EC50 values do not change much upon Mrap2 co-expression with Mc4r (expressing only A allele or A and B1 alleles). A and B1 alleles were expressed higher in large male brains, while B2 alleles were only barely expressed. Mc4r A-B1 cells have lower cAMP production than Mc4r A cells. Together, this indicates a role of Mc4r alleles, but not Mrap2, in puberty onset regulation signaling. Interaction studies by FRET approach evidenced that Mc4r A and B alleles can form heterodimers and homodimers in vitro, but only for a certain fraction of the expressed receptors. Single-molecule colocalization study using super-resolution microscope dSTORM confirmed that only few Mc4r A and B1 receptors co-localized on the membrane. Altogether, the species-specific puberty onset regulation in X. nigrensis and X. multilineatus is linked to the presence of Mc4r B alleles and to some extent to its interaction with A allele gene products. This is reasoned to result in certain levels of cAMP signaling which reaches the dynamic or static threshold to permit late puberty in large males. 
In summary, puberty onset regulation by dominant negative effect of Mc4r mutant alleles is a special mechanism that is found so far only in X. nigrensis and X. multilineatus. Other Xiphophorus species obviously evolved the same function of the pathway by diverse mechanisms. Mc4r in other fish (medaka) has a role in regulation of growth, reminiscent of its role in energy homeostasis in humans. The results of this study will contribute to better understand the biochemical and physiological functions of the Mc4r system in vertebrates including human.
N2  - Die Pubertät ist ein wichtiger Lebensabschnitt mit physiologischen Veränderungen, die die Fortpflanzung von Tieren ermöglichen. Xiphophorus Fische weisen einen Polymorphismus in Bezug auf Körpergröße, Pubertätszeit und Fortpflanzungstaktik auf. Diese phänotypischen Polymorphismen werden durch den Pubertäts (P) Locus gesteuert. In X. nigrensis und X. multilineatus kodiert der P Locus den Melanocortin-4-Rezeptor (Mc4r) mit hohen genetischen Polymorphismen. 
Mc4r gehört zu den Melanocortin-Rezeptoren, die zur Klasse A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Das Mc4r-Signalsystem besteht aus Mc4r, dem Agonisten Pomc (Prohormon der verschiedenen MSH und des ACTH), dem Antagonisten Agrp und dem akzessorischen Protein Mrap2. Beim Menschen spielt MC4R eine Rolle bei der Energiehomöostase. MC4R und MRAP2 Mutationen stehen im Zusammenhang mit menschlicher Fettleibigkeit, jedoch nicht mit der Pubertät. 
Mc4rs in X. nigrensis und X. multilineatus sind in drei Allelklassen vorhanden, A, B1 und B2, von denen die X-chromosomalen A Allele funktionelle Rezeptoren exprimieren und die spezifischen männlichen Y-chromosomalen B Allele für defekte Rezeptoren kodieren. Die männliche Körpergröße korreliert mit dem B Alleltyp und der Kopienzahl des B Allels. Spätreife große Männchen tragen B Allele in hoher Kopienzahl, während frühreife kleine Männchen B Allele in niedriger Kopienzahl oder nur A Allele tragen. Koexpressions-Experimente in Zellkultur zeigten, dass B Allele als dominant negative Mutanten-Rezeptor auf A Allele wirken können. 
In dieser Studie war das Hauptziel die biochemische Charakterisierung des Mechanismus der Pubertätsregulation durch Mc4r in X. nigrensis und X. multilineatus. Dabei wurde untersucht, ob die Regulation durch eine Mc4r Dimerisierung und/oder Mrap2 Interaktion mit Mc4r oder durch andere Mechanismen erfolgt. Des Weiteren wurde Mc4r in X. hellerii (einer anderen Schwertträger Art) und Medaka (ein phylogenetisch naheliegender Modellorganismus von Xiphophorus) untersucht, um zu verstehen, ob die untersuchten Mechanismen in anderen Arten konserviert sind. 
In Medaka werden die Gene des Mc4r Signalsystems (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) vor dem Schlüpfen exprimiert, wobei agrp1 während des Schlüpfens und der ersten Fütterung stark hochreguliert wird. Im adulten Medaka werden diese Gene hauptsächlich im Gehirn exprimiert und die Transkripte von mrap2 und mc4r kolokalisieren, was auf eine Funktion bei der Modulation der Mc4r-Signaltransduktion hinweist. Ein funktionaler Vergleich zwischen Wildtyp- und mc4r-Knockout Medaka zeigte, dass der Mc4r-Knockout das Pubertäts-Timing nicht beeinflusst, das Schlüpfen jedoch aufgrund der verzögerten embryonalen Entwicklung von Knockout-Medaka signifikant verzögert. Daher ist das Mc4r System in Medaka eher an der Regulation des Wachstums als an der Pubertät beteiligt. 
