TY  - THES
A1  - Roth, Martin
T1  - Functional and developmental characterisation of matrix binding sites in decapentaplegic
T1  - Funktionelle und entwicklungsspezifische Charakterisierung von Matrix-Bindungsstellen von decapentaplegic
N2  - In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites.
N2  - In den letzten Jahren wurde deutlich, daß viele Zytokine nicht nur mit ihren spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren interagieren, sondern auch Affinität zu Komponenten der Extrazellulären Matrix zeigen. Vor allem in Drosophila konnten viele Enzyme zur Synthese von Glukosaminoglykanen identifiziert werden. Mutationen in diesen Enzymen führen in der Regel zu Störungen verschiedener Signalwege, wie z.B. hedgehog, wingless, FGF oder dpp. Aufgrund dieser pleiotropen Effekte, war es meist nicht möglich, die Bedeutung der Matrix-Interaktionen für bestimmte Zytokine zu untersuchen. In dieser Arbeit sollte die Bedeutung der Matrix-Interaktion für das TGF-ß-Superfamilienmitglied DPP unter-sucht werden. Ausgehend von der hohen Homologie zwischen humanem BMP-2 und DPP wurde der basische N-Terminus von DPP, der im BMP-2 für die Heparininteraktion verantwortlich ist, verändert. Es wurde neben einer Wildtypvariante (D-MYC) eine Deletionsvariante (D-DEL) generiert, die keine basischen Aminosäuren im N-Terminus aufweist, sowie eine Duplikationsvariante (D-DUP), die eine zweite Kopie des basischen Hauptmotivs im N-Terminus enthält. Zur biochemischen Charakterisierung wurden die Varianten sowie wildtypisches DPP in E.coli exprimiert und in eine bioaktive Form zurückgefaltet. Im Limbbud-Test zeigte sich vergleichbar zum BMP-2 eine stark erhöhte Aktivität der Deletionsvariante gegenüber Wildtyp-DPP. Durch Biacore-Messungen an der immobilisierten Ektodomäne des hochaffinen DPP TypI-Rezeptors Thick veins konnte gezeigt werden, daß alle Varianten gleiche Rezeptoraffinität haben und sich nur in der Matrixbindung unterscheiden. Letzteres wurde durch eine analytische FPLC mit Heparin als Matrix gezeigt. Die biologische Relevanz der Matrixbindung wurde in transgenen Fliegen untersucht. Hierbei wurden die DPP-Varianten hinter einen UAS-Promoter kloniert, um jene unter der Kontrolle verschiedener Gal4-Treiberlinien exprimieren zu können. In der frühen Tracheenentwicklung zeigte sich eine sehr starke Matrix-Abhängigkeit der DPP-Wirkung. Während ektopische Expression der Deletionsvariante fast keine Störung der Zellmigration verursachte, war das Muster der Tracheenäste bei ektopischer Expression von D-MYC als auch D-DUP massiv gestört. Ubiquitäre Expression der Varianten in der Flügelimaginalscheibe verursachte Überproliferation und eine Ausdehnung der Expressionsdomäne des omb-Genes. Die Stärke der Phänotypen korrelierte dabei mit der Matrixbindung der Varianten. Entsprechende Störungen des Venenmusters konnten in Flügeln adulter Tiere festgestellt werden. Durch Kreuzung zweier dpp-Allele konnten transheterozygote Fliegen gewonnen werden, die keine dpp-Expression in den Imaginalscheiben zeigen. Die Expression der Varianten unter Kontrolle eines geeigneten dpp-Gal4-Treibers in diesen Fliegen gab Aufschluß über die tatsächliche Relevanz der DPP-Matrix-Interaktion für die Ausbildung eines DPP-Gradienten und spezifische Aktivierung verschiedener Targetgene in der Flügelscheibe. Es wurde gezeigt, daß alle Varianten dazu in der Lage sind, einen DPP-Gradienten mit entsprechender Expression der Targetgene omb und spalt zu erzeugen. Wieder wurde eine Korrelation zwischen Ausdehnung der Targetgen-Domänen und der Matrixbindung der Varianten beobachtet. Somit konnte durch Mutation des N-Terminus des DPP-Proteins gezeigt werden, daß dieser für die Matrixinteraktion von DPP verantwortlich ist. Auch wurde Aufschluß über die Bedeutung der Matrixinteraktion an verschiedenen DPP-Wirkungsorten gewonnen. Die Abhängigkeit des DPP-Signalpotentials von der Matrixbindung differiert zwischen verschiedenen Gewebetypen. Während die Wirkung von DPP in der Restrukturierung der trachealen Migration sehr stark von einer Matrixbindung abhängt, sieht man in bei der Proliferation und Musterbildung in der Imaginalscheibe nur graduelle Effekte. Diese Daten führten zur Etablierung eines Models für den Wirkungsmechanismus von DPP/TGFß Molekülen als morphogene Faktoren. Während eine Deletion von Matrixbindung zu einem Verlust der spezifischen biologischen Aktivität führt, wird durch zusätzliche Matrixbindung eine erhöhte Aktivität erreicht.
KW  - Taufliege
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - Extrazellulärraum
KW  - extrazelluläre Matrix
KW  - decapentaplegic
KW  - Drosophila
KW  - Glucosaminoglykane
KW  - extracellular matrix
KW  - decapentaplegic
KW  - Drosophila
KW  - glucosaminoglycans
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7542
ER  - 
TY  - THES
A1  - Premachandran Nair, Anoop Chandran
T1  - Identification and functional characterization of TGF-β inducible, immunosuppressive miRNAs in human CD8+ T cells
T1  - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von TGF-β induzierbaren, immunsuppressiven miRNAs in humanen CD8+ T Zellen
N2  - While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the  known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis.
Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling.
N2  - Obwohl bekannt war, dass TGF- die miRNA Expression in zahlreichen Zelltypen moduliert, waren TGF- abhängige Veränderung des miRNA Profils in CD8+ T Zellen noch nicht untersucht worden. Da TGF-β die Effektorfunktionen von CD8+ T Zellen aber in vielfältiger Weise inhibiert, fragten wir uns, ob die transkriptionellen Effekte, die TGF-β bekanntermaßen auf Immuneffektormoleküle ausübt, noch durch die Induktion immunregulatorischer miRNAs ergänzt werden. Daher nutzten wir miRNA Arrays, Genomsequenzierungstechniken und Echtzeit-PCR um miRNAs zu identifizieren, welche in humane CD8+ T Zellen von TGF- moduliert werden. Die Beobachtung, dass die TGF--abhängige Herunterregulation der NKG2D Oberflächenexpression in Natürlichen Killerzellen und CD8+ T Zellen nicht mit einer entsprechenden Verringerung der mRNA Menge einhergeht, ließ zudem vermuten, dass dieser Signalweg über miRNAs reguliert werden könnte. Nach verschiedenen miRNA Reporterassays musste diese Hpothese jedoch verworfen werden. Stattdessen zeigte sich, dass TGF- die Transkription von DAP10 inhibiert was wiederum die Oberflächenexpression von NKG2D limitieren sollte. Trotz viel versprechender initialer Experimente scheiterte der letzgültige Beweis dieser Hypothese aber an der ungenügenden Transfizierbarkeit von primären NK Zellen sowie von NK Zelllinien.
