TY - JOUR A1 - Akhoon, Bashir A. A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Tiwari, Sudeep A1 - Rathor, Laxmi A1 - Pant, Aakanksha A1 - Singh, Nivedita A1 - Gupta, Shailendra K. A1 - Dandekar, Thomas A1 - Pandey, Rakesh T1 - C. elegans protein interaction network analysis probes RNAi validated pro-longevity effect of nhr-6, a human homolog of tumor suppressor Nr4a1 JF - Scientific Reports N2 - Protein-protein interaction (PPI) studies are gaining momentum these days due to the plethora of various high-throughput experimental methods available for detecting PPIs. Proteins create complexes and networks by functioning in harmony with other proteins and here in silico network biology hold the promise to reveal new functionality of genes as it is very difficult and laborious to carry out experimental high-throughput genetic screens in living organisms. We demonstrate this approach by computationally screening C. elegans conserved homologs of already reported human tumor suppressor and aging associated genes. We select by this nhr-6, vab-3 and gst-23 as predicted longevity genes for RNAi screen. The RNAi results demonstrated the pro-longevity effect of these genes. Nuclear hormone receptor nhr-6 RNAi inhibition resulted in a C. elegans phenotype of 23.46% lifespan reduction. Moreover, we show that nhr-6 regulates oxidative stress resistance in worms and does not affect the feeding behavior of worms. These findings imply the potential of nhr-6 as a common therapeutic target for aging and cancer ailments, stressing the power of in silico PPI network analysis coupled with RNAi screens to describe gene function. KW - Computer modelling KW - Embryonic induction KW - RNAi Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202666 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Joseph, Julie T1 - Studying the role of Th17 cells in autoimmune diabetes and generation of a beta cell reporter mouse by lentiviral transgenesis T1 - Lentivirale transgene Technologie zur Erforschung der Rolle von Th17 Zellen im autoimmunen Diabetes und zur Generierung einer Beta-Zell-Reportermaus N2 - Type 1 diabetes affects around 0.5% of the population in developed countries and the incidence rates have been rising over the years. The destruction of beta cells is irreversible and the current therapy available to patients only manages the symptoms and does not prevent the associated pathological manifestations. The patients need lifelong therapy and intensive research is being carried out to identify ways to eliminate autoimmune responses directed against pancreatic beta cells and to replace or regenerate beta cells. The work presented herein aimed at analyzing the role of the Th17 T cell subset, characterized by secretion of the pro- inflammatory cytokine IL-17A, in autoimmune diabetes and also at generating a beta cell reporter mouse line in the NOD background, the most widely- used mouse model for type 1 diabetes. We generated IL- 17A knockdown (KD) NOD mice, using RNAi in combination with lentiviral transgenesis. We analyzed diabetes frequency in IL-17A deficient mice and found that the loss of IL-17A did not protect the transgenic mice from diabetes. Based on these observations, we believe that Th17 cells do not play a critical role in type 1 diabetes through the IL-17A pathway, though they might still be involved in the disease process through alternate pathways. We also generated NOD and NOD-SCID mice with a transgene that drives the beta cell specific expression of a luciferase reporter gene. We used a lentiviral construct, which combined a luciferase sequence and a short- hairpin RNA (shRNA) expression cassette, allowing gene- knockdown under the beta cell specific rat insulin promoter (RIP). These mice will be of use in studying beta cell phenotypes resulting from the knockdown of target genes, using non- invasive bioimaging. We believe that the generation of these reporter mouse lines for diabetes studies will prove valuable in future investigations. Furthermore, the demonstration that the loss of IL-17A does not alter susceptibility to type 1 diabetes should help clarify the controversial involvement of Th17 cells in this disease. N2 - In Industrieländern erkranken etwa 0,5 % der Bevölkerung an Typ-1-Diabetes und die Krankheitsrate ist in den letzten Jahren angestiegen. Die dabei stattfindende Zerstörung der insulinproduzierenden Beta-Zellen ist irreversibel und die derzeitig verfügbaren Therapien behandeln lediglich Symptome, verhindern die pathologischen Auswirkungen aber nicht. Patienten benötigen daher eine lebenslange Therapie und es wird intensiv daran gearbeitet, Wege zu identifizieren, die die autoimmune Antwort gegen pankreatische Beta-Zellen unterbinden, oder aber Beta-Zellen ersetzen, beziehungsweise regenerieren lassen. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, die Rolle der Th17 T-Zellen, welche durch die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-17A gekennzeichnet sind, in Typ-1- Diabetes zu analysieren. Zusätzlich wurden Reportermauslinien im NOD Hintergrund, dem am weitesten verbreiteten Mausmodell für Typ-1-Diabetes, generiert. Durch RNAi, in Kombination mit lentiviraler transgener Technologie, wurden IL-17A Knockdown (KD) NOD Mäuse generiert. Die Diabeteshäufigkeit in IL-17A defizienten Mäusen wurde mit dem Ergebnis untersucht, dass der Verlust von IL-17A die transgenen Mäuse nicht vor Diabetes schützt. Von dieser Beobachtung ausgehend wurde gefolgert, dass Th17 Zellen zumindest über den IL-17A Signalweg keine entscheidende Rolle bei Typ-1-Diabetes spielen, diese allerdings durch alternative Signalwege durchaus im Krankheitsprozess beteiligt sein könnten. Außerdem wurden NOD und NOD-SCID Mäuse mit einem Transgen, das die Beta-Zell spezifische Expression eines Luciferasereporters steuert, generiert. Hierbei wurde ein lentivirales Konstrukt genutzt, welches sowohl die Luciferase, als auch eine short-hairpin RNA (shRNA) Expressionssequenz beinhaltet, um einen Genknockdown unter Kontrolle des spezifischen Insulinpromotors der Ratte (RIP) zu erlauben. Diese Mäuse werden bei zukünftigen nicht-invasiven bildgebenden Untersuchungen des Beta-Zell Phänotyps, der aus dem Knockdown von Zielgenen resultiert, von großem Nutzen sein. In zukünftigen Untersuchungen wird sich die Generierung dieser Reportermauslininien für Diabetesstudien sicherlich als wertvoll erweisen. Des Weiteren sollte die Erkenntnis, dass der Verlust von IL-17A die Anfälligkeit für Typ-1-Diabetes nicht verändert, zu einem besseren Verständnis der kontrovers diskutierten Beteiligung der Th17 Zellen führen. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - RNS-Interferenz KW - Interleukin 17 KW - Diabetes KW - Insulin KW - type 1 diabetes KW - RNAi KW - Lentiviral transgenesis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66571 ER - TY - BOOK A1 - Wang, Wen T1 - Validation of shRNA clones for gene silencing in 293FT cells N2 - ... N2 - The goal of the project was to establish knock down of mRNA in human mesenchymal stem cells. Since these cells are difficult to transfect, a viral approach is needed to achieve sufficient expression of e. g. shRNA in a high percentage of cells to allow for an efficient silencing of corresponding mRNAs. For this purpose for every gene product of interest, a number of shRNA clones have to be tested to detect an individual shRNA with sufficient efficacy. Lentiviral systems for shRNA approaches have recently become available. The principal advantage of the lentiviral system is that it allows gene silencing in nondividing cells and therefore expands the usefulness of the RNAi-based gene silencing system. Lentivirus-delivered shRNAs are capable of specific, highly stable and functional silencing of gene expression in a variety of cell types. Since the viral transfection of MSCs is a time consuming process that involves transfection of 293 FT cells plus transduction of target cells, for this thesis the following approach was chosen: genes of interest were checked for expression in 293FT cells by RT-PCR. These gene products can be silenced in 293FT cells simply by transfection of shRNA clones and efficacy was subsequently tested by RT-PCR. Beyond this thesis then the project can proceed with effective clones to transduce primary MSCs with individual shRNA clones identified as effective silencing tool in this thesis. KW - shRNA KW - RNAi KW - .................................................................... KW - shRNA KW - RNAi Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25955 N1 - Aus rechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. ER - TY - THES A1 - Winkler, Ann-Cathrin Nicole T1 - Identification of human host cell factors involved in \(Staphylococcus\) \(aureus\) 6850 infection T1 - Identifizierung von humanen Wirtszellfaktoren die eine Rolle bei der \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infektion spielen N2 - Staphylococcus aureus is both a human commensal and a pathogen. 20%-30% of all individuals are permanently or occasionally carriers of S. aureus without any symptoms. In contrast to this, S. aureus can cause life-threatening diseases e.g. endocarditis, osteomyelitis or sepsis. Here, the increase in antibiotic resistances makes it more and more difficult to treat these infections and hence the number of fatalities rises constantly. Since the pharmaceutical industry has no fundamentally new antibiotics in their pipeline, it is essential to better understand the interplay between S. aureus and the human host cell in order to find new, innovative treatment options. In this study, a RNA interference based whole genome pool screen was performed to identify human proteins, which play a role during S. aureus infections. Since 1,600 invasion and 2,271 cell death linked factors were enriched at least 2 fold, the big challenge was to filter out the important ones. Here, a STRING pathway analysis proved to be the best option. Subsequently, the identified hits were validated with the help of inhibitors and a second, individualised small interfering RNA-based screen. In the course of this work two important steps were identified, that are critical for host cell death: the first is bacterial invasion, the second phagosomal escape. The second step is obligatory for intracellular bacterial replication and subsequent host cell death. Invasion in turn is determining for all following events. Accordingly, the effect of the identified factors towards these two crucial steps was determined. Under screening conditions, escape was indirectly measured via intracellular replication. Three inhibitors (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) could be identified for the invasion process. In addition, siRNAs targeted against 16 different genes (including CAPN2, CAPN4 and PIK3CG), could significantly reduce bacterial invasion. Seven siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) were able to inhibit intracellular replication significantly. Further studies showed that the IP3 receptor inhibitor 2-APB, the calpain inhibitor calpeptin and the proteasome inhibitor MG-132 are able to prevent phagosomal escape and as a consequence intracellular replication and host cell death. In this context the role of calpains, calcium, the proteasome and the mitochondrial membrane potential was further investigated in cell culture. Here, an antagonistic behaviour of calpain 1 and 2 during bacterial invasion was observed. Intracellular calcium signalling plays a major role, since its inhibition protects host cells from death. Beside this, the loss of mitochondrial membrane potential is characteristic for S. aureus infection but not responsible for host cell death. The reduction of membrane potential can be significantly diminished by the inhibition of the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger. All together, this work shows that human host cells massively contribute to different steps in S. aureus infection rather than being simply killed by bacterial pore-forming toxins. Various individual host cell factors were identified, which contribute either to invasion or to phagosomal escape and therefore to S. aureus induced cytotoxicity. Finally, several inhibitors of S. aureus infection were identified. One of them, 2-APB, was already tested in a sepsis mouse model and reduced bacterial load of kidneys. Thus, this study shows valuable evidence for novel treatment options against S. aureus infections, based on the manipulation of host cell signalling cascades. N2 - Staphylococcus aureus kann sowohl ein Bestandteil der natürlichen Hautflora als auch ein Krankheitserreger sein. 20%-30% aller Menschen werden, permanent oder zeitweise, von S. aureus besiedelt, ohne Krankheitssymptome aufzuweisen. Im Gegensatz dazu kann S. aureus lebensbedrohliche Krankheiten wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Sepsis verursachen. Diese Infektionen können immer schlechter behandelt werden, da immer mehr Stämme Resistenzen gegen die vorhandenen Antibiotika aufweisen. Dies führt zu einer steigenden Anzahl an Todesfällen, die auf Staphylokokkeninfektionen zurückzuführen sind. Da die Pharmaindustrie keine grundlegend neuen Antibiotika kurz vor der Marktreife hat, ist ein besseres Verständnis für das Wechselspiel zwischen Staphylokokken und ihren menschlichen Wirtszellen unbedingt notwendig, um neue, innovative Behandlungsmöglichkeiten finden zu können. Dafür wurde in dieser Arbeit ein genomweiter RNA-interferenz basierter Screen durchgeführt. Es sollten so die Proteine identifiziert werden, die eine Rolle bei der Staphylokokkeninfektion spielen. Da 1.600 invasionsrelevante und 2.271 zelltodrelevante Faktoren mindestens 2-fach angereichert waren, musste ein Weg gefunden werden die wichtigen Faktoren herauszufiltern. Eine STRING-Pathwayanalyse stellte sich als die beste Methode hierfür heraus. In einem zweiten Schritt wurden die so identifizierten Faktoren mit Inhibitoren oder einzelnen siRNAs ein weiteres Mal herunterreguliert, um ihre tatsächlichen Auswirkungen auf den Infektionsverlauf zu untersuchen. Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dem S. aureus induzierten Wirtszelltod mindestens zwei wichtige Schritte vorausgehen müssen. Erstens die Invasion der Wirtszelle und zweitens der Ausbruch aus dem Phagosom. Nur so können sich im dritten Schritt die Bakterien intrazellulär vermehren und die Zelle töten. Daher wurde der Einfluss der identifizierten Faktoren auf diese beiden entscheidenden Prozesse untersucht. Der Ausbruch wurde unter Screenkonditionen indirekt über die intrazelluläre Vermehrung bestimmt. Es konnten drei Inhibitoren (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) identifiziert werden, die die bakterielle Invasion vermindern. Darüber hinaus wurden 16 Proteine (unter anderem CAPN2, CAPN4 und PIK3CG) gefunden, deren Herunterregulation durch siRNAs, eine signifikant reduzierte Invasion zur Folge hatten. Sieben siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) waren in der Lage die intrazelluläre Vermehrung signifikant zu verringern. In nachfolgenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass der IP3-Rezeptorinhibitor 2-APB, der Calpaininhibitor Calpeptin und der Proteasominhibitor MG-132 den Ausbruch aus dem Phagosom, sowie die darauffolgenden Ereignisse (intrazelluläre Vermehrung und Wirtszelltod) inhibieren können. In diesem Zusammenhang wurden die Einflüsse von Calpainen, Calcium, dem Proteasom sowie dem mitochondrialen Membranpotentialverlust im Zellkulturmodell im Detail weiter untersucht. So konnte eine gegensätzliche Rolle von Calpain 1 und 2 bei der S. aureus Invasion festgestellt werden. Die intrazelluläre calciumabhängige Signalweiterleitung spielt eine bedeutende Rolle bei der S. aureus Infektion, da ihre Inhibition eine normale Infektion verhindert. Das mitochondriale Membranpotential (MMP) sinkt während einer S. aureus infektion, ist aber nicht für den Zelltod verantwortlich. Das Sinken des MMPs kann mit einem Inhibitor, der den mitochondrialen Na+/Ca2+ Austausch verhindert, signifikant reduziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die menschliche Wirtszelle selbst relevant zu den verschiedenen Schritten der Staphylokokkeninfektion beiträgt, und nicht einfach, wie häufig angenommen, von porenbildenden bakteriellen Toxinen zerstört wird. Entsprechend konnten einzelne Wirtszellproteine identifiziert werden, die entweder zur bakteriellen Invasion oder zum phagosomalen Ausbruch und somit zum induzierten Wirtszelltod beitragen. Überdies konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren, die diese Wirtszellproteine hemmen, die Wirtszellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor einer S. aureus Infektion schützen können. Folglich liefert diese Arbeit wertvolle Hinweise für neue Behandlungsmöglichkeiten von S. aureus Infektionen, die auf der Manipulation von Wirtszellsignalkaskaden beruhen. KW - Staphylococcus aureus KW - Wirtszelle KW - RNS-Interferenz KW - Host cell death KW - RNAi KW - 2-APB KW - intracellular replication KW - calpain KW - Human Host KW - Inhibitor Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114300 ER -