TY - THES A1 - Somody, Joseph Christian Campbell T1 - Leveraging deep learning for identification and structural determination of novel protein complexes from \(in\) \(situ\) electron cryotomography of \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\) T1 - Tiefenlernen als Werkzeug zur Identifizierung und Strukturbestimmung neuer Proteinkomplexe aus der \(in\)-\(situ\)-Elektronenkryotomographie von \(Mycoplasma\) \(pneumoniae\) N2 - The holy grail of structural biology is to study a protein in situ, and this goal has been fast approaching since the resolution revolution and the achievement of atomic resolution. A cell's interior is not a dilute environment, and proteins have evolved to fold and function as needed in that environment; as such, an investigation of a cellular component should ideally include the full complexity of the cellular environment. Imaging whole cells in three dimensions using electron cryotomography is the best method to accomplish this goal, but it comes with a limitation on sample thickness and produces noisy data unamenable to direct analysis. This thesis establishes a novel workflow to systematically analyse whole-cell electron cryotomography data in three dimensions and to find and identify instances of protein complexes in the data to set up a determination of their structure and identity for success. Mycoplasma pneumoniae is a very small parasitic bacterium with fewer than 700 protein-coding genes, is thin enough and small enough to be imaged in large quantities by electron cryotomography, and can grow directly on the grids used for imaging, making it ideal for exploratory studies in structural proteomics. As part of the workflow, a methodology for training deep-learning-based particle-picking models is established. As a proof of principle, a dataset of whole-cell Mycoplasma pneumoniae tomograms is used with this workflow to characterize a novel membrane-associated complex observed in the data. Ultimately, 25431 such particles are picked from 353 tomograms and refined to a density map with a resolution of 11 Å. Making good use of orthogonal datasets to filter search space and verify results, structures were predicted for candidate proteins and checked for suitable fit in the density map. In the end, with this approach, nine proteins were found to be part of the complex, which appears to be associated with chaperone activity and interact with translocon machinery. Visual proteomics refers to the ultimate potential of in situ electron cryotomography: the comprehensive interpretation of tomograms. The workflow presented here is demonstrated to help in reaching that potential. N2 - Der heilige Gral der Strukturbiologie ist die Untersuchung eines Proteins in situ, und dieses Ziel ist seit der Auflösungsrevolution und dem Erreichen der atomaren Auflösung in greifbare Nähe gerückt. Das Innere einer Zelle ist keine verdünnte Umgebung, und Proteine haben sich so entwickelt, dass sie sich falten und so funktionieren, wie es in dieser Umgebung erforderlich ist; daher sollte die Untersuchung einer zellulären Komponente idealerweise die gesamte Komplexität der zellulären Umgebung umfassen. Die Abbildung ganzer Zellen in drei Dimensionen mit Hilfe der Elektronenkryotomographie ist die beste Methode, um dieses Ziel zu erreichen, aber sie ist mit einer Beschränkung der Probendicke verbunden und erzeugt verrauschte Daten, die sich nicht für eine direkte Analyse eignen. In dieser Dissertation wird ein neuartiger Workflow zur systematischen dreidimensionalen Analyse von Ganzzell-Elektronenkryotomographiedaten und zur Auffindung und Identifizierung von Proteinkomplexen in diesen Daten entwickelt, um eine erfolgreiche Bestimmung ihrer Struktur und Identität zu ermöglichen. Mycoplasma pneumoniae ist ein sehr kleines parasitäres Bakterium mit weniger als 700 proteinkodierenden Genen. Es ist dünn und klein genug, um in grossen Mengen durch Elektronenkryotomographie abgebildet zu werden, und kann direkt auf den für die Abbildung verwendeten Gittern wachsen, was es ideal für Sondierungsstudien in der strukturellen Proteomik macht. Als Teil des Workflows wird eine Methodik für das Training von Deep-Learning-basierten Partikelpicken-Modellen entwickelt. Als Proof-of-Principle wird ein Dataset von Ganzzell-Tomogrammen von Mycoplasma pneumoniae mit diesem Workflow verwendet, um einen neuartigen membranassoziierten Komplex zu charakterisieren, der in den Daten beobachtet wurde. Insgesamt wurden 25431 solcher Partikel aus 353 Tomogrammen gepickt und zu einer Dichtekarte mit einer Auflösung von 11 Å verfeinert. Unter Verwendung orthogonaler Datensätze zur Filterung des Suchraums und zur