Daher konzentrierten wir uns im Weiteren auf die durch TGF- induzierten Veränderungen im miRNom von CD8+ T Zellen und konnten mit drei verschiedenen Techniken die Induktion des miR-23a Clusters (mit den einzelnen miRNAs miR-23a, miR-27a und miR-24) bestätigen. Auf der Suche nach potentiellen immunregulatorisch relevanten Zielgenen dieser miRNAs konnten wir erstmals eine Regulation von IFN- durch miR-27a und miR-24 nachweisen. Zu diesem Zweck generierte miRNA Reporterkonstrukte zeigten zudem, dass LAMP1 durch miR-23a reguliert wird. Nach Modulation des miR-23a Clusters durch die entsprechenden miRNA Antagomir und Surrogat-Konstrukte konnten wir auch in CD8+ T Zellen signifikante Veränderungen der IFN-γ Expression nachweisen und somit die funktionelle Relevanz unserer Befunde bestätigen. Die Effekte auf die Expression von CD107a/LAMP1 waren hingegen nur minimal. Trotzdem führte die Überexpression des miR-23a Clusters zu einer Verringerung der zytotoxischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T Zellen. Zusammen genommen belegen diese funktionellen Untersuchungen, dass das miRNA-23a Cluster, welches durch TGF-β induziert wird, zur Hemung der Effektorfunktionen in CD8+ T Zellen beiträgt, und zwar sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von TGF-β.
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - Antigen CD8
KW  - miRNS
KW  - Interferon <Gamma->
KW  - Immunsystem
KW  - miR-23a cluster
KW  - T cell cytotoxicity
KW  - Regulation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109741
ER  - 
TY  - THES
A1  - Matuschek, Anja
T1  - Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells
T1  - Charakterisierung tolerogener dendritischer Knochenmarkszellen und regulatorischer T-Lymphozyten aus der Ratte
N2  - Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen.
N2  - Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient.
KW  - Dendritische Zelle
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Immuntoleranz
KW  - Allogene Zelle
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - tolerogen
KW  - Dendritische Zelle
KW  - regulatorische T-Zellen
KW  - allogen
KW  - TGF-ß
KW  - tolerogenic
KW  - dendritic cell
KW  - regulatory T cells
KW  - allogenic
KW  - TGF-ß
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708
ER  - 
TY  - THES
A1  - Harth, Stefan
T1  - Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions
T1  - Molekulare Erkennung in BMP Ligand-Rezeptor Interaktionen
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand’s point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors’ point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability.
N2  - „Bone Morphogenetic Proteins” (BMPs) sind sezernierte multifunktionelle Signalproteine, die eine wichtige Rolle während der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration von Geweben und Organen in fast allen Vertebraten und wirbellosen Tieren spielen. Die BMP-Signalgebung wird durch die Bindung an zwei Typen von Serin/Threonin Rezeptorkinasen eingeleitet. Hierbei binden BMPs zuerst an ihren hochaffinen Rezeptor, bevor der niederaffine Rezeptor in den Komplex eingefügt wird. Durch das Zusammenfügen beider Rezeptortypen wird eine von Smad (Small mothers against decapentaplegic)-Proteinen gesteuerte Signalkaskade gestartet, die letztendlich die Transkription responsiver Gene reguliert. Aktuell sind nur sieben Typ I und fünf Typ II Rezeptoren für mehr als 30 Liganden bekannt. Viele BMP-Liganden können demzufolge mehr als einen Rezeptorsubtyp rekrutieren. Umgekehrt jedoch können auch Rezeptoren an unterschiedliche Liganden binden, was auf eine im hohen Maße promiske Ligand-Rezeptor-Interaktion hinweist. Dabei stellen sich folgende Fragen: (i) Wie können BMPs ligandspezifische Signale erzeugen, obwohl sie dafür die gleichen Rezeptoren benutzen? (ii) Und wie können BMPs unterschiedliche Bindungspartner erkennen und trotzdem