Bei Xiphophorus wurde die Lokalisierung von mc4r und mrap2 in erwachsenen Gehirnen von X. nigrensis und X. hellerii durch in situ Hybridisierung charakterisiert. Bei beiden Spezies zeigen große Männchen eine auffallend hohe Expression von mc4r, während mrap2 bei großen und kleinen Männchen und Weibchen ein ähnliches Expressionsniveau zeigt. Im Gegensatz dazu weist X. hellerii nur Allele vom A-Typ auf, was darauf hinweist, dass sich die Pubertätsregulationsmechanismen in dem Genus Xiphophorus unabhängig voneinander entwickelt haben. Die funktionelle Analyse der Mrap2 und Mc4r A/B1/B2 Allele von X. multilineatus zeigte, dass erhöhte Mrap2-Mengen eine höhere cAMP-Antwort induzieren, die EC50-Werte sich jedoch bei der Mrap2-Coexpression mit Mc4r nicht wesentlich ändern (nur A Allel oder A und B1 Allele). A und B1 Allele wurden in großen männlichen Gehirnen höher exprimiert, während B2 Allele kaum exprimiert wurden. Mc4r A-B1 Zellen haben eine geringere cAMP-Produktion als Mc4r A Zellen. Zusammengenommen deutet dies auf eine Rolle von Mc4r-Allelen, jedoch nicht von Mrap2, bei der Signalgebung zur Regulation des Pubertätsbeginns hin. Interaktionsstudien mit den FRET-Methoden zeigten, dass Mc4r A und B Allele in vitro Heterodimere und Homodimere bilden können, jedoch nur für einen bestimmten Anteil der exprimierten Rezeptoren. Die Einzelmolekül-co-lokalisierungsstudie unter Verwendung von der hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM bestätigte, dass nur wenige Mc4r A und B1 Rezeptoren auf der Membran co-lokalisiert sind. Insgesamt ist die artspezifische Regulation des Pubertätsbeginns bei X. nigrensis und X. multilineatus auf das Vorhandensein von Mc4r B Allelen und teilweise auf deren Interaktion mit Genprodukten des A Allels zurückzuführen. Dies wird dadurch begründet, dass ein bestimmtes cAMP Niveau (statische oder dynamische Schwelle) erreicht werden muss, um die Pubertät einzuleiten. In großen Männchen wird dieses cAMP Niveau später erreicht und so die Pubertät später eingeleitet. 
Zusammenfassend ist die Regulation des Pubertätsbeginns durch die dominante negative Wirkung von mutierten Mc4r Allelen ein spezieller Mechanismus, der bisher nur bei X. nigrensis und X. multilineatus zu finden ist. Andere Xiphophorus Arten haben offensichtlich durch andere Mechanismen die gleiche Funktion des Signalwegs entwickelt. In anderen Fischen (Medaka) spielt Mc4r eine Rolle bei der Regulation des Wachstums und erinnert an seine Rolle bei der Energie-Homöostase beim Menschen. Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, die biochemischen und physiologischen Funktionen des Mc4r-Systems bei Wirbeltieren, einschließlich Menschen, besser zu verstehen.
KW  - Japankärpfling
KW  - Mc4r
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Pubertät
KW  - Molekularbiologie
KW  - GPCR
KW  - Mrap2
KW  - Medaka
KW  - Xiphophorus
KW  - Puberty
KW  - Growth
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206536
ER  - 
TY  - THES
A1  - Surrey, Verena
T1  - Identification of affected cellular targets, mechanisms and signaling pathways in a mouse model for spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1)
T1  - Identifizierung betroffener zellulärer Zielmoleküle, Mechanismen und Signalwege in einem Maus-Modell für spinale Muskelatrophie mit Ateminsuffizienz Typ 1 (SMARD1)
N2  - Spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1) is a fatal monogenic motoneuron disease in children with unknown etiology caused by mutations in the immunoglobulin μ-binding protein 2 (IGHMBP2) gene coding for DNA/RNA ATPase/helicase. Despite detailed knowledge of the underlying genetic changes, the cellular mechanisms leading to this disease are not well understood. In the Nmd2J ("neuromuscular disorder") mouse, the mouse model for the juvenile form of SMARD1 patients, in which similar pathological features as diaphragmatic paralysis and skeletal muscle atrophy are observed. Ex vivo studies in Nmd2J mice showed that loss of the motor axon precedes atrophy of the gastrocnemius muscle and does not correlate with neurotransmission defects in the motor endplate. The already described independent myogenic anomalies in the diaphragm and heart of the Nmd2J mouse raised the question whether spinal motoneuron degeneration develops cell autonomously. Ighmbp2 is predominantly localized in the cytoplasm and seems to bind to ribosomes and polysomes, suggesting a role in mRNA metabolism.
In this Ph.D. thesis, morphological and functional analyses of isolated Ighmbp2-deficient (Ighmbp2-def.) motoneurons were performed to answer the question whether the SMARD1 phenotype results from dysregulation of protein biosynthesis. Ighmbp2-deficient motoneurons show only negligible morphological alterations with respect to a slight increase in axonal branches. This observation is consistent with only minor changes of transcriptome based on RNA sequencing data from Ighmbp2-deficient motoneurons. Only the mRNA of fibroblast growth factor receptor 1 (Fgfr1) showed significant up-regulation in Ighmbp2-deficient motoneurons. Furthermore, no global aberrations at the translational level could be detected using pulsed SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell culture), AHA (L-azidohomoalanine) labeling and SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) methods. However, a reduced β-actin protein level was observed at the growth cones of Ighmbp2-deficient motoneurons, which was accompanied with a reduced level of Imp1 protein, a known β-actin mRNA interactor. Live-cell imaging studies using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed translational down-regulation of eGFPmyr-β-actin 3'UTR mRNA in the growth cones and the cell bodies, although the amount of β-actin mRNA and the total protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons showed no aberrations. This compartment-specific reduction of β-actin protein occurred independently of a non-existent direct IGHMBPF2 binding to β-actin mRNA. Fgfr1, which was upregulated on the RNA level, did not show an increased protein amount in Ighmbp2-deficient motoneurons, whereas a reduced amount could be detected. Interestingly, a correlation could be found between the reduced amount of the Imp1 protein and the increased Fgfr1 mRNA, since the IMP1 protein binds the FGFR1 mRNA and thus could influence the transport and translation of FGFR1 mRNA. In summary, all data suggest that Ighmbp2 deficiency leads to a local but modest disturbance of protein biosynthesis, which might contribute to the motoneuron defects of SMARD1.
