TY  - THES
A1  - Stegner, David
T1  - Novel Aspects of Platelet Signaling and of the Pathogenesis of Immune Thrombocytopenia
T1  - Neue Aspekte in Signalwegen von Blutplättchen und in der Pathogenese der Immunthrombozytopenie
N2  - This work summarizes the results of studies on three major aspects of platelet signaling and of the pathogenesis of immune thrombocytopenia. Therefore, this thesis is divided into three parts. i) Platelet activation and subsequent thrombus formation at sites of vascular injury is crucial for normal hemostasis, but it can also trigger myocardial infarction and stroke. The initial capture of flowing platelets to the injured vessel wall is mediated by the interaction of the glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex with von Willebrand factor (vWF) immobilized on the exposed subendothelial extracellular matrix (ECM). The central importance of GPIb for platelet adhesion is well established, whereas GPV is generally considered to be of minor relevance for platelet physiology and thrombus formation. This study intended to clarify the relevance of this receptor during thrombus formation using Gp5-/- mice and mice with different double-deficiencies in GPV and in other platelet receptors. It was found that GPV and the collagen receptor integrin a2b1 have partially redundant functions in collagentriggered platelet aggregation. Further, it was revealed that GPV limits thrombus formation and impairs hemostasis in vivo. The data presented here demonstrate that the protective effect of GPVI-deficiency (another platelet collagen receptor) in arterial thrombosis and ischemic stroke depends on the expression of GPV. Moreover, it was demonstrated that lack of GPV restores the hemostatic function of mice lacking both GPVI and a2b1 or mice lacking GPVI and the C-type lectin receptor 2 (CLEC-2). Conclusively, GPV-depletion or blockade might have the potential to treat hemorrhagic disease states. ii) Platelets contain the two phospholipase (PL) D isoforms, PLD1 and PLD2, both of which presumably become activated upon platelet stimulation. However, the function of PLD in the process of platelet activation and aggregation has not been definitively explored. Thus, PLD-deficient mice were analyzed. Mice lacking PLD1 or PLD2 were viable, fertile and had normal platelet counts. PLD1 was found to be responsible for the inducible PLD-activity in platelets and to contribute to efficient integrin activation under static conditions. Moreover, flow adhesion experiments revealed that PLD1 is essential for efficient GPIb-mediated integrin activation. Consequently, Pld1-/- mice were protected from arterial thrombosis and ischemic brain infarction without affecting tail bleeding times. Hence, inhibition of PLD1 might be a novel approach for antithrombotic therapy. iii) Cellular activation of platelets or immune cells results in increased cytosolic calcium (Ca2+) levels. Store-operated calcium entry (SOCE) via the STIM1-Orai1 axis is the main route of Ca2+ entry downstream of immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) receptor stimulation in mast cells and T cells. However, the requirement of Ca2+-mobilization in Fcg receptor (FcgR)-signaling and the relevance of STIM2 for T cell SOCE have been unclear. To address these questions, genetically modified mice lacking central molecules of the SOCE machinery were analyzed. Ca2+-measurements revealed that both STIM isoforms contribute to Ca2+-mobilization downstream of T cell receptor activation. Additionally, it was found that FcgR stimulation results in SOCE and is mediated by STIM1 and probably Orai1. Animal models of immune thrombocytopenia (ITP) revealed that SOCE is essential for platelet clearance and that both STIM isoforms contribute to the pathology of ITP. Moreover, in this work it was also demonstrated that STIM1 and Orai1 are essential in IgG-mediated systemic anaphylaxis. STIM2 contributes to IgG-mediated, but not to IgE-mediated anaphylaxis. The data indicate that interference with SOCE might become a new strategy to prevent or treat IgG-dependent autoimmune diseases.