hochspezifisch an diese binden? Von Blickwinkel der Liganden aus betrachtet stellen heterodimere BMPs wertvolle Hilfsmittel dar, um das Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Rezeptortypen zu studieren. Darüber hinaus können sie neue Einblicke in die Entstehung von unterschiedlichen BMP-Signalen gewähren. In dieser Doktorarbeit wird die Expression und Aufreinigung von heterodimeren BMP-2/6 und -2/7 aus E.coli Zellen beschrieben. Mittels BIAcore Interaktionsstudien und in vitro Aktivitätsassays in Säugerzellen konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Heterodimere biologisch aktiv sind. Darüber hinaus zeigen BMP-2/6 and -2/7 in den meisten Zellassays eine höhere biologische Aktivität als ihre homodimeren Gegenstücke. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA an der Signalgebung von heterodimeren BMPs involviert ist. Eine Beteiligung weiterer Typ I Rezeptoren (wie z.B. die von ActR-I), die einen heteromeren Ligand-Rezeptor Typ I Signalkomplex bilden, wie es bereits in früheren Studien gezeigt wurde, konnte jedoch experimentell nicht eindeutig belegt werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass heterodimere BMPs für eine erfolgreiche Signalweiterleitung nur die Präsenz eines einzelnen Typ I Rezeptors benötigen. Von Blickwinkel der Rezeptoren aus betrachtet, ist der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA ein Paradebeispiel für promiskes Bindeverhalten an verschiedene BMP-Liganden. Das extra-zelluläre Kontaktepitop von BMPR-IA ist im Wesentlichen ungefaltet, wenn BMPR-IA in freier ungebundener Form vorliegt. Infolge dessen durchläuft die Binderegion in BMPR-IA weit reichende strukturelle Veränderungen, um die erforderliche Konformation auszubilden, die für die Bindung an BMP-2 essentiell ist. Um herauszufinden, ob das promiske Binde-verhalten von BMPR-IA mit einer strukturellen Plastizität seiner Binderegion einhergeht, wurde die Interaktion zwischen BMPR-IA und einem Antikörper Fab Fragment experimentell untersucht. Das Fab Fragment wurde aufgrund folgender Eigenschaft ausgewählt, nämlich an das BMP-2 Bindeepitop des Rezeptors anzudocken, um so eine BMP-2 vermittelte Rezeptoraktivierung zu verhindern. In dieser Doktorarbeit wird die Kristallstruktur des Komplexes, bestehend aus der extrazellulären Domäne von BMPR-IA und dem Antikörper Fab Fragment AbyD1556 beschrieben. Die Kristallstruktur zeigt, dass die Kontaktoberfläche von BMPR-IA zu einem sehr großen Teil mit der Kontaktoberfläche bei der Interaktion mit BMP-2 übereinstimmt. Obwohl das Kontaktepitop von BMPR-IA zu beiden Bindungspartnern weitestgehend deckungsgleich ist, unterscheiden sich die dreidimensionalen Strukturen von BMPR-IA in beiden Komplexen sehr stark voneinander. Im Gegensatz zu den strukturellen Differenzen zeigt jedoch eine Mutationsanalyse, bei der wichtige Aminosäuren mit Alanin ausgetauscht wurden, dass die funktionellen Determinanten, die die Bindung an den Antikörper und an BMP-2 bestimmen, beinahe die gleichen sind. Wenn man die Strukturen von BMPR-IA, das an BMP-2 bzw. an das Fab Fragment AbyD1556 gebunden ist, mit der Struktur von ungebundenem BMPR-IA vergleicht, so fällt auf, dass die Bindung von BMPR-IA an seine Bindungspartner einem sog. „Selektions-Anpassungsmechanismus“ folgt, was möglicherweise zeigt, dass das promiske Ligand-Bindeverhalten von BMPR-IA von Natur aus durch seine strukturelle Anpassungsfähigkeit festgelegt wird.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Ligand <Biochemie>
KW  - Molekulare Erkennung
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - Strukturaufklärung
KW  - Proteinfaltung
KW  - Proteinkristallographie
KW  - Heterodimer
KW  - BMP-2/6
KW  - BMP-2/7
KW  - BMPR-IA
KW  - Rezeptor
KW  - Signaltransduktion
KW  - protein crystallography
KW  - signal transduction
KW  - heterodimer
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797
ER  -