Überprüfung der Ergebnisse wurden Strukturen für Protein-Kandidaten vorhergesagt und auf ihre Eignung für die Dichtekarte überprüft. Letztendlich wurden mit diesem Ansatz neun Proteine als Bestandteile des Komplexes gefunden, der offenbar mit der Chaperonaktivität in Verbindung steht und mit der Translocon-Maschinerie interagiert. Das ultimative Potenzial der In-situ-Elektronenkryotomographie – die umfassende Interpretation von Tomogrammen – wird als visuelle Proteomik bezeichnet. Der hier vorgestellte Workflow soll dabei helfen, dieses Potenzial auszuschöpfen. KW - Kryoelektronenmikroskopie KW - Tomografie KW - Mycoplasma pneumoniae KW - Deep learning KW - cryo-EM KW - cryo-ET KW - tomography KW - mycoplasma KW - pneumoniae KW - deep learning KW - particle picking KW - membrane protein KW - visual proteomics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313447 ER - TY - THES A1 - Graetz [geb. Dittmann], Jonas T1 - X-Ray Dark-Field Tensor Tomography : a Hitchhiker's Guide to Tomographic Reconstruction and Talbot Imaging T1 - Röntgen-Dunkelfeld-Tensor-Tomographie : ein Handbuch zur Tomographischen Rekonstruktion und Talbot-Bildgebung N2 - X-ray dark-field imaging allows to resolve the conflict between the demand for centimeter scaled fields of view and the spatial resolution required for the characterization of fibrous materials structured on the micrometer scale. It draws on the ability of X-ray Talbot interferometers to provide full field images of a sample's ultra small angle scattering properties, bridging a gap of multiple orders of magnitude between the imaging resolution and the contrasted structure scale. The correspondence between shape anisotropy and oriented scattering thereby allows to infer orientations within a sample's microstructure below the imaging resolution. First demonstrations have shown the general feasibility of doing so in a tomographic fashion, based on various heuristic signal models and reconstruction approaches. Here, both a verified model of the signal anisotropy and a reconstruction technique practicable for general imaging geometries and large tensor valued volumes is developed based on in-depth reviews of dark-field imaging and tomographic reconstruction techniques. To this end, a wide interdisciplinary field of imaging and reconstruction methodologies is revisited. To begin with, a novel introduction to the mathematical description of perspective projections provides essential insights into the relations between the tangible real space properties of cone beam imaging geometries and their technically relevant description in terms of homogeneous coordinates and projection matrices. Based on these fundamentals, a novel auto-calibration approach is developed, facilitating the practical determination of perspective imaging geometries with minimal experimental constraints. A corresponding generalized formulation of the widely employed Feldkamp algorithm is given, allowing fast and flexible volume reconstructions from arbitrary tomographic imaging geometries. Iterative reconstruction techniques are likewise introduced for general projection geometries, with a particular focus on the efficient evaluation of the forward problem associated with tomographic imaging. A highly performant 3D generalization of Joseph's classic linearly interpolating ray casting algorithm is developed to this end and compared to typical alternatives. With regard to the anisotropic imaging modality required for tensor tomography, X-ray dark-field contrast is extensively reviewed. Previous literature is brought into a joint context and nomenclature and supplemented by original work completing a consistent picture of the theory of dark-field origination. Key results are explicitly validated by experimental data with a special focus on tomography as well as the properties of anisotropic fibrous scatterers. In order to address the pronounced susceptibility of interferometric images to subtle mechanical imprecisions, an efficient optimization based evaluation strategy for the raw data provided by Talbot interferometers is developed. Finally, the fitness of linear tensor models with respect to the derived anisotropy properties of dark-field contrast is evaluated, and an iterative scheme for the reconstruction of tensor valued volumes from projection images is proposed. The derived methods are efficiently implemented and applied to fiber reinforced plastic samples, imaged at the ID19 imaging beamline of the European Synchrotron Radiation Facility. The results represent unprecedented demonstrations of X-ray dark-field tensor tomography at a field of view of 3-4cm, revealing local fiber orientations of both