TY - THES A1 - Beitzinger, Christoph T1 - Binding-, Blocking- and Translocation-Processes Concerning Anthrax-Toxin and Related Bacterial Protein-Toxins of the AB7-Family T1 - Charakterisierung von Bindungs-, Blockierungs- und Translokationsprozessen am Anthrax-Toxin und verwanten Toxinen der AB7-Gruppe N2 - Bacterial protein toxins belong to the most potent toxins which are known. They exist in many different forms and are part of our every day live. Some of them are spread by the bacteria during infections and therefore play a crucial role in pathogenicity of these strains. Others are secreted as a defense mechanism and could be uptaken with spoiled food. Concerning toxicity, some of the binary toxins of the AB7-type belong to the most potent and dangerous toxins in the world. Even very small amounts of these proteins are able to cause severe symptoms during an infection with pathogen species of the genus Clostridium or Bacillus. Apart from the thread the toxins constitute, they exhibit a unique way of intoxication. Members of the AB7-toxin family consist of a pore-forming subunit B, that acts as a molecular syringe to translocate the enzymatic moieties A into the cytosol of target cells. This complex mechanism does not only kill cells with high efficiency and therefore should be studied for treatment, but also displays a possibility to address certain cells with a specific protein cargo if used as a molecular delivery tool. Concerning both issues, binding and translocation of the channel are the crucial steps to either block or modify the system in the desired way. To gain deeper insight into the transport of binary toxins the structure of the B subunit is of great importance, but being a membrane protein, no crystal could be obtained up to now for either protective antigen (PA) of Anthrax toxin or any other AB7-type binding domain. Therefore, the method of choice in this work is an electro-physical approach using the so-called black-lipid-bilayer system for determination of biophysical constants. Additionally, diverse cell based assays serve as a proving method for the data gained during in vitro measurements. Further information was gathered with specially designed mutants of the protein channel. The first part of this thesis focuses on the translocation process and its possible use as a molecular tool to deliver protein cargo into special cell types. The task was addressed by measuring the binding of different effector proteins related and unrelated to the AB7 toxin family. These proteins were tested in titration experiments for the blockage of the ion current through a membrane saturated with toxin channels. Especially the influence of positively charged His-tags has been determined in detail for PA and C2II. As described in chapter 2, a His-tag transferred the ability of being transported by PA, but not by C2II, to different proteins like EDIN (from S. aureus) in vitro and in cell-based experiments. This process was found to change the well-known voltage-dependency of PA to a huge extend and therefore is related to membrane potentials which play a crucial role in many processes in living cells. Chapter 3 sums up findings, which depict that binding partners of PA share certain common motives. These could be detected in a broad range of substrates, ranging from simple ions in an electrolyte over small molecules to complex protein effectors. The gathered information could be further used to design blocker-substrates for treatment of Anthrax infections or tags, which render PA possible as a molecular syringe for cargo proteins. The deeper insight to homologies and differences of binary toxin components is the core of chapter 4, in which the cross-reactivity of Anthrax and C2-toxin was analyzed. The presented results lead to a better understanding of different motives involved in binding and translocation to and via the B components PA and C2II, as well as the enzymatically active A moieties edema factor (EF), lethal factor (LF) and C2I. In the second part of the thesis, the blockage of intoxication is the center of interest. Therefore, chapter 5 focuses on the analysis of specially designed blocker-substrate molecules for PA. These molecules form a plug in the pore, abolishing translocation of the enzymatic units. Especially, if multi-resistant strains of Anthrax (said to be already produced in Russia as a biological weapon) are taken into consideration, these substrates could stop intoxication and buy time, to deal with the infection. Chapter 6 describes the blockage of PA-channels by anti-His antibody from the trans-side of the porin, an effect which was not described for any other antibody before. Interestingly, even mutation of the estimated target amino acid Histidine 310 to Glycine could not interfere with this ionic strength dependent binding. N2 - Bakterielle Protein-Toxine gehören zu den wirksamsten bekannten Toxinen. In vielfältigen Variationen findet man sie in allen Bereichen des Lebens. Einige werden von den Bakterien während einer Infektion freigesetzt und übernehmen einen wichtigen Part in der Pathogenität. Andere werden zu Verteidigungszwecken sekretiert und können in verdorbenen Lebensmitteln gefunden werden. Was die Wirkung binärer Toxine der AB7-Gruppe angeht, so gehören diese zu den potentesten und gefährlichsten Giften weltweit. Selbst kleine Mengen dieser Proteine können schwerste Symptome während einer Infektion mit Bakterien der Gattung Clostridium oder Bacillus verursachen. Abgesehen von der Bedrohung die durch die Toxine ausgeht, zeichnen sie sich durch einen einzigartigen Intoxikationsmechanismus aus. AB7-Toxine sind aus einer porenformenden Domäne B, die als eine Art molekulare Injektionskanüle fungiert, und enzymatisch aktiven Proteinen A zusammengesetzt. Der komplexe Wirkmechanismus ermöglicht es nicht nur Zellen in höchst effektiver Weise abzutöten und sollte deswegen zu Behandlungszwecken untersucht werden, sondern könnte auch als molekulares Werkzeug umfunktioniert werden, um spezielle Zellen mit gewünschten Proteinen zu beladen. Für beide Zwecke (Blockierung und gezielter Transport) ist die Bindung an, und der Transport durch die porenformende Domäne von größter Bedeutung. Die Struktur der B-Domäne ist wichtig um tiefere Einsicht in den Transportprozess der binären Toxine zu ermöglichen. Leider ist es bisher nicht gelungen die Kristallstruktur des Membranproteins protective antigen (PA) von Anthrax oder irgendeiner anderen Bindedomäne eines AB7-Toxins zu lösen. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein elektrophysiologischer Ansatz zur Bestimmung der biophysikalischen Konstanten des Prozesses gewählt, die Black-lipid-Bilayer Methode. Zusätzliche Versuche an Zellen und mit Mutanten der Proteine dienen zur Absicherung der in vitro Ergebnisse. Im ersten Teil der Arbeit wird der Translokationsmechanismus, und die mögliche Nutzung dessen als molekulares Werkzeug näher behandelt. Dies erfolgte durch Bindungsstudien an PA und C2II mit Effektoren (sowohl aus der AB7-Familie, als auch nicht näher verwandt). In Kapitel 2 wird beschrieben, dass ein His-Tag es EDIN (von S. aureus) und anderen Effektoren ermöglicht, dass ein Transport durch PA-Poren in vitro und in vivo stattfindet (nicht aber durch C2II). Ebenfalls konnte eine starke Abweichung in der bekannten Spannungsabhängigkeit von PA festgestellt werden, die den Prozess eindeutig mit den Membranpotentialen in Verbindung bringt, die häufig eine wichtige Rolle im Metabolismus spielen. Kapitel 3 fasst zusammen, dass Bindungspartner von PA bestimmte Motive beinhalten, die von Substraten wie Ionen in Elektrolyten, über kleine Moleküle, bis hin zu komplexen Proteinen reichen. Diese Erkenntnisse könnten genutzt werden um Blockersubstanzen zur Behandlung von Anthrax, oder Tags zur Aufnahme durch Anthrax zu designen. Neueste Befunde zu Homologien und Unterschieden zwischen den Komponenten der binären Toxine sind der Kern von Kapitel 4, in dem die Kreuzreaktivität von Anthrax und C2-Toxin analysiert wurde. Die enthaltenen Daten ermöglichen einen tieferen Einblick in die verschiedenen Stufen der Bindung und Translokation des edema factor (EF), des lethal factor (LF) und von C2I an und durch PA und C2II. Im zweiten Teil rückt die Blockierung der Intoxikation in den Fokus. Die Analyse speziell designter Blockersubstanzen für PA wird in Kapitel 5 behandelt. Diese formen einen Porenverschluss, der weiteren Transport von Toxinkomponenten verhindert. Eine besondere Bedeutung könnten diese Substanzen im Zusammenhang mit Multiresitenz bei Anthrax Stämmen (vermutlich in Russland als biologische Waffe hergestellt) zur Verhinderung von Symptomen und der Verlängerung der Zeit spielen, die man hat um neue Antibiotika zu erzeugen. Kapitel 6 beschreibt zum ersten Mal die Blockierung von PA-Poren mittels eines Anti-His Antikörpers von der trans-Seite aus. Interessanterweise trat diese Ionenstärke abhängige Blockierung, auch bei einer Histidin zu Glycin Mutation an der Stelle 310 (vermutete Bindeposition) auf. KW - Bacillus anthracis KW - Translokation KW - Toxin KW - Protective antigen KW - Bindungsprozess KW - Black-lipid-bilayer KW - Bacillus anthracis KW - protective antigen KW - Anthrax Toxin KW - translocation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70052 ER - TY - JOUR A1 - Chen, Nanhai G. A1 - Yu, Yong A. A1 - Zhang, Qian A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Replication efficiency of oncolytic vaccinia virus in cell cultures prognosticates the virulence and antitumor efficacy in mice JF - Journal of Translational Medicine N2 - Background: We have shown that insertion of the three vaccinia virus (VACV) promoter-driven foreign gene expression cassettes encoding Renilla luciferase-Aequorea GFP fusion protein, beta-galactosidase, and beta-glucuronidase into the F14.5L, J2R, and A56R loci of the VACV LIVP genome, respectively, results in a highly attenuated mutant strain GLV 1h68. This strain shows tumor specific replication and is capable of eradicating tumors with little or no virulence in mice. This study aimed to distinguish the contribution of added VACV promoter-driven transcriptional units as inserts from the effects of insertional inactivation of three viral genes, and to determine the correlation between replication efficiency of oncolytic vaccinia virus in cell cultures and the virulence and antitumor efficacy in mice Methods: A series of recombinant VACV strains was generated by replacing one, two, or all three of the expression cassettes in GLV 1h68 with short non coding DNA sequences. The replication efficiency and tumor cell killing capacity of these newly generated VACV strains were compared with those of the parent virus GLV-1h68 in cell cultures. The virus replication efficiency in tumors and antitumor efficacy as well as the virulence were evaluated in nu/nu (nude) mice bearing human breast tumor xenografts. Results: we found that virus replication efficiency increased with removal of each of the expression cassettes. The increase in virus replication efficiency was proportionate to the strength of removed VACV promoters linked to foreign genes. The replication efficiency of the new VACV strains paralleled their cytotoxicity in cell cultures. The increased replication efficiency in tumor xenografts resulted in enhanced antitumor efficacy in nude mice. Similarly, the enhanced virus replication efficiency was indicative of increased virulence in nude mice. Conclusions: These data demonstrated that insertion of VACV promoter-driven transcriptional units into the viral genome for the purpose of insertional mutagenesis did modulate the efficiency of virus replication together with antitumor efficacy as well as virulence. Replication efficiency of oncolytic VACV in cell cultures can predict the virulence and therapeutic efficacy in nude mice. These findings may be essential for rational design of safe and potent VACV strains for vaccination and virotherapy of cancer in humans and animals. KW - Recombinant vaccinia KW - Nude-mice KW - Cancer KW - GLV-1H68 KW - Therapy KW - Agent KW - Regression KW - Carcinoma KW - Deletion KW - Protein KW - modulation of virus replication KW - GI-101A tumor xenografts KW - oncolytic virotherapy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142268 VL - 9 IS - 164 ER - TY - THES A1 - Gan, Qiang T1 - Investigation on Distinct Roles of Smad Proteins in Mediating Bone Morphogenetic Proteins Signals T1 - Untersuchung auf Unterschiedliche Rollen von Smad Proteinen in der Signalübertragung der Knochenmorphogenetischen Proteine N2 - Knochenmorphogenetische Proteine (engl. Bone morphogenetic Proteins, BMPs) sind eine Bestandteil von transforming growth factor-β (TGF-β)-Superfamilie und spielen wichtige Rollen in zahlreichen biologischen Ereignissen in der Entwicklung fast aller mehrzelligen Organismen. Fehlregulierte BMP-Signalweg ist die zugrunde liegenden Ursachen von zahlreichen erblichen und nicht erblichen Krankheiten wie Krebs. Die von BMP induziete breite Palette von biologischen Reaktionen konvergiert auf drei eng verwandten Smad Proteine. Sie vermitteln intrazelluläre Signale von BMP-Rezeptoren in den Zellkern. Die Spezifität des BMP-Signalwegs wurde intensiv auf der Ebene der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen erforscht, aber, wie die verschiedenen Smad Proteine die durch BMPs hervorgerufen differenziellen Signale beitragen, bleibt unklar. In dieser Arbeit haben wir die BMP / Smad Signalweg in verschiedenen Aspektenuntersucht. Auf der Suche nach einem geeigneten Fluoreszenz-Reporter im Zebrafisch, verglichen wir verschiedene photo-schaltbaren Proteine und fand EosFP der beste Kandidat für diesen Modellorganismus im Bezug auf seine schnelle Reifung und Fluoreszenz-Intensität. Wir haben durch molekulare Modifizierung geeignete Vektoren erstellt, die Tol2-Transposon basieren trangenesis im Zebrafisch zu ermöglichen. Damit wurden schließlich transgenzebrafisch-Linien erzeugt. Wir kombinierten Fluoreszenz-Protein-Tagging mit hochauflösender Mikroskopie und untersuchten die Dynamik der Smad-Proteine in Modellsystem Zebrafisch. Es wurde beobachteten, dass Smad5 Kern-Translokation erfährt, als BMP Signalgeber bei Zebrafisch Gastrulation. Wir erkundeten die Beteiligung der Smad Proteine während der Myogenese-zu-Osteogenese Umwandlung von C2C12 Zelllinie, die durch BMP4 induziert wurde. Mit siRNA versuchten wir die endogene Smad Proteine niederzuschlagen, wobei die Auswirkungen auf diesen gekoppelten noch unterschiedlichen Verfahren durch quantitative real-time PCR und Terminal-Marker Färbung ausgewertet. Wir spekulieren, dass verschiedene Smad-Komplex Stöchiometrie für unterschiedliche durch BMPs hervorgerufe zelluläre Signale verantwortlich sein könnte. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and play important roles in numerous biological events in the development of almost all multi-cellular organisms. Dysregulated BMP signaling is the underlying causes of numerous heritable and non-heritable human diseases including cancer. The vast range of biological responses induced by BMPs converges on three closely related Smad proteins that convey intracellular signals from BMP receptors to the nucleus. The specificity of BMP signaling has been intensively investigated at the level of ligand-receptor interactions, but how the different Smad proteins contribute to differential signals elicited by BMPs remains unclear. In this work, we investigated the BMP/Smad signaling in different aspects. In search for an appropriate fluorescence reporter in zebrafish, we compared different photo-switchable proteins and found EosFP the best candidate this model system for its fast maturation and fluorescence intensity. We modified and created appropriate vectors enabling Tol2-transposon based trangenesis in zebrafish, with which transgenic zebrafish lines were generated. We combined fluorescence protein tagging with high resolution microscopy and investigate the dynamics of Smad proteins in model system zebrafish. We observed that Smad5 undergoes nucleo-translocation as BMP signal transmitter during zebrafish gastrulation. We explored the Smad involvement during myogenic-to-osteogenic conversion of C2C12 cell line induced by BMP4. We created transient loss-of-function of Smads by siRNA-mediated knockdowns and analyzed the effects on these coupled yet distinct procedures by quantitative real-time PCR and terminal marker staining. We found that different Smad-complex stoichiometry might be responsible for distinct cellular signals elicited by BMPs. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Zebrabärbling KW - Signaltransduktion KW - Bone morphogenetic proteins KW - Smad KW - Signaling KW - Zebrafish KW - Cell line KW - Differentiation KW - Differenzierung KW - Zelllinie KW - Zebrafisch Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71127 ER - TY - JOUR A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Müller, Meike A1 - Adelfinger, Marion A1 - Weibel, Stephanie A1 - Grummt, Friedrich A1 - Zimmermann, Martina A1 - Bitzer, Michael A1 - Heisig, Martin A1 - Zhang, Qian A1 - Yu, Yong A. A1 - Chen, Nanhai G. A1 - Stritzker, Jochen A1 - Lauer, Ulrich M. A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Efficient Colonization and Therapy of Human Hepatocellular Carcinoma (HCC) Using the Oncolytic Vaccinia Virus Strain GLV-1h68 JF - PLOS ONE N2 - Virotherapy using oncolytic vaccinia virus strains is one of the most promising new strategies for cancer therapy. In this study, we analyzed for the first time the therapeutic efficacy of the oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 in two human hepatocellular carcinoma cell lines HuH7 and PLC/PRF/5 (PLC) in cell culture and in tumor xenograft models. By viral proliferation assays and cell survival tests, we demonstrated that GLV-1h68 efficiently colonized, replicated in, and did lyse these cancer cells in culture. Experiments with HuH7 and PLC xenografts have revealed that a single intravenous injection (i.v.) of mice with GLV-1h68 resulted in a significant reduction of primary tumor sizes compared to uninjected controls. In addition, replication of GLV-1h68 in tumor cells led to strong inflammatory and oncolytic effects resulting in intense infiltration of MHC class II-positive cells like neutrophils, macrophages, B cells and dendritic cells and in up-regulation of 13 pro-inflammatory cytokines. Furthermore, GLV-1h68 infection of PLC tumors inhibited the formation of hemorrhagic structures which occur naturally in PLC tumors. Interestingly, we found a strongly reduced vascular density in infected PLC tumors only, but not in the non-hemorrhagic HuH7 tumor model. These data demonstrate that the GLV-1h68 vaccinia virus may have an enormous potential for treatment of human hepatocellular carcinoma in man. KW - Breast-tumors KW - Nude-mice KW - In-vivo KW - Cancer KW - Inhibitor KW - Tissue KW - Agent KW - COX-2 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135319 VL - 6 IS - 7 ER - TY - THES A1 - Gerold, Kay T1 - CTLA4 and CLEC16A in Type 1 Diabetes - Looking behind the association T1 - CTLA4 und CLEC16A in Typ 1 Diabetes - Ein Blick hinter die Assoziation N2 - Type 1 diabetes is an autoimmune disease that leads to the destruction of insulin-producing pancreatic beta cells and consequently to hyperglycemia. In the last 60 years, the prevalence of type 1 diabetes has been increasing constantly and is predicted to continue rising. About 80% of the disease risk is attributable to the genetic variation. Thanks to genome wide association studies the number of known disease-associated polymorphisms climbed from five to 53 in the last 10 years. As these studies reveal possible candidate genes but not underlying mechanisms we strove to take the next step and explore the association of two genes suggested by these studies with type 1 diabetes. As a method of choice we decided to use lentiviral RNAi in non obese diabetic (NOD) mice, a widely-used model for type 1 diabetes, introducing a shRNA directed against the target message into the genome of this mouse strain via a lentivirus. This allowed us to study the partial loss-of-function of the target gene within the context of diabetes, directly seeing its effect on autoimmune mechanisms. In this thesis we examined two different genes in this manner, Ctla4 and Clec16a. A type 1 diabetes associated polymorphism in the CTLA4 gene had been found to alter the splicing ratio of its variants soluble CTLA-4 (sCTLA-4) and full length CTLA-4, the associated allele producing less sCTLA-4 than the protective allele. We mimicked this effect by specifically targeting the sCtla4 mRNA via lentiviral RNAi in the NOD model. As a result we could confirm the reduction of sCTLA-4 to accelerate type 1 diabetes development. Furthermore we could show a function of sCTLA-4 in regulatory T cells, more specifically at least partly in their ability to modulate costimulation by antigen presenting cells. The second candidate gene, Clec16a was targeted with the shRNA in a way that was designed to knock down most splice variants. As the gene function and the effect of the associated SUMMARY 10 polymorphism was unknown, we reasoned this method to be feasible to investigate its role in type 1 diabetes. The knockdown of Clec16a in NOD mice resulted in an almost complete protection from diabetes development that could be attributed to T cells dysfunction. However, as expression patterns and a study of the Drospophila orthologue suggested a possible role of CLEC16A in antigen presentation we also examined antigen presenting cells in the thymus and periphery. Although we did not detect any effect of the knockdown on peripheral antigen presenting cells, thymic epithelial cells were clearly affected by the loss of CLEC16A, rendering them more activated and shifting the ratio of cortical to medullary epithelial cells in favor of cortical cells. We therefore suggest a role of CLEC16A in the selection of T cells, that needs, however, to be further investigated. In this thesis we provided a feasible and fast method to study function of genes and even of single splice variants within the NOD mouse model. We demonstrate its usefulness on two candidate genes associated with type 1 diabetes by confirming and unraveling the cause of their connection to the disease. N2 - Typ 1 Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, bei der es zur Zerstörung von pankreatischen beta-Zellen und daraus folgend zu einer Hyperglykämie kommt. In den letzten 60 Jahren stieg die Diabetes Prävalenz stetig an und Studien sagen voraus, dass sich dieser Trend in Zukunft noch stärker fortsetzen wird. Man geht davon aus, dass ca. 80% des Erkrankungsrisikos für autoimmunen Diabetes genetischer Natur sind. Dank Genom-weiter Assoziationsstudien wurde dieser Beitrag gerade in den letzten zehn Jahren immer weiter aufgeklärt und bis heute wurden 53 mit Typ 1 Diabetes assozierte Polymorphismen identifiziert. Da diese Studien es nur leisten können, mögliche Kandidatengene aufzuzeigen, allerdings keine Aussagen über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen machen können, haben wir es uns zum Ziel gesetzt diesen nächsten Schritt zu gehen und zwei der durch diese Studien vorgeschlagenen Gene auf ihre Rolle in der Typ 1 Diabetes Ätiologie zu untersuchen. Unsere Methode der Wahl war die lentivirale RNA Interferenz im Mausmodell der nonobese diabetic mouse (NOD). Via lentiviralen Vektoren wird die Information für eine shRNA, die an die mRNA des Zielgenes bindet, in das Empfängergenom integriert. Die daraus folgende Herabregulierung der Ziel-mRNA erlaubt es uns den Effekt dieser fehlenden Geninformation auf die Immunregulation zu analysieren. Auf diese Weise wurden in dieser Thesis zwei Kandidatengene untersucht, Ctla4 und Clec16a. Der mit Typ 1 Diabetes assoziierte Polymorphismus im CTLA4 Gen verursacht eine Verschiebung im Splice Verhältnis der beiden Isoformen im Menschen, soluble CTLA-4 (sCTLA-4) und full length CTLA-4, zu Gunsten der full length Variante. Im NOD Mausmodell konnte diese Verschiebung durch eine Einführung einer gegen sCtla4 gerichteten shRNA nachgeahmt werden. In Folge dessen konnten wir bestätigen, dass eine eduzierung der sCTLA-4 Variante die Typ 1 Diabetes Entwicklung beschleunigt. Zudem ZUSAMMENFASSUNG 12 konnten wir eine Rolle von sCTLA-4 in der Funktion von regulatorischen T Zellen, genauer in deren Fähigkeit die Kostimulation durch Antigen präsentierenden Zellen zu modulieren, zeigen. Bei dem zweiten Gen, das in dieser Thesis untersucht wurde handelte sich um Clec16a. Es wurde von einer shRNA herunterreguliert, die den Großteil der Varianten abdeckt, da die Funktion des Genes, sowie die Auswirkungen des assoziierten Polymorphismus unbekannt waren. Der Knockdown von Clec16a in der NOD Maus verursachte einen fast vollständigen Schutz vor Diabetes, der im weiteren Verlauf den T Zellen zugerechnet werden konnte. Allerdings hatten das Expressionsmuster, sowie eine Studie am Drosophila Ortholog ema eine Rolle von CLEC16A in Antigen präsentierenden Zellen impliziert. Folglich untersuchten wir die Möglichkeit, dass diese Zellgruppe in der Peripherie oder im Thymus durch den CLEC16A Mangel beeinträchtigt sein könnten. Tatsächlich wies die Zellgruppe, die im Thymus für die Selektion von T Zellen zuständig ist einen erhöhten Aktivierungsstatus auf, was auf eine modifizierte T Zell Selektion hindeuten könnte. Mit dieser Arbeit konnten wir eine praktikable und schnelle Methode, für die funktionelle Analyse von Genen und sogar einzelnen Splice Varianten, aufzeigen. Wir konnten ihren Nutzen weiterhin an zwei mit Typ 1 Diabetes assoziierten Kandidatengenen unter Beweis stellen, indem wir so die Assoziation bestätigen und Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen werfen konnten. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - Molekulargenetik KW - Type 1 Diabetes Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66617 ER - TY - THES A1 - Hagedorn, Ina T1 - Novel mechanisms underlying arterial thrombus formation: in vivo studies in (genetically modified) mice T1 - Neue Mechanismen der arteriellen Thrombusbildung: in vivo-Studien in (genetisch veränderten) Mäusen N2 - Thrombus formation at sites of vascular lesions is a dynamic process that requires a defined series of molecular events including the action of platelet adhesion/activation receptors, intracellular signal transduction, cytoskeletal rearrangements and activation of plasma coagulation factors. This process is essential to limit post-traumatic blood loss but may also contribute to acute thrombotic diseases such as myocardial infarction and stroke. With the help of genetically modified mice and the use of specific protein inhibitors and receptordepleting antibodies, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying thrombus formation in hemostasis and thrombosis. In the first part of the study, it was shown that von Willebrand Factor (vWF) binding to glycoprotein (GP)Iba is critical for the formation of stable pathological thrombi at high shear rates, suggesting GPIba as an attractive pharmacological target for antithrombotic therapy. The subsequent analysis of recently generated phospholipase (PL)D1-deficient mice identified this enzyme, whose role in platelet function had been largely unknown, as a potential target protein downstream of GPIba. This was based on the finding that PLD1- deficient mice displayed severely defective GPIba-dependent thrombus stabilization under high shear conditions in vitro and in vivo without affecting normal hemostasis. The second part of the thesis characterizes the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing collagen receptor GPVI and the recently identified hemITAM-coupled C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation. Genetic- and antibody-induced GPVI deficiency was found to similarly protect mice from arterial vessel occlusion in three different thrombosis models. These results confirmed GPVI as a promising antithrombotic target and revealed that antibody-treatment had no obvious off-target effects on platelet function. Similarly, immunodepletion of CLEC-2 by treating mice with the specific antibody INU1 resulted in markedly impaired thrombus growth and stabilization under flow in vitro and in vivo. Furthermore, it could be demonstrated that double-immunodepletion of GPVI and CLEC-2 resulted in severely decreased arterial thrombus formation accompanied by dramatically prolonged bleeding times. These data revealed an unexpected redundant function of the two receptors for in vivo thrombus formation and might have important implications for the potential development of anti-GPVI and anti-CLEC-2 antithrombotic agents. The third part of the thesis provides the first functional analysis of megakaryocyte- and platelet-specific RhoA knockout mice. RhoA-deficient mice displayed a defined signaling defect in platelet activation, leading to a profound protection from arterial thrombosis andand ischemic brain infarction, but at the same time also strongly increased bleeding times. These findings identified the GTPase as an important player for thrombus formation in hemostasis and thrombosis. Based on the previous proposal that the coagulation factor (F)XII might represent an ideal target for safe antithrombotic therapy without causing bleeding side effects, the last part of this thesis assesses the antithrombotic potential of the newly generated FXIIa inhibitor rHAInfestin- 4. It was found that rHA-Infestin-4 injection into mice resulted in virtually abolished arterial thrombus formation but no change in bleeding times. Moreover, rHA-Infestin-4 was similarly efficient in a murine model of ischemic stroke, suggesting that the inhibitor might be a promising agent for effective and safe therapy of cardio- and cerebrovascular diseases. N2 - Thrombusbildung an einer verletzten Gefäßstelle ist ein dynamischer Prozess, der ein definiertes Zusammenspiel von Thrombozytenadhäsions-/aktivierungsrezeptoren, intrazellulären Signalen, Zytoskelettumstrukturierungen sowie die Aktivierung von Plasma Koagulationsfaktoren benötigt. Dieser Prozess ist essenziell um Blutungen nach einer Gefäßverletzung zu stoppen, kann aber auch zu akuten thrombotischen Erkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall führen. Mit Hilfe von genetisch veränderten Mäusen und der Verwendung von spezifischen Proteininhibitoren und Rezeptor-depletierenden Antikörpern wurden in der hier vorliegenden Dissertation neue Mechanismen der Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose identifiziert. In dem ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen von Willebrand Faktor (vWF) und Glykoprotein (GP)Iba entscheidend für die Bildung von pathologischen Thromben bei hohen Scherraten ist, was auf die Eignung von GPIba als eine attraktive pharmakologische Zielstruktur (Target) für eine antithrombotische Therapie hindeutet. Die anschließende Analyse von vor kurzem generierten Phospholipase (PL)D1- defizienten Mäusen identifizierte dieses Enzym, dessen Rolle in der Thrombozytenfunktion bislang unbekannt war, als eine mögliches Targetprotein im Signalweg von GPIba. Dies basierte vor allem auf der Erkenntnis, dass PLD1-defiziente Mäuse eine stark gestörte GPIba-abhängige Thrombusstabilisierung unter hohen Scherbedingungen aufwiesen, ohne jedoch dabei die normale Hämostase zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des immunoreceptor tyrosinebased activation motif (ITAM)-gekoppelten Kollagenrezeptors GPVI und des vor kurzem entdeckten hemITAM-gekoppelten C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) für die in vivo Thrombusbildung charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass genetisch- und durch Antikörperinduzierte GPVI-Defizienz Mäuse gleichermaßen vor arteriellem Gefäßverschluss in drei verschiedenen Thrombosemodellen schützt. Diese Ergebnisse bestätigten GPVI als ein viel versprechendes antithrombotisches Target und zeigten, dass eine Antikörperbehandlung in Mäusen keine offensichtlichen unspezifischen Effekte auf die Thrombozytenfunktion hatte. Eine gleichermaßen induzierte Immunodepletion von CLEC-2 durch die Behandlung von Mäusen mit dem spezifischen Antikörper INU1 führte zu deutlich vermindertem Thrombuswachstum und reduzierter Thrombusstabilisierung unter Flussbedingungen in vitro und in vivo. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Doppel-Immunodepletion von GPVI und CLEC-2 zu einer stark reduzierten arteriellen Thrombusbildung führte, die mit dramatisch verlängerten Blutungszeiten einherging. Diese Ergebnisse machten eineunerwartete funktionelle Redundanz der beiden Rezeptoren deutlich und könnten möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf eine eventuelle Entwicklung von anti-GPVI und anti-CLEC-2 antithrombotischen Wirkstoffen haben. Der dritte Teil der Arbeit liefert die erste funktionelle Analyse von Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen RhoA-Knockout Mäusen. RhoA-defiziente Mäuse zeigten einen definierten Signaldefekt in der Thrombozytenaktivierung, der zu einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose und ischämischen Hirninfarkt aber gleichzeitig auch zu stark erhöhten Blutungszeiten führte. Dieses Ergebnis identifizierte die GTPase als einen wichtigen Spieler für die Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose. Basierend auf dem vorausgegangenen Vorschlag, dass der Koagulationsfaktor XII (FXII) ein ideales Target für eine sichere antithrombotische Therapie darstellen könnte, ohne Blutungsnebenwirkungen zu verursachen, untersucht der letzte Teil der Arbeit das antithrombotische Potential des neu generierten FXIIa Inhibitors rHA-Infestin-4. Es konnte gezeigt werden, dass eine Injektion von rHA-Infestin-4 in Mäuse die arterielle Thrombusbildung nahezu aufhob aber Blutungszeiten nicht veränderte. Außerdem war rHAInfestin- 4 gleichermaßen effizient in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls, was darauf schließen lässt, dass der Inhibitor ein vielversprechender Wirkstoff für eine effektive und sichere Therapie von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen sein können KW - Thrombus KW - Gerinnungsfaktor KW - Arterielles Blut KW - Zielstruktur KW - Maus KW - biomedicine KW - cell KW - blood KW - vascular system KW - Allgemeine Zelle KW - Zellkern KW - Blutgefäßsystem KW - Blut-Hirn-Schranke Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85752 ER - TY - JOUR A1 - Hill, Philip J. A1 - Stritzker, Jochen A1 - Scadeng, Miriam A1 - Geissinger, Ulrike A1 - Haddad, Daniel A1 - Basse-Lüsebrink, Thomas C. A1 - Gbureck, Uwe A1 - Jakob, Peter A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Magnetic Resonance Imaging of Tumors Colonized with Bacterial Ferritin-Expressing \(Escherichia\) \(coli\) JF - PLoS ONE N2 - Background: Recent studies have shown that human ferritin can be used as a reporter of gene expression for magnetic resonance imaging (MRI). Bacteria also encode three classes of ferritin-type molecules with iron accumulation properties. Methods and Findings: Here, we investigated whether these bacterial ferritins can also be used as MRI reporter genes and which of the bacterial ferritins is the most suitable reporter. Bacterial ferritins were overexpressed in probiotic E. coli Nissle 1917. Cultures of these bacteria were analyzed and those generating highest MRI contrast were further investigated in tumor bearing mice. Among members of three classes of bacterial ferritin tested, bacterioferritin showed the most promise as a reporter gene. Although all three proteins accumulated similar amounts of iron when overexpressed individually, bacterioferritin showed the highest contrast change. By site-directed mutagenesis we also show that the heme iron, a unique part of the bacterioferritin molecule, is not critical for MRI contrast change. Tumor-specific induction of bacterioferritin-expression in colonized tumors resulted in contrast changes within the bacteria-colonized tumors. Conclusions: Our data suggest that colonization and gene expression by live vectors expressing bacterioferritin can be monitored by MRI due to contrast changes. KW - Blood-brain barrier KW - Gene-expression KW - Salmonella-typhimurium KW - Sugar-transport KW - Breast-tumors KW - MRI reporter KW - Iron-uptake KW - Proteins KW - Therapy KW - Mice Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140920 VL - 6 IS - 10 ER - TY - THES A1 - Joseph, Julie T1 - Studying the role of Th17 cells in autoimmune diabetes and generation of a beta cell reporter mouse by lentiviral transgenesis T1 - Lentivirale transgene Technologie zur Erforschung der Rolle von Th17 Zellen im autoimmunen Diabetes und zur Generierung einer Beta-Zell-Reportermaus N2 - Type 1 diabetes affects around 0.5% of the population in developed countries and the incidence rates have been rising over the years. The destruction of beta cells is irreversible and the current therapy available to patients only manages the symptoms and does not prevent the associated pathological manifestations. The patients need lifelong therapy and intensive research is being carried out to identify ways to eliminate autoimmune responses directed against pancreatic beta cells and to replace or regenerate beta cells. The work presented herein aimed at analyzing the role of the Th17 T cell subset, characterized by secretion of the pro- inflammatory cytokine IL-17A, in autoimmune diabetes and also at generating a beta cell reporter mouse line in the NOD background, the most widely- used mouse model for type 1 diabetes. We generated IL- 17A knockdown (KD) NOD mice, using RNAi in combination with lentiviral transgenesis. We analyzed diabetes frequency in IL-17A deficient mice and found that the loss of IL-17A did not protect the transgenic mice from diabetes. Based on these observations, we believe that Th17 cells do not play a critical role in type 1 diabetes through the IL-17A pathway, though they might still be involved in the disease process through alternate pathways. We also generated NOD and NOD-SCID mice with a transgene that drives the beta cell specific expression of a luciferase reporter gene. We used a lentiviral construct, which combined a luciferase sequence and a short- hairpin RNA (shRNA) expression cassette, allowing gene- knockdown under the beta cell specific rat insulin promoter (RIP). These mice will be of use in studying beta cell phenotypes resulting from the knockdown of target genes, using non- invasive bioimaging. We believe that the generation of these reporter mouse lines for diabetes studies will prove valuable in future investigations. Furthermore, the demonstration that the loss of IL-17A does not alter susceptibility to type 1 diabetes should help clarify the controversial involvement of Th17 cells in this disease. N2 - In Industrieländern erkranken etwa 0,5 % der Bevölkerung an Typ-1-Diabetes und die Krankheitsrate ist in den letzten Jahren angestiegen. Die dabei stattfindende Zerstörung der insulinproduzierenden Beta-Zellen ist irreversibel und die derzeitig verfügbaren Therapien behandeln lediglich Symptome, verhindern die pathologischen Auswirkungen aber nicht. Patienten benötigen daher eine lebenslange Therapie und es wird intensiv daran gearbeitet, Wege zu identifizieren, die die autoimmune Antwort gegen pankreatische Beta-Zellen unterbinden, oder aber Beta-Zellen ersetzen, beziehungsweise regenerieren lassen. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, die Rolle der Th17 T-Zellen, welche durch die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-17A gekennzeichnet sind, in Typ-1- Diabetes zu analysieren. Zusätzlich wurden Reportermauslinien im NOD Hintergrund, dem am weitesten verbreiteten Mausmodell für Typ-1-Diabetes, generiert. Durch RNAi, in Kombination mit lentiviraler transgener Technologie, wurden IL-17A Knockdown (KD) NOD Mäuse generiert. Die Diabeteshäufigkeit in IL-17A defizienten Mäusen wurde mit dem Ergebnis untersucht, dass der Verlust von IL-17A die transgenen Mäuse nicht vor Diabetes schützt. Von dieser Beobachtung ausgehend wurde gefolgert, dass Th17 Zellen zumindest über den IL-17A Signalweg keine entscheidende Rolle bei Typ-1-Diabetes spielen, diese allerdings durch alternative Signalwege durchaus im Krankheitsprozess beteiligt sein könnten. Außerdem wurden NOD und NOD-SCID Mäuse mit einem Transgen, das die Beta-Zell spezifische Expression eines Luciferasereporters steuert, generiert. Hierbei wurde ein lentivirales Konstrukt genutzt, welches sowohl die Luciferase, als auch eine short-hairpin RNA (shRNA) Expressionssequenz beinhaltet, um einen Genknockdown unter Kontrolle des spezifischen Insulinpromotors der Ratte (RIP) zu erlauben. Diese Mäuse werden bei zukünftigen nicht-invasiven bildgebenden Untersuchungen des Beta-Zell Phänotyps, der aus dem Knockdown von Zielgenen resultiert, von großem Nutzen sein. In zukünftigen Untersuchungen wird sich die Generierung dieser Reportermauslininien für Diabetesstudien sicherlich als wertvoll erweisen. Des Weiteren sollte die Erkenntnis, dass der Verlust von IL-17A die Anfälligkeit für Typ-1-Diabetes nicht verändert, zu einem besseren Verständnis der kontrovers diskutierten Beteiligung der Th17 Zellen führen. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - RNS-Interferenz KW - Interleukin 17 KW - Diabetes KW - Insulin KW - type 1 diabetes KW - RNAi KW - Lentiviral transgenesis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66571 ER - TY - THES A1 - May, Frauke T1 - The role of the (hem)ITAM-coupled receptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and Glycoprotein (GP) VI for platelet function: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Die Rolle der (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) und Glykoprotein (GP) VI in der Thrombozytenfunktion: in vitro- und in vivo-Studien in Mäusen N2 - Die Thrombozytenaktivierung und –adhäsion sowie die nachfolgende Thrombusbildung ist ein essentieller Prozess in der primären Hämostase, der aber auch irreversible Gefäßverschlüsse und damit Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen kann. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass der C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) auf der Thrombozytenoberfläche exprimiert wird, jedoch wurde für diesen Rezeptor noch keine Funktion in den Prozessen der Hämostase und Thrombose gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von CLEC-2 in der Thrombozytenfunktion und Thrombusbildung im Mausmodel untersucht. In dem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit dem neu generierten monoklonalen Antikörper INU1, der gegen murines CLEC-2 gerichtet ist, zu dem vollständigen und hochspezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führte, ein Prozess, der als „Immundepletion“ bezeichnet wird. Die CLEC-2-defizienten Thrombozyten waren nicht mehr durch den CLEC-2-spezifischen Agonisten Rhodozytin aktivierbar, während die Aktivierung durch alle anderen getesteten Agonisten nicht beeinträchtigt war. Dieser selektive Defekt führte unter Flussbedingungen ex vivo zu stark verminderter Aggregatbildung der Thrombozyten. Außerdem zeigten in vivo-Thrombosestudien, dass die gebildeten Thromben instabil waren und vermehrt embolisierten. Infolgedessen war die CLEC-2 Defizienz mit einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose verbunden. Außerdem ließ die in INU1-behandelten Mäusen beobachtete variable Verlängerung der Blutungszeit auf einen moderaten hämostatischen Defekt schließen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass CLEC-2 in vitro und in vivo signifikant zur Thrombusstabilität beiträgt und eine essentielle Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose spielt. Daher stellt CLEC-2 eine potentiell neue antithrombotische Zielstruktur dar, die in vivo inaktiviert werden kann. Diese in vivo-Herabregulierung von Thrombozytenoberflächenrezeptoren könnte einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige antithrombotische Therapien darstellen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den Effekt einer Doppelimmundepletion der immunoreceptor tyrosine-based activation motiv (ITAM)- und hemITAM-gekoppelten Rezeptoren Glykoprotein (GP) VI und CLEC-2 auf Hämostase und Thrombose mittels einer Kombination der GPVI- beziehungsweise CLEC-2-spezifischen Antikörper JAQ1 und INU1. Eine Einzeldepletion von GPVI oder CLEC-2 in vivo beeinträchtigte nicht die Expression und Funktion des jeweils anderen Rezeptors. Eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Antikörpern führte jedoch zu dem nachhaltigen Verlust der GPVI- und CLEC-2-vermittelten Signale in Thrombozyten, während andere Signalwege nicht betroffen waren. Im Gegensatz zu den Einzeldefizienzen, wiesen die GPVI/CLEC-2 doppeldefizienten Mäuse einen schwerwiegenden Blutungsphänotyp auf. Außerdem führte die Behandlung zu einer starken Beeinträchtigung der arteriellen Thrombusbildung, die die Effekte der Einzeldefizienzen weit übertraf. Von Bedeutung ist auch, dass gleiche Ergebnisse in Gp6-/- Mäusen gefunden wurden, die mittels INU1-Behandlung CLEC-2-depletiert wurden. Dies veranschaulicht, dass der Blutungsphänotyp nicht durch Sekundäreffekte der kombinierten Antikörperbehandlung hervorgerufen wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass GPVI und CLEC-2 sowohl unabhängig voneinander als auch gleichzeitig in vivo von der Thrombozytenoberfläche herabreguliert werden können und lassen unerwartete redundante Funktionen der beiden Rezeptoren in Hämostase und Thrombose erkennen. Da beide Rezeptoren, GPVI und CLEC-2, als neue antithrombotische Zielstrukturen diskutiert werden, könnten diese Ergebnisse wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von anti-GPVI oder anti-CLEC-2-basierenden Antithrombotika haben. N2 - Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies. KW - Thrombozyt KW - Rezeptor KW - Thrombose KW - Biologie KW - Zelle KW - Biology KW - Cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65383 ER - TY - JOUR A1 - Partho, Halder A1 - Chen, Yi-chun A1 - Brauckhoff, Janine A1 - Hofbauer, Alois A1 - Dabauvalle, Marie-Christine A1 - Lewandrowski, Urs A1 - Winkler, Christiane A1 - Sickmann, Albert A1 - Buchner, Erich T1 - Identification of Eps15 as Antigen Recognized by the Monoclonal Antibodies aa2 and ab52 of the Wuerzburg Hybridoma Library against Drosophila Brain JF - PLoS One N2 - The Wuerzburg Hybridoma Library against the Drosophila brain represents a collection of around 200 monoclonal antibodies that bind to specific structures in the Drosophila brain. Here we describe the immunohistochemical staining patterns, the Western blot signals of one- and two-dimensional electrophoretic separation, and the mass spectrometric characterization of the target protein candidates recognized by the monoclonal antibodies aa2 and ab52 from the library. Analysis of a mutant of a candidate gene identified the Drosophila homolog of the Epidermal growth factor receptor Pathway Substrate clone 15 (Eps15) as the antigen for these two antibodies. KW - neuropil KW - immunohistochemistry techniques KW - gel electrophoresis KW - immunoprecipitation KW - silver staining KW - drosophila melanogaster KW - antigen processing and recognition KW - hybridomas Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137957 VL - 6 IS - 12 ER -