TY - JOUR A1 - Duschl, Albert A1 - Jahn, Ute A1 - Bertling, Claudia A1 - Sebald, Walter T1 - A comparison of assays for the response of primary human T-cells upon stimulation with interleukin-2, interleukin-4 and interleukin-7 N2 - The most commonly used assay to quantitate the response of peripheral T~cells upon stimulation with growth factors is determination of incorporated (JH]TdR. We compared thls test to three other methods: 1. direct countlog of cells with a Coulter type counter as reference assay, 2. a colorimetric assay using the tetrazolium dye 3-[ 4,S-dimethylthiazol-l-yl]-2,5diphenyl tetrazolium (MTT), which is a cheap and increasingly popular non-radioactive method and 3. incorporation of the thymidine analog 5-bromo-2'-deoxyuridine detection with a monoclonal antibody on cytospins. Primary human PHA-blasts from >30 healthy individuals were stimulated with IL-2, IL-4 aod IL-7 and assayed with up to four different methods. We discuss the advantages and disadvantages of the assays used and tbe effects of differences between cell preparations. We observed no significant variations between individuals for the dose dependence, but the relative emctency of IL4 compared to IL-2 and IL-7 was variable. This was probably due to the slower response observed upon stimulation with this factor. KW - T-Lymphozyt KW - Interleukin 2 KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 7 KW - T-cells KW - proliferation assays KW - IL-2 KW - IL-4 KW - IL-7 Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86750 ER - TY - THES A1 - Feldmann, Kristina T1 - Signal transduction of transforming growth factor-Beta in cytotoxic T cells T1 - Signaltransduktion von Transforming-Growth-Factor-beta in Zytotoxischen T-Zellen N2 - Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) ist ein multifunktionelles Zytokin, welches insbesondere Zellwachstum und Zelldifferenzierung koordiniert. TGF-b ist vor allem dafür bekannt, Zellen des Immunsystems zu beeinflussen. TGF-b steuert zum Beispiel die Differenzierung von T-Zellen und und deren Effektorfunktionen. Die Signaltransduktion von TGF-b wird vermittelt durch die Phosphorylierung von Rezeptor-assoziierten Smad-Proteinen (R-Smads). R-Smads werden vom Typ I Rezeptor aktiviert, der seinerseits vom hochaffinen Typ II Rezeptor phosphoryliert wird, sobald der Ligand bindet. Die phosphorylierten RSmads assoziieren darauf mit Co-Smads. Heterooligomere von R-Smads und Co-Smads wandern dann in den Zellkern, wo sie im Zusammenspiel mit Transkriptionsfaktoren wie CBP/p300 oder AP-1 die Transkription TGF-b-spezifischer Zielgene koordinieren. Neue Erkenntnisse lassen vermuten, daß die pleiotropen Effekte von TGF-b durch das Interagieren mit anderen Signalkaskaden entstehen, zum Beispiel mit dem MAP-Kinase-Weg oder der STAT-Kaskade. Wir beschreiben hier den Effekt von TGF-b auf die Effektorfunktionen unterschiedlich stimulierter primärer Maus-Milzzellen und aufgereinigten zytotoxischen CD8+ Maus-TZellen. Langzeitbehandlung mit TGF-b resultierte in der Unfähigkeit der Zellen, Smad2 ligandeninduziert zu phosphorylieren. Entweder wurde überhaupt keine Phosphorylierung beobachtet, oder eine anhaltende Phosphorylierung von Smad2 unabhängig vom Vorhandensein des Liganden. Des weiteren stellten wir einen Zusammenhang zwischen anhaltender Smad2-Phosphorylierung und der Resistenz gegenüber TGF-b induzierter Wachstumshemmung fest. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die sensitiv sind gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumshemmung, keine Smad2-Phosphorylierung mehr. Bezüglich ihrer zytotoxische Aktivtät waren allerdings beide Phänotypen nicht mehr lytisch wirksam, unabhängig von der jeweiligen Smad2-Phosphorylierung. In dieser Arbeit zeigen wir auch die Notwendigkeit eines funktionalen MEK-1-Signalweges auf, der unabdingbar ist, damit TZellen keine Wachstumsinhibierung durch TGF-b mehr erfahren. Das Blockieren dieses Signalweges führt darüberhinaus bei diesen Zellen ebenfalls zu einem veränderten Smad2- Phosphorylierungsmuster. Bezüglich des JNK-Signalweges konnten wir feststellen, daß ein funktional aktiver JNK-Signalweg mit der Resistenz gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumsinhibierung einhergeht. Allerdings führt die Zugabe von IFNg und/oder aCD28- Antikörper nicht zu einer veränderten Sensitivität gegenüber TGF-b. Im Gegensatz zuprimären Zellen können die beschriebenen Zusammenhänge in Zellkulturen vom humanen und murinen T Zellen nicht beobachtet werden, und sind somit spezifisch für primare TZellen. Wir beschreiben auch die Klonierung eines chimären dominant-negativen Typ II Rezeptors, der an eine Kinase gekoppelt ist, die bei Aktivierung Zelltod auslöst. Damit soll es in Zukunft möglich sein, T-Zellen gegenüber TGF-b Resistenz zu verleihen. Die hier geschilderten Ergebnisse vertiefen die Kenntnisse über molekulare Mechanismen der Wirkung von TGF-b auf T-Zellen und können vielleicht dazu