complex shaped and low-contrast samples at a spatial resolution of 0.1mm in 3D. The results are confirmed by an independent micro CT based fiber analysis. N2 - Die Röntgen-Dunkelfeld-Bildgung vermag den Widerspruch zwischen dem Bedarf nach großen Sichtfeldern im Zentimeterbereich und der nötigen Bildauflösung zur Charakterisierung von Fasermaterialien mit Strukturgrößen im Mikrometerbereich aufzulösen. Sie bedient sich dafür der Eigenschaft von Röntgen-Talbot-Interferometern, Ultrakleinwinkelstreueigenschaften einer Probe vollflächig abzubilden, womit eine Lücke von mehreren Größenordnung zwischen der Bildauflösung und der konstrastgebenden Strukturgröße überbrückt werden kann. Der Zusammenhang zwischen Strukturanisotropie und gerichteter Streuung ermöglicht dabei Rückschlüsse auf die Orientierung der Mikrostruktur einer Probe unterhalb der Bildauflösung. Erste Demonstrationen haben, basiered auf verschiedenen heuristischen Signalmodellen und Rekonstruktrionsansätzen, die grundsätzliche Erweiterbarkeit auf die Volumen-Bildgebung gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wird, aufbauend auf einer umfassenden Analyse der Dunkelfeld-Bildgebung und tomographischer Rekonstruktionsmethoden, sowohl ein verifiziertes Modell der Signalanisotropie als auch eine Rekonstruktionstechnik entwickelt, die für große tensorwertige Volumina und allgemeine Abbildungsgeometrien praktikabel ist. In diesem Sinne wird ein weites interdisziplinäres Feld von Bildgebungs- und Rekonstruktionsmethoden aufgearbeitet. Zunächst werden anhand einer neuen Einführung in die mathematische Beschreibung perspektivischer Projektionen essenzielle Einsichten in die Zusammenhänge zwischen der greifbaren Realraum-Darstellung der Kegelstrahl-Geometrie und ihrer technisch relevanten Beschreibung mittels homogener Koordinaten und Projektionsmatrizen gegeben. Aufbauend auf diesen Grundlagen wird eine neue Methode zur Auto-Kalibration entwickelt, die die praktische Bestimmung von perspektivischen Abbildungsgeometrien unter minimalen Anforderungen an die experimentelle Ausführung ermöglicht. Passend dazu wird eine verallgemeinerte Formulierung des weit verbreiteten Feldkamp-Algorithmus gegeben, um eine schnelle und flexible Volumenrekonstruktion aus beliebigen tomographischen Bildgebungsgeometrien zu ermöglichen. Iterative Rekonstruktionsverfahren werden ebenfalls für allgemeine Aufnahmegeometrien eingeführt, wobei ein Schwerpunkt auf der effizienten Berechnung des mit der tomographischen Bildgebung assoziierten Vorwärtsproblems liegt. Zu diesem Zweck wird eine hochperformante 3D-Erweiterung des klassischen, linear interpolierenden Linienintegrationsalgorithmus von Joseph entwickelt und mit typischen Alternativen verglichen. In Bezug auf die anisotrope Bildmodalität, die die Grundlage der Tensortomographie bildet, wird der Röntgen-Dunkelfeld-Kontrast umfassend besprochen. Die vorhandende Literatur wird dazu in einen gemeinsamen Kontext und eine gemeinsame Nomenklatur gebracht und mit neuen Überlegungen zu einer konsistenten Darstellung der Theorie zur Dunkelfeldsignalentstehung vervollständigt. Zentrale Ergebnisse werden dabei explizit anhand experimenteller Daten verifiziert, wobei besonders die Tomographie und die Eigenschaften anisotroper, faseriger Streuer im Vordergrund stehen. Um die ausgeprägte Empfindlichkeit interferometrischer Bilder auf feinste mechanische Instabilitäten zu kompensieren, wird ein effizientes Optimierungsverfahren zur Auswertung der Rohdaten aus Talbot-Interferometern entwickelt. Schließlich wird die Anwendbarkeit von linearen Tensor-Modellen in Bezug auf die hergeleiteten Anisotropie-Eigenschaften des Dunkelfeld-Kontrastes diskutiert, und ein iteratives Verfahren für die Rekonstruktion tensorwertiger Volumen aus Projektionsbildern vorgeschlagen. Die entwickelten Methoden werden effizient implementiert und auf Proben aus faserverstärktem Kunstoff angewandt, die dafür an der Bildgebungs-Strahllinie ID19 des Europäischen Synchrotrons ESRF abgebildet wurden. Die Ergebnisse stellen eine bisher einmalige Demonstration von Röntgen-Dunkelfeld-Tensor-Tomographie mit einem Sichtfeld von 3-4cm dar, wobei lokale Faserorientierung sowohl für komplex geformte als auch kontrastarme Objekte mit einer räumlichen Auflösung von 0.1mm in 3D dargestellt werden kann. Ein unabhängiger Vergleich mit Mikro-CT basierter Faser-Analyse bestätigt die Ergebnisse. KW - Dreidimensionale Rekonstruktion KW - Tomografie KW - Faserorientierung KW - Tensor KW - Bildgebendes Verfahren KW - X-Ray Dark-Field KW - Tensor Tomography KW - Volume Reconstruction KW - Fiber Orientation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281437 ER -