N2  - Diese Arbeit fasst Untersuchungen von drei wesentlichen Aspekten der Signalwege von Blutplättchen und der Pathogenese der Immunthrombozytopenie zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in drei Teile unterteilt. i) Die Aktivierung von Blutplättchen und die anschließende Thrombusbildung in Folge vaskulärer Verletzungen sind für die normale Hämostase elementar, sie können aber auch Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen. Die anfängliche Adhäsion zirkulierender Blutplättchen an der verletzten Gefäßwand wird durch die Wechselwirkung des Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Komplexes mit dem auf der freigelegten subendothelialen Matrix immobilisierten von Willebrand Faktor (vWF) vermittelt. Die zentrale Bedeutung von GPIb für die Adhäsion von Blutplättchen ist lange bekannt, wohingegen GPV allgemein als unbedeutend für die Physiologie von Blutplättchen oder die Thrombusbildung angesehen wird. Das Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung dieses Rezeptors für die Thrombusbildung zu überprüfen. Hierfür wurden GPV-defiziente Mäuse und mehrere Mauslinien, denen neben GPV ein weiterer Plättchenrezeptor fehlte, analysiert. Es wurde festgestellt, dass GPV und der Kollagenrezeptor Integrin a2b1 teilweise redundante Funktionen in der Kollagenvermittelten Plättchenaggregation haben. Des Weiteren wurde gezeigt, dass GPV die Thrombusbildung begrenzt sowie die Wundstillung reguliert. Die hier gezeigten Daten belegen, dass GPV überraschenderweise für den Schutz vor arterieller Thrombose oder ischämischem Schlaganfall, der aus dem Fehlen des wichtigsten Kollagenrezeptors GPVI resultiert, benötigt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass die Abwesenheit von GPV die Hämostase in Mäusen, denen GPVI und a2b1 oder GPVI und CLEC-2 (von C-type lectin receptor 2) fehlt, wieder herstellt. Folglich, könnte die pharmakologische Herabregulierung der GPV-Expression oder die Blockade des Rezeptors eine neue Behandlungsmöglichkeit von hämorrhagischen Krankheitszuständen darstellen. ii) Blutplättchen exprimieren die beiden Phospholipase (PL) D Isoformen PLD1 und PLD2, die vermutlich beide im Zuge der Blutplättchenstimulation aktiviert werden. Allerdings wurde die Rolle von PLD in der Thrombozytenaktivierung und -aggregation noch nicht abschließend untersucht. Daher wurden PLD-defiziente Mäuse analysiert. Mäuse, denen entweder PLD1 oder PLD2 fehlt, sind lebensfähig, fertil und haben normale Thrombozytenzahlen. Es zeigte sich, dass PLD1 für den induzierbaren Anteil der PLD-Aktivität in Blutplättchen verantwortlich und an der Integrinaktivierung unter statischen Bedingungen beteiligt ist. Des Weiteren ergaben Adhäsionsexperimente unter Flussbedingungen, dass PLD1 für die GPIb-vermittelte Integrinaktivierung von zentraler Bedeutung ist. Folglich sind Mäuse mit einer genetischen Ablation von PLD1 vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt. Da die Blutungszeiten dieser Tiere nicht verlängert waren, könnte die Inhibition von PLD1 einen anti-thrombotischen Therapieansatz darstellen. iii) Die zelluläre Aktivierung von Thrombozyten oder Immunzellen geht mit einem Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration einher. Der sogenannte Speicher-vermittelte Kalziumeinstrom (store-operated calcium entry, SOCE) über die STIM1-Orai1-Achse ist der wichtigste Kalziumeinstrommechanismus in Folge der Stimulation von Rezeptoren mit einem immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) in Mastzellen und T-Zellen. Allerdings ist die Notwendigkeit eines Kalziumeinstroms in Fcg Rezeptor (FcgR)-vermittelten Signalprozessen sowie die Relevanz von STIM2 hierbei noch unklar. Daher wurden gentechnisch veränderte Mäuse, denen zentrale Moleküle des SOCE-Apparats fehlen, untersucht. Kalziummessungen zeigten, dass beide STIM-Isoformen an der Kalziummobilisierung in Folge der T-Zellrezeptorstimulation beteiligt sind. Außerdem wurde gezeigt, dass die Stimulation von FcgRs zu SOCE führt, der von STIM1 und vermutlich auch von Orai1 vermittelt wird. Die Daten aus dem Immunthrombozytopenie (ITP) Tiermodell belegen, dass SOCE für die Zerstörung von Plättchen essentiell ist. Weiterhin sprechen die hiervorliegenden Ergebnisse für eine Rolle beider STIM Isoformen in der Pathologie der ITP. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass STIM1 und Orai1 entscheidende Faktoren für IgG-vermittelte systemische Anaphylaxie sind. STIM2 ist ebenfalls an der IgG-vermittelten, nicht jedoch an der IgE-vermittelten Anaphylaxie beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Eingriffe in den SOCE eine neue Strategie in der Behandlung von IgG-abhängigen immunologischen Erkrankungen sein könnten.
KW  - Thrombozyt
KW  - Phospholipase D
KW  - Calcium
KW  - Immunthrombozytopenie
KW  - Glycoprotein GPV
KW  - platelet
KW  - Immune Thrombocytopenia
KW  - phospholipase D
KW  - glycoprotein GPV
KW  - store-operated calcium entry
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87980
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vögtle, Timo
T1  - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice
T1  - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse
N2  - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells.
In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro.
The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals.
Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo.
N2  - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst.
Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13).
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2.
Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt.
KW  - Thrombozyt
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Rezeptor
KW  - Signaltransduktion
KW  - Calcium
KW  - Platelet
KW  - Thrombose
KW  - T cell
KW  - receptor signaling
KW  - calcium
KW  - ITAM
KW  - Hämostase
KW  - Metalloproteinasen
KW  - Adapterprotein
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114
ER  -