N2  - Die spinale Muskelatrophie mit Atemnot Typ 1 (SMARD1) ist eine tödliche, monogene Motoneuron-Erkrankung bei Kindern mit unbekannter Ätiologie. SMARD1 wird durch Mutationen im Immunoglobulin µ-bindenden Protein 2 (IGHMBP2)-Gen verursacht, welches für eine DNA/RNA ATPase/Helikase kodiert. Trotz detaillierter Kenntnisse über die zugrunde liegenden genetischen Veränderungen sind die zellulären Mechanismen, die zu dieser Krankheit führen, nicht gut verstanden. In der Nmd2J („neuromuscular disorder“) Maus, dem Mausmodell für die juvenile Form von SMARD1-Patienten, werden ähnliche pathologische Merkmale wie Diaphragma-Lähmung und Skelettmuskelatrophie beobachtet. Ex vivo-Studien an Nmd2J-Mäusen zeigten, dass der Verlust des motorischen Axons einer Atrophie des Gastrocnemius-Muskels vorausgeht und nicht mit Neurotransmissionsfehlern an der motorischen Endplatte korreliert. Die bereits beschriebenen, unabhängig auftretenden myogenen Anomalien in Zwerchfell und Herz der Nmd2J-Maus führten zu der Frage, ob sich die spinale Motoneuron-Degeneration zellautonom entwickelt. Ighmbp2 ist prädominant im Zytoplasma lokalisiert und scheint an Ribosomen und Polysomen zu binden, was auf eine Rolle im mRNA-Stoffwechsel hindeutet.
In dieser Doktorarbeit wurden morphologische und funktionelle Analysen von isolierten Ighmbp2-defizienten (Ighmbp2-def.) Motoneuronen durchgeführt, um die Frage zu beantworten, ob der SMARD1-Phänotyp aus der Deregulierung der Proteinbiosynthese resultiert. Ighmbp2-defiziente Motoneuronen weisen nur geringfügige morphologische Unterschiede hinsichtlich einer leichten Zunahme der axonalen Verzweigungen auf. Diese Beobachtung steht im Einklang mit nur geringen Veränderungen im Transkriptom basierend auf den RNA-Sequenzierungs-Daten in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Ausschließlich die mRNA des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (Fgfr1) zeigte eine signifikante Hoch-Regulation in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Des Weiteren konnten keine globalen Aberrationen auf der translationalen Ebene mit Hilfe der gepulsten SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in der Zellkultur), AHA (L-Azidohomoalanin)-Markierung und der SUnSET (SUrface SEnsing of Translation) Methoden ermittelt werden. Jedoch konnte eine verringerte β-actin Proteinmenge an den Wachstumskegeln von Ighmbp2-defizienten Motoneuronen beobachtet werden, die von einer Reduktion an Imp1 Protein, einem bekannten β-actin mRNA Interaktor, begleitet wurde. Lebendzell-Bildgebungsstudien mittels Fluoreszenz-Recovery after Photobleaching (FRAP) Untersuchung zeigten eine translatorische Herunter-Regulation der eGFPmyr-β-actin 3‘UTR mRNA in Wachstumskegeln und Zellkörpern, obwohl die Menge an β-actin mRNA und die Gesamt-Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen im Vergleich zu wildtypischen Motoneuronen unverändert war. Diese Kompartiment-spezifische Reduktion von β-actin Protein trat unabhängig von einer nicht vorhandenen direkten IGHMBP2-Bindung an die β-actin mRNA auf. Der auf RNA Ebene hochregulierte Fgfr1 zeigte hingegen keine erhöhte, aber eine verringerte Proteinmenge in Ighmbp2-defizienten Motoneuronen. Interessanterweise konnte ein Zusammenhang zwischen der reduzierten Menge des Imp1 Proteins und der erhöhten FGFR1 mRNA gezogen werden. Da das IMP1 Protein neben der β-actin mRNA ebenfalls die FGFR1 mRNA bindet, könnte es so den Transport und die Translation beeinflussen.
Alle Daten deuten zusammenfassend daraufhin, dass Ighmbp2-Mangel zu einer lokalen und geringen Störung der Proteinbiosynthese führt, die aber durchaus zu den beobachteten Motoneuron-Defekten in SMARD1 beitragen könnte.
KW  - Spinale Muskelatrophie
KW  - Ighmbp2
KW  - Maus
KW  - RNA helicase
KW  - IMP1/ZBP1
KW  - SMARD1
KW  - motoneuron
KW  - translation
KW  - Signalkette
KW  - Molekularbiologie
KW  - Atmungsinsuffizienz
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176386
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dagvadorj, Nergui
T1  - Improvement of T-cell response against WT1-overexpressing leukemia by newly developed anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins
T1  - Verbesserung der T-Zellantwort gegen WT1-überexprimierende Leukämie mit neu entwickelten anti-hDEC205-WT1-Antikörperfusionsproteinen
N2  - Wilms tumor protein 1 (WT1) is a suitable target to develop an immunotherapeutic approach against high risk acute myeloid leukemia (AML), particularly their relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). As an intracellular protein traversing between nucleus and cytoplasm, recombinant expression of WT1 is difficult. Therefore, an induction of WT1-specific T-cell responses is mostly based on peptide vaccination as well as dendritic cell (DC) electroporation with mRNA encoding full-length protein to mount WT1-derived peptide variations presented to T cells. Alternatively, the WT1 peptide presentation could be broadened by forcing receptor-mediated endocytosis of DCs. 
In this study, antibody fusion proteins consisting of an antibody specific to the human DEC205 endocytic receptor and various fragments of WT1 (anti-hDEC205-WT1) were generated for a potential DC-targeted recombinant WT1 vaccine. Anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins containing full-length or major parts of WT1 were not efficiently expressed and secreted due to their poor solubility and secretory capacity. However, small fragment-containing variants: anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were obtained in good yields. 
Since three of these fusion proteins contain the most of the known immunogenic epitopes in their sequences, the anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were tested for their T-cell stimulatory capacities. Mature monocyte-derived DCs loaded with anti-hDEC205-WT191-138 could induce ex vivo T-cell responses in 12 of 16 blood samples collected from either healthy or HSC transplanted individuals compared to included controls (P < 0.01). Furthermore, these T cells could kill WT1-overexpressing THP-1 leukemia cells in vitro after expansion. 
In conclusion, alongside proving the difficulty in expression and purification of intracellular WT1 as a vaccine protein, our results from this work introduce an alternative therapeutic vaccine approach to improve an anti-leukemia immune response in the context of allogeneic HSCT and potentially beyond.
N2  - Für die Entwicklung eines immuntherapeutischen Ansatzes zur Behandlung von hoch Risikopatienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und insbesondere zur Vorbeugung von Rezidiven nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) stellt das Wilms-Tumor-Protein 1 (WT1) ein geeignetes Angriffsziel dar. Die rekombinante Expression von WT1, welches als Transkriptionsfaktor vom Zytosol in den Zellkern transloziert, gestaltet sich äußerst schwierig. WT1-spezifische T-Zellantworten werden daher hauptsächlich mittels Peptidvakzinierung oder Transfektion dendritischer Zellen (DC) mit mRNA, welche das vollständige WT1-Protein kodiert, herbeigeführt. Letzterer Ansatz bietet den Vorteil, dass passierenden T-Zellen eine größere Vielfalt an WT1-Peptidvarianten präsentiert werden kann. Eine verbesserte Peptidpräsentation kann außerdem über eine Optimierung der Rezeptor-vermittelten Endozytose der DCs erzielt werden.
Ziel der folgenden Arbeit war es, ein rekombinantes DC-gerichtetes WT1-Vakzin zu entwickeln. Dazu wurden anti-hDEC205-WT1-Fusionsproteine,  bestehend aus einem Antikörper gegen den humanen DEC205-Endozytoserezeptor und verschiedenen WT1-Fragmenten, konstruiert. Während sich Fusionsproteine, die das vollständige WT1-Protein oder große Teile dessen beinhalteten, aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und schwachen Sekretion kaum exprimieren und aufreinigen ließen, lieferte die Produktion der Fusionsproteine mit kürzeren WT1-Fragmenten,  anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273 und anti-hDEC205-WT1324-371, sehr gute Ausbeuten. Da letztere drei Proteine die meisten bislang bekannten immunogenen WT1-Peptide in ihrer Sequenz enthalten, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur T-Zellstimulation untersucht. Dabei konnte in 12 von 16 Blutproben, die entweder von gesunden Spendern oder SZT-Patienten stammten, gezeigt werden, dass mit anti-hDEC205-WT191-138 beladene, reife, aus Monozyten generierte DCs ex vivo signifikant stärkere T-Zellantworten auslösen als die jeweils mitgeführten Kontrollen (P < 0.01). 
Nach Expansion waren die so aktivierten WT1-spezifischen T-Zellen sogar in der Lage, die WT1-überexprimierende AML-Zelllinie THP-1 in vitro zu lysieren.
In der vorliegenden Arbeit konnten daher nicht nur die bereits bekannten Schwierigkeiten der WT1-Expression und Aufreinigung bestätigt werden, sondern darüber hinaus konnte eine alternative therapeutische Vakzinierungsmethode zur Optimierung der anti-leukämischen Immunantwort im Rahmen einer allogenen SZT entwickelt werden.
KW  - antileukemia vaccine
KW  - Wilms tumor protein 1
KW  - anti-hDEC205-WT1 antibody fusion protein
KW  - dendritic cell-targeting
KW  - Akute myeloische Leukämie
KW  - Immuntherapie
KW  - Molekularbiologie
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149098
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TY  - THES
A1  - Scholl, Christina
T1  - Cellular and molecular mechanisms contributing to behavioral transitions and learning in the honeybee
T1  - Zelluläre und molekulare Mechanismen, die zu Verhaltensänderungen und Lernen in der Honigbiene beitragen
N2  - The honeybee Apis mellifera is a social insect well known for its complex behavior and the ability to learn tasks associated with central place foraging, such as visual navigation or to learn and remember odor-reward associations. Although its brain is smaller than 1mm² with only 8.2 x 105 neurons compared to ~ 20 x 109 in humans, bees still show amazing social, cognitive and learning skills. They express an age – related division of labor with nurse bees staying inside the hive and performing tasks like caring for the brood or cleaning, and foragers who collect food and water outside the hive. This challenges foragers with new responsibilities like sophisticated navigation skills to find and remember food sources, drastic changes in the sensory environment and to communicate new information to other bees. Associated with this plasticity of the behavior, the brain and especially the mushroom bodies (MBs) - sensory integration and association centers involved in learning and memory formation – undergo massive structural and functional neuronal alterations. Related to this background my thesis on one hand focuses on neuronal plasticity and underlying molecular mechanisms in the MBs that accompany the nurse – forager transition. 
In the first part I investigated an endogenous and an internal factor that may contribute to the nurse - forager phenotype plasticity and the correlating changes in neuronal network in the MBs: sensory exposure (light) and juvenile hormone (JH). Young bees were precociously exposed to light and subsequently synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the MBs or respectively hemolymph juvenile hormone (JH) levels were quantified. The results show that light input indeed triggered a significant decrease in MG density, and mass spectrometry JH detection revealed an increase in JH titer. Interestingly light stimulation in young bees (presumably nurse bees) triggered changes in MG density and JH levels comparable to natural foragers. This indicates that both sensory stimuli as well as the endocrine system may play a part in preparing bees for the behavioral transition to foraging.
Considering a connection between the JH levels and synaptic remodeling I used gene knockdown to disturb JH pathways and artificially increase the JH level. Even though the knockdown was successful, the results show that MG densities remained unchanged, showing no direct effect of JH on synaptic restructuring.
To find a potential mediator of structural synaptic plasticity I focused on the calcium-calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in the second part of my thesis. CaMKII is a protein known to be involved in neuronal and behavioral plasticity and also plays an important part in structural plasticity reorganizing synapses. Therefore it is an interesting candidate for molecular mechanisms underlying MG reorganization in the MBs in the honeybee. Corresponding to the high abundance of CaMKII in the learning center in vertebrates (hippocampus), CaMKII was shown to be enriched in the MBs of the honeybee. Here I first investigated the function of CaMKII in learning and memory formation as from vertebrate work CaMKII is known to be associated with the strengthening of synaptic connections inducing long term potentiation and memory formation. The experimental approach included manipulating CaMKII function using 2 different inhibitors and a specific siRNA to create a CaMKII knockdown phenotype. Afterwards bees were subjected to classical olfactory conditioning which is known to induce stable long-term memory. All bees showed normal learning curves and an intact memory acquisition, short-term and mid-term memory (1 hour retention). However, in all cases long-term memory formation was significantly disrupted (24 and 72 hour retention). These results suggests the necessity of functional CaMKII in the MBs for the induction of both early and late phases of long-term memory in honeybees. The neuronal and molecular bases underlying long-term memory and the resulting plasticity in behavior is key to understanding higher brain function and phenotype plasticity. In this context CaMKII may be an important mediator inducing structural synaptic and neuronal changes in the MB synaptic network.
N2  - Die Honigbiene Apis mellifera ist ein soziales Insekt, das bekannt ist für sein komplexes Verhalten und seine Fähigkeiten, Aufgaben in Bezug auf zentrales Sammelverhalten, zum Beispiel visuelle Navigation oder die Assoziation Duft – Belohnung, zu lernen, ist. Obwohl das Bienengehirn kleiner als 1mm² ist und im Vergleich zum dem des Menschen mit ~ 20 x 109 Neuronen nur 8.2 x 105 Neurone besitzt, verfügen Bienen trotzdem über beeindruckende soziale, kognitive und Lernfähigkeiten. Sie praktizieren eine altersabhängige Arbeitsteilung mit Ammen, die im Stock bleiben und Aufgaben wie das Versorgen der Brut übernehmen, und Sammlerinnen, die außerhalb des Stockes Futter und Wasser suchen. Dies fordert die Sammlerinnen zu neuen Aufgaben heraus, zum Beispiel hochentwickelte Navigation, drastischen Änderungen der sensorischen Umwelt, Lernen neuer Assoziationen und die Vermittlung der neuen Informationen an andere Bienen. Diese phänotypische Plastizität geht mit stark strukturellen und funktionell neuronalen Veränderungen im Gehirn und vor allem in den Pilzkörpern – sensorische Integrierungszentren, die an Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sind – einher. Passend dazu liegt ein Schwerpunkt meiner Arbeit darauf, die neuronale Plastizität und die molekularen Mechanismen im Pilzkörper, die mit der Wandlung der Amme hin zur Sammlerin zusammen hängen, zu untersuchen.
Im ersten Teil werden ein endogener und ein interner Faktor, die zum Ammen - Sammlerinnen Übergang und den damit einhergehenden Änderungen im neuronalen Netzwerk beitragen könnten, untersucht: sensorische Input (Licht) und Juvenilhormon (JH). Junge Bienen wurden frühzeitig dem Licht ausgesetzt und anschließend synaptische Komplexe (Mikroglomeruli, MG) in den Pilzkörpern beziehungsweise JH aus der Hämolymphe quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss des Lichts tatsächlich eine plastische Verringerung der MG-Dichte auslöst und massenspektrometrische Messungen eine Zunahme an der JH-Menge in der Hämolymphe zeigen. Interessanterweise führt die Stimulation der jungen Ammen mit Licht zu Änderungen in der MG-Dichte und zu JH-Mengen, die vergleichbar sind mit den Werten bei natürlichen Sammlerinnen sind. Dies weist darauf hin, dass sowohl sensorische Stimuli als auch das Hormonsystem einen Beitrag zu der Vorbereitung der Bienen auf die bevorstehende Verhaltensänderung leisten.
Um eine Verbindung zwischen der JH-Menge und synaptischen Umstrukturierungen in Betracht zu ziehen, habe ich einen Gen-Knockdown eingesetzt, um JH-Signalwege zu manipulieren und dadurch die JH-Menge künstlich zu erhöhen. Obwohl der Knockdown erfolgreich war, zeigen die Ergebnisse keinen direkten Zusammenhang zwischen der JH-Menge und einer synaptischer Umgestaltung.
Um einen möglichen Vermittler von struktureller Plastizität zu finden, habe ich den Fokus im zweiten Teil meiner Arbeit auf die Calcium-Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II (CaMKII) gerichtet. CaMKII ist ein Protein, das für seine Rolle sowohl in neuronaler und Verhaltensplastizität als auch in struktureller Plastizität bekannt ist. Daher ist es ein interessanter Kandidat, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die bei der MG-Umstrukturierung in den Pilzkörpern beteiligt sind. In Übereinstimmung mit dem hohen Vorkommen der CaMKII in Lernzentren in Vertebraten (Hippocampus) kommt CaMKII auch in hohem Maß in den Pilzkörpern der Biene vor. In dieser Arbeit habe ich zuerst die Funktion der CaMKII in Lernvorgängen und bei der Gedächtnisbildung untersucht, da bekannt ist, dass CaMKIII mit verstärkten synaptischen Verbindungen, die Langzeitpotenzierung und Gedächtnisbildung auslösen, in Zusammenhang gebracht wird. Der experimentelle Ansatz beinhaltet die Manipulation der CaMKII mit zwei verschiedenen Inhibitoren und einer spezifische siRNA, um einen CaMKII-Knockdown-Phänotyp zu erzeugen. Alle Substanzen wurden über den medialen Ocellartrakt injiziert, um zu gewährleisten, dass sie den Pilzkörper erreichen. Anschließend wurde eine klassische olfaktorische Konditionierung durchgeführt, die ein stabiles Langzeitgedächtnis induziert. Alle Bienen zeigten ein normales Lernverhalten, Kurzzeitgedächtnis und Mittelzeitgedächtnis (eine Stunde Speicherung) waren intakt. Jedoch war in allen Fällen das Langzeitgedächtnis beschädigt (24 und 72 Stunden Speicherung). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaMKII in den Pilzkörpern essentiell für das Auslösen von frühen und späten Formen des Langzeitgedächtnisses der Biene ist. Die neuronalen und molekularen Grundlagen des Langzeitgedächtnis sind der Schlüssel, um höhere Gehirnfunktionen und phänotypische Plastizität zu verstehen. CaMKII könnte ein wichtiger Vermittler sein, um strukturelle und neuronale synaptische Änderungen im Netzwerk des Pilzkörpers auszulösen.
KW  - Biene
KW  - honeybee
KW  - learning and memory
KW  - division of labor
KW  - Lernen
KW  - Molekularbiologie
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115527
ER  - 
TY  - THES
A1  - Anjana Vaman, Vamadevan Sujatha
T1  - LASP1, a newly identified melanocytic protein with a possible role in melanin release, but not in melanoma progression
T1  - LASP1, ein neu identifiziertes melanozytischen Protein mit einer möglichen Rolle bei der Freisetzung von Melanin, jedoch nicht in Melanomprogression
N2  - LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a nucleocytoplasmic scaffolding protein. LASP1 interacts with various cytoskeletal proteins via its domain structure and is known to participate in physiological processes of cells. In the present study, a detailed investigation of the expression pattern of LASP1 protein in normal skin, melanocytic nevi and melanoma was carried out and the melanocyte–specific function of LASP1 was analyzed. LASP1 protein was identified in stratum basale of skin epidermis and a very high level was detected in nevi, the benign tumor of melanocyte. In the highly proliferative basal cells, an additional distinct nuclear localization of the protein was noted. In different tumor entities, an elevated LASP1 expression and nuclear localization, correlated positively with malignancy and tumor grade. However, LASP1 level was determined to be very low in melanoma and even reduced in metastases. Melanoma is distinguished as the first tumor tested to date – that displayed an absence of elevated LASP1 expression. In addition no significant relation was observed between LASP1 protein expression and clinicopathological parameters in melanoma. 
The epidermal melanin unit of skin comprises of melanocytes and keratinocytes. Melanocytes are specialized cells that synthesize the photo protective coloring pigment, melanin inside unique organelles called melanosomes. The presence of LASP1 in melanocytes is reported for the first time through this study and the existence was confirmed by immunoblotting analysis in cultured normal human epidermal melanocyte (NHEM) and in melanoma cell lines, along with the immunohistostaining imaging in normal skin and in melanocytic nevi. LASP1 depletion in MaMel2 cells revealed a moderate increase in the intracellular melanin level independently of de novo melanogenesis, pointing to a partial hindrance in melanin release. Immunofluorescence images of NHEM and MaMel2 cells visualized co-localization of LASP1 with dynamin and tyrosinase concomitant with melanosomes at the dendrite tips of the cells. Melanosome isolation experiments by sucrose density gradient centrifugation clearly demonstrated the presence of LASP1 and the melanosome specific markers tyrosinase and TRP1 in late stage melanosomes.
The study identified LASP1 and dynamin as novel binding partners in melanocytes and provides first evidence for the existence of LASP1 and dynamin (a protein well–known for its involvement in vesicle formation and budding) in melanosomes. Co-localization of LASP1 and dynamin along the dendrites and at the tips of the melanocytes indicates a potential participation of the two proteins in the membrane vesicle fission at the plasma membrane.
In summary, a possible involvement of LASP1 in the actin–dynamin mediated membrane fission and exocytosis of melanin laden melanosome vesicles into the extracellular matrix is suggested.
N2  - LIM und SH3 protein 1 (LASP1) ist ein nukleozytoplasmatischen Gerüstprotein. LASP1 interagiert über seine Domänenstruktur mit verschiedenen Zytoskelettproteinen und ist an physiologischen Prozessen wie Migration und Zellproliferation beteiligt. In der vorliegenden Studie wurde eine detaillierte Untersuchung des Expressionsmusters von LASP1 in normale Haut, Nävi und Melanom durchgeführt und die Melanozyten-spezifische Funktion des Proteins analysiert.
LASP1 konnte durch immunhistologische Färbungen im Stratum basale der Epidermis und in hoher Konzentration in Nävi (gutartige Tumore der Melanozyten) nachgewiesen werden, während die Expression in Melanom und Metastasen sehr gering ist. Auch wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen der LASP1 Proteinexpression in Melanomen und den klinisch-pathologischen Parametern bei 58 Patienten festgestellt. Dies steht im Gegensatz zu allen bisher getesteten Tumoren (u.a. Brust, HCC und Medulloblastom), bei der eine  erhöhte LASP1 Expression in den Tumoren beobachtet wurde, die mit dem Tumorgrad korrelierte. 
Die hochproliferativen Basalzellen der Epidermis bestehen aus Keratinozyten und Melanozyten und  weisen, im Gegensatz zu Nävi und Melanomzellen, eine deutliche Kernlokalisation des LASP1 Proteins auf. Melanozyten sind spezialisierte Zellen, die das UV-Schutzfarbpigment Melanin in einzigartigen Organellen, genannt Melanosomen, synthetisieren. Die Expression von LASP1 in diesen Melanozyten konnte zum ersten Mal in dieser Studie nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzaufnahmen  und Western Blots mit kultivierten normalen menschlichen epidermalen Melanozyten (NHEM) und Melanom-Zelllinien bestätigen die LASP1 Expression. Funktionelle Experimente mit LASP1 depletierten Zellen zeigen eine erhöhte Melaninkonzentration, die unabhängig von der de novo Melanogenese ist. Immunfluoreszenaufnahmen visualisieren eine Ko-Lokalisation von LASP1 mit Tyrosinase an den Melanosomen in den Zellausläufern von pigmentierten MaMel2 Zellen. Eine Auftrennung der einzelnen Melanosomenstadien durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation erlauben die Detektion von LASP1 mit Dynamin,  TRP1 und Tyrosinase in späten Stadium IV Melanosomen. 
Die vorliegende Studie liefert den ersten Beweis für die Existenz von Dynamin (einem für die Vesikelbildung essentiellem Protein) in Melanosomen und identifiziert Dynamin als neuartigen Bindungspartner von LASP1 in Melanozyten. Die Ko-Lokalisierung LASP1 und Dynamin entlang der Dendriten und in den Spitzen der Melanozyten weist auf eine mögliche Beteiligung beider Proteine an der Melanosomen-Vesikel-Abspaltung an der Plasmamembran hin.  
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LASP1 an der Actin-Dynamin vermittelten Exocytose von Melanin-beladenen Melanosomvesikeln in die Extrazellulärmatrix beteiligt ist.
KW  - Melanom
KW  - Melanin
KW  - LASP1
KW  - melanocytic nevi
KW  - melanoma cancer
KW  - Molekularbiologie
KW  - Melanin release
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116316
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kern, Selina Melanie
T1  - Functional characterization of splicing-associated kinases in the blood stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum
T1  - Funktionelle Charakterisierung von Splicing-assoziierten Kinasen in den Blutstadien des Malariaerregers Plasmodium falciparum
N2  - Besides HIV and tuberculosis, malaria still is one of the most devastating infectious diseases especially in developing countries, with Plasmodium falciparum being responsible for the frequently lethal form of malaria tropica. It is a major cause of mortality as well as morbidity, whereby pregnant women and children under the age of five years are most severely affected. Rapidly emerging drug resistances and the lack of an effective and safe vaccine hamper the combat against malaria by chemical and pharmacological regimens, and moreover the poor socio-economic and healthcare conditions in malaria-endemic countries are compromising the extermination of this deadly tropical disease to a large extent. Malaria research is still questing for druggable targets in the parasitic protozoan which pledge to be refractory against evolving resistance-mediating mutations and yet constitute affordable and compliant antimalarial chemotherapeutics. 
The parasite kinome consists of members that represent most eukaryotic protein kinase groups, but also contains several groups that can not be assigned to conservative ePK groups. Moreover, given the remarkable divergence of plasmodial kinases in respect to the human host kinome and the fact that several plasmodial kinases have been identified that are essential for the intraerythrocytic developmental cycle, these parasite enzymes represent auspicious targets for antimalarial regimens. Despite elaborate investigations on several other ePK groups, merely scant research has been conducted regarding the four identified members of the cyclin-dependent kinase-like kinase (CLK) family, PfCLK-1-4. In other eukaryotes, CLKs are involved in mRNA processing and splicing by means of phosphorylation of serine/arginine-rich (SR) proteins, which are crucial components of the splicing machinery in the alternative splicing pathway. All four PfCLKs are abundantly expressed in asexual parasites and gametocytes, and stage-specific expression profiles of PfCLK-1 and PfCLK-2 exhibited nucleus-associated localization and an association with phosphorylation activity. In the course of this study, PfCLK-3 and PfCLK-4 were functionally characterized by indirect immunofluorescence, Western blot analysis and kinase activity assays. These data confirm that the two kinases are primarily expressed in the nucleus of trophozoites and both kinases possess in vitro phosphorylation activity on physiological substrates. Likewise PfCLK-1 and PfCLK-2, reverse genetic studies exhibited the indispensability of both PfCLKs on the asexual life cycle of P. falciparum, rendering them as potential candidates for antiplasmodial strategies. Moreover, this study was conducted to identify putative SR proteins as substrates of all four PfCLKs. Previous alignments revealed a significant homology of the parasite CLKs to yeast SR protein kinase Sky1p. Kinase activity assays showed in vitro phosphorylation of the yeast Sky1p substrate and SR protein Npl3p by precipitated PfCLKs. In addition, four homologous plasmodial SR proteins were identified that are phosphorylated by PfCLKs in vitro: PfASF-1, PFSRSF12, PfSFRS4 and PfSR-1. All four parasite SR splicing factors are predominantly expressed in the nuclei of trophozoites. For PfCLK-1, a co-localization with the SR proteins was verified.
Finally, a library of human and microbial CLK inhibitors and the antiseptic chlorhexidine (CHX) was screened to determine their inhibitory effect on different parasite life cycle stages and on the PfCLKs specifically. Five inhibitors out of 63 compounds from the investigated library were selected that show a moderate inhibition on asexual life cycle stages with IC50 values ranging between approximately 4 and 8 µM. Noteworthy, these inhibitors belong to the substance classes of aminopyrimidines or oxo-β-carbolines. Actually, the antibiotic compound CHX demonstrated an IC50 in the low nanomolar range. Stage-of-inhibition assays revealed that CHX severely affects the formation of schizonts. All of the selected CLKs inhibitors also affect gametocytogenesis as well as gametogenesis, as scrutinized in gametocyte toxicity assays and exflagellation assays, respectively. Kinase activity assays confirm a specific inhibition of CLK-mediated phosphorylation of all four kinases, when the CLK inhibitors are applied on immunoprecipitated PfCLKs. These findings on PfCLK-inhibiting compounds are initial attempts to determine putative antimalarial compounds targeting the PfCLKs. Moreover, these results provide an effective means to generate chemical kinase KOs in order to phenotypically study the role of the PfCLKs especially in splicing events and mRNA metabolism. This approach of functionally characterizing the CLKs in P. falciparum is of particular interest since the malarial spliceosome is still poorly understood and will gain further insight into the parasite splicing machinery.
N2  - Neben HIV und Tuberkulose stellt Malaria vor allem in Entwicklungsländern immer noch eine der verheerendsten Infektionskrankheiten dar, wobei Plasmodium falciparum für die oft tödlich verlaufende Form der Malaria tropica verantwortlich ist. Sie ist eine der Hauptgründe für Mortalität und Morbitität, von der vor allem schwangere Frauen und Kinder unter fünf Jahren am schlimmsten betroffen sind. Das Fehlen eines effektiven und ungefährlichen Impfstoffes und sich schnell ausbreitende Medikamentenresistenzen erschweren die Bekämpfung von Malaria mit Arzneimitteln. Darüber hinaus beeinträchtigen die schlechten sozioökonomischen Bedingungen und der mangelhafte Zustand des Gesundheitssystems in Malaria-endemischen Ländern die Elimination dieser tödlichen Tropenkrankheit in hohem Maße. Die Malariaforschung ist immer noch auf der Suche nach vielversprechenden Angriffspunkten im Parasiten, die widerstandsfähig gegenüber sich entwickelnden resistenz-vermittelnden Mutationen sind und dennoch erschwingliche und verträgliche Chemotherapeutika gegen Malaria darstellen. 
Das Kinom des Parasiten besteht aus Vertretern der meisten eukaryotischen Proteinkinase-Gruppen und enthält zudem einige Gruppen, die keiner der konventionellen Gruppen zuordenbar sind. Darüber hinaus stellen Kinasen vielversprechende Angriffspunkte für Malariamedikamente dar, da das Parasitenkinom bemerkenswerte Divergenzen gegenüber dem Wirtskinom aufweist und zudem einige Parasitenkinasen identifiziert wurden, die unerlässlich für den Replikationszyklus von asexuellen Parasiten sind. Trotz umfangreicher Untersuchungen anderer Kinasegruppen des Parasiten wurden die vier identifizierten Vertreter der Zyklin-abhängige-Kinase-ähnlichen Kinasen (cyclin-dependent kinase-like kinases, CLKs) bisher kaum untersucht. In anderen Eukaryoten sind CLKs an der mRNA-Prozessierung und am Spleißen durch die Phosphorylierung von Serin/Arginin-reichen (SR-) Proteinen beteiligt, welche wiederum Komponenten der Spleißmaschinerie sind. Alle vier PfCLKs sind abundant exprimiert in asexuellen Parasiten sowie Gametozyten, und stadien-spezifische Expressionsprofile von PfCLK-1 und PfCLK-2 zeigten eine Kern-assoziierte Expression sowie Phosphorylierungsaktivität in in vitro-Aktivitätsstudien. Im Verlauf dieser Studie wurden PfCLK-3 und PfCLK-4 mittels indirekter Immunfluoreszenzstudien, Western Blot-Analysen und Kinaseaktivitätsassays funktionell charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass beide Kinasen vorrangig im Nukleus von P. falciparum-Trophozoiten lokalisiert sind und Phosphorylierungsaktivität gegenüber physiologischen Substraten in vitro aufweisen. Ähnlich wie für PfCLK-1 und PfCLK-2 konnte in Reverse-Genetik-Studien gezeigt werden, dass sowohl PfCLK-3 als auch PfCLK-4 essentiell für den asexuellen Replikationszyklus von P. falciparum sind. Dieser Umstand macht beide Kinasen zu potenziellen Angriffspunkten für antiplasmodiale Bekämpfungsstrategien. Des Weiteren wurde diese Studie ausgeführt, um mögliche Interaktionspartner aller vier PfCLKs zu identifizieren. Vorangegangene Sequenzabgleiche brachten eine bemerkenswerte Homologie der Parasiten-CLKs zur SR-Proteinkinase Sky1p der Bäckerhefe zu Tage. Kinaseaktivitätsassays zeigten Phosphorylierung des Sky1p-Substrates und SR-Proteins Npl3p durch präzipitierte PfCLKs in vitro. Außerdem wurden vier homologe plasmodiale SR-Proteine bzw. mutmaßliche Spleißfaktoren identifiziert, die ebenso von den PfCLKs in vitro phosphoryliert werden: PfASF-1, PFSRSF12, PfSFRS4 und PfSR-1. Alle vier Parasiten-Spleißfaktoren sind vorwiegend in Kernen von Trophozoiten exprimiert. Für PfCLK-1 konnte eine Ko-Lokalisation mit den SR-Proteinen nachgewiesen werden. 
Abschließend wurden eine Sammlung humaner und mikrobieller CLK-Inhibitoren sowie das Antiseptikum Chlorhexidin (CHX) auf ihren hemmenden Effekt auf verschiedene Lebenszyklusstadien von P. falciparum und gezielt auf die PfCLKs überprüft. Es wurden fünf Inhibitoren aus einer Sammlung von 63 Substanzen auserwählt, die eine moderate Hemmung auf asexuelle Lebenszyklusstadien aufwiesen, mit IC50-Werten zwischen ungefähr 4 und 8 µM. Das Antibiotikum CHX zeigte sogar einen IC50-Wert im niedrigen nanomolaren Bereich. Nachfolgende Stage-of-Inhibition-Assays deckten auf, dass CHX die Entwicklung von Schizonten enorm beeinträchtigt. Wie in Gametozyten-Toxizitätsassays und Exflagellationsassays ermittelt wurde, hemmen alle ausgewählten CLK-Inhibitoren ferner sowohl die Gametozytogenese als auch die Gametogenese. Kinaseaktivitätsassays bestätigen eine spezifische Hemmung der CLK-vermittelten Phosphorylierung aller vier Kinasen, wenn die CLK-Inhibitoren auf immunopräzipitierte PfCLKs angewendet wurden. Diese Erkenntnisse über PfCLK-hemmende Substanzen sind erste Ansätze, um mögliche Wirkstoffe gegen Malaria zu finden, die die PfCLKs als Angriffspunkte haben. Zudem stellen diese Resultate ein wirksames Mittel zur Verfügung, um chemische Kinase-Knockout-Parasiten zu generieren. Diese können dann verwendet werden, um die Rolle der PfCLKs vor allen in Bezug auf Spleißvorgänge und mRNA-Metabolismus phänotypisch zu untersuchen. Der Ansatz, die CLKs des Parasiten funktionell zu charakterisieren, ist von besonderem Interesse, da das Spleißosom des Malariaparasiten immer noch nicht ausreichend erforscht ist. Dadurch können weitere Erkenntnisse über die Spleißmaschinerie des Parasiten gewonnen werden.
KW  - Plasmodium falciparum
KW  - Malaria tropica
KW  - Posttranskriptionelle Regulation
KW  - Kinasen
KW  - Splicing
KW  - SR proteins
KW  - Molekularbiologie
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115219
ER  -