beitragen, negative Effekte von TGF-b, zum Beispiel in der Tumortherapie, gezielt abzuwenden. N2 - Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) is a multifunctional cytokine that regulates cell growth and differentiation in many types of cells. TGF-b1 is especially known to exert a variety of regulatory functions in the immune system, such as T cell differentiation and T cell function. Signal transduction of TGF-b1 is mediated by phosphorylation of receptorassociated Smad proteins (R-Smads). R-Smads are phosphorylated by the activated type I receptor, which is itself phosphorylated by the high affinity type II receptor upon ligand binding. The phosphorylated R-Smads then associate with Co-Smads. Heterooligomers of R- and Co-Smads translocate into the nucleus where they regulate transcription of target genes in concert with other transcription factors such as CBP/p300 or AP-1. Recent findings suggest that the pleiotropic effects of TGF-b1 are conferred by crosstalks to other signal transduction pathways such as the MAP-kinases or the STAT-pathway. Here we describe the effect of long-term exposure to TGF-b1 on the effector function of differentially stimulated primary murine splenocytes and purified primary murine CD8+ cytotoxic T cells. Long-term exposure to TGF-b1 results in non-responsiveness to TGF-b1- induced Smad2 phosphorylation. This is seen either by no phosphorylation or sustained phosphorylation of Smad2. Furthermore, we observed a strong correlation between sustained Smad2 phosphorylation and resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition. In contrast, splenocyte cultures strongly growth inhibited by TGF-b1 showed no Smad2 phosphorylation. Lytic activity of these cultures, however, was found to be suppressed regardless of proliferation properties and Smad2 phosphorylation pattern. We also describe that a functional MEK-1 pathway is a prerequisite for rendering murine splenocytes unresponsive to TGF-b1 mediated growth inhibition, and that inhibition of the MEK-1 cascade alters the Smad2 phosphorylation pattern. In addition, we show that resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition correlates with the activation of the JNK pathway. However, the resistant phenotype was found unable to be reverted upon administration of exogeneous IFNg and/or aCD28 antibody. In human or mouse T cell lines, however, the described correlation between the type of stimulation and TGF-b growth resistance or growth sensitivity is not present. Thus, this correlation is specific for primary T cells. We also cloned a chimeric dominantnegative TGF-b receptor which is coupled to a suicide gene, in order to render T cells resistant to TGF-b mediated effects.These findings shed light on how TGF-b1 mediates its immunosuppressive role, and may help to gain knowledge of averting these TGF-b1 effects in the course of tumor therapy. KW - T-Lymphozyt KW - Transforming Growth Factor beta 1 KW - Signaltransduktion KW - T-Zellen KW - TGF-beta KW - Signaltransduktion KW - Smad KW - T-cells KW - TGF-beta KW - Signal transduction KW - Smad Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4912 ER - TY - JOUR A1 - Karulin, Alexey Y. A1 - Caspell, Richard A1 - Dittrich, Marcus A1 - Lehmann, Paul V. T1 - Normal distribution of CD8+ T-cell-derived ELISPOT counts within replicates justifies the reliance on parametric statistics for identifying positive responses JF - Cells N2 - Accurate assessment of positive ELISPOT responses for low frequencies of antigen-specific T-cells is controversial. In particular, it is still unknown whether ELISPOT counts within replicate wells follow a theoretical distribution function, and thus whether high power parametric statistics can be used to discriminate between positive and negative wells. We studied experimental distributions of spot counts for up to 120 replicate wells of IFN-γ production by CD8+ T-cell responding to EBV LMP2A (426 – 434) peptide in human PBMC. The cells were tested in serial dilutions covering a wide range of average spot counts per condition, from just a few to hundreds of spots per well. Statistical analysis of the data using diagnostic Q-Q plots and the Shapiro-Wilk normality test showed that in the entire dynamic range of ELISPOT spot counts within replicate wells followed a normal distribution. This result implies that the Student t-Test and ANOVA are suited to identify positive responses. We also show experimentally that borderline responses can be reliably detected by involving more replicate wells, plating higher numbers of PBMC, addition of IL-7, or a combination of these. Furthermore, we have experimentally verified that the number of replicates needed for detection of weak responses can be calculated using parametric statistics. KW - ELISPOT KW - statistics KW - t-Test KW - ANOVA KW - T-cells KW - normal distribution Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149968 VL - 4 IS - 1 ER -