TY  - THES
A1  - Schwarz, Jessica Denise
T1  - Genome-wide reporter screens identify transcriptional regulators of ribosome biogenesis
T1  - Genomweite Reporterscreens identifizieren transkriptionelle Regulatoren ribosomaler Biogenese
N2  - Cellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and
organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins
and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred
proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very
energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of
the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals.
In this thesis, unbiased genome-wide knockout reporter screens were performed, aiming
to identify previously unknown transcriptional regulators of ribosome biogenesis
factors (RiBis), which are important for the assembly and maturation of ribosomes,
and ribosomal proteins (RPs), which are ribosomal components themself. With that
approach and follow-up (validation) experiments, ALDOA and RBM8A among others,
could be identified as regulators of ribosome biogenesis.
Depletion of the glycolytic enzyme ALDOA led to a downregulation of RiBi- and RPpromoter
driven reporters on protein and transcript level, as well as to a downregulation
of ribosome biogenesis gene transcripts and of mRNAs of other genes important for
proliferation.
Reducing the amount of the exon junction complex protein RBM8A, led to a more prominent
downregulation of one of the fluorescent reporters, but this regulation was independent
of the promoter driving the expression of the reporter. However, acute protein
depletion experiments in combination with nascent RNA sequencing (4sU-Seq)
revealed, that mainly cytosolic ribosomal proteins (CRPs) were downregulated upon
acute RBM8A withdrawal. ChIP experiments showed RBM8A binding to promoters of
RP genes, but also to other chromatin regions. Total POL II or elongating and initiating
POL II levels were not altered upon acute RBM8A depletion.
These data provide a starting point for further research on the mechanisms of transcriptional
regulation of RP and RiBi genes in mammals.
N2  - Zelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen
und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an
Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese
erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies,
ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen
der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in
Säugetieren nur schlecht verstanden.
In dieser Arbeit wurden hypothesenfreie genomweite Knockout-Reporterscreens mit
dem Ziel durchgeführt, bisher unbekannte transkriptionelle Regulatoren von ribosomalen
Biogenesefaktoren (RiBis), welche wichtig für den Zusammenbau und die Reifung
der Ribosomen sind, und ribosomalen Proteinen (RPs), welche selbst ribosomale Bestandteile
sind, zu identifizieren. Durch diesen Ansatz und nachfolgende (Validierungs-
)Experimente, konnten unter anderem ALDOA und RBM8A als Regulatoren ribosomaler
Biogenese identifiziert werden.
Eine Depletion des glykolytischen Enzyms ALDOA führte sowohl zu einer Herunterregulation
von RiBi- und RP-Promotor-gesteuerten Reportern auf Protein- und Transkriptebene,
als auch zu einer Herunterregulation von ribosomalen Biogenesegentranskripten
und von mRNAs anderer für die Proliferation wichtiger Gene.
Eine Reduktion der Menge des Exon-Junction-Komplexproteins RBM8A führte zu
einer deutlicheren Herunterregulation eines der beiden fluoreszierenden Reporter,
aber diese Regulation war unabhängig vom Promotor, der die Expression des Reporters
steuert. Akute Proteinabbauexperimente in Verbindung mit einer Sequenzierung
naszenter RNA (4sU-Seq) zeigten allerdings, dass hauptsächlich zytosolische
ribosomale Proteine (CRPs) nach akuter RBM8A-Depletion herunterreguliert waren.
ChIP-Experimente zeigten RBM8A-Bindung an Promotoren von RP-Genen, aber auch
an andere Chromatinregionen. Gesamt-POL II- oder elongierende und initiierende POL
II-Mengen waren nach akuter RBM8A-Depletion nicht verändert.
Diese Daten stellen einen Ausgangspunkt für weitere Forschung zu den Mechanismen
transkriptioneller Regulation von RP- und RiBi-Genen in Säugetieren dar.
KW  - Ribosom
KW  - Fructosebisphosphat-Aldolase
KW  - Transkription <Genetik>
KW  - Genregulation
KW  - ribosome biogenesis
KW  - Rbm8a
KW  - genetic screen
KW  - reporter screen
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279010
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hovhanyan, Anna
T1  - Functional analyses of Mushroom body miniature (Mbm) in growth and proliferation of neural progenitor cells in the central brain of Drosophila melanogaster
T1  - Funktionelle Analyse des Mushroom body minature (Mbm) in das Wachstum und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im zentralen Gehirn von Drosophila melanogaster
N2  - Zellwachstum und Zellteilung stellen zwei miteinander verknüpfte Prozesse dar, die dennoch grundsätzlich voneinander zu unterscheiden sind. Die Wiederaufnahme der Proliferation von neuralen Vorläuferzellen (Neuroblasten) im Zentralhirn von Drosophila nach der spät-embryonalen Ruhephase erfordert zunächst Zellwachstum. Der Erhalt der regulären Zellgröße ist eine wichtige Voraussetzung für die kontinuierliche Proliferation der Neuroblasten über die gesamte larvale Entwicklungsphase. Neben extrinsischen Ernährungssignalen ist für das Zellwachstum eine kontinuierliche Versorgung mit funktionellen Ribosomen notwendig, damit die Proteinsynthese aufrechterhalten werden kann.
Mutationen  im  mushroom  body  miniature  (mbm)  Gen  wurden  über  einen genetischen  Screen  nach  strukturellen  Gehirnmutanten  identifiziert.  Der  Schwerpunkt dieser Arbeit  lag in  der funktionellen  Charakterisierung des  Mbm  Proteins  als  neues nukleoläres Protein und damit seiner möglichen Beteiligung in der Ribosomenbiogenese. Der Vergleich der relativen Expressionslevel von Mbm und anderen nuklearen		Proteinen in verschiedenen Zelltypen zeigte eine verstärkte Expression von Mbm in der fibrillären Komponente des Nukleolus von Neuroblasten. Diese Beobachtung legte die Vermutung nahe, dass in Neuroblasten neben generell benötigten Faktoren der Ribosomenbiogenese auch	Zelltyp-spezifische	Faktoren	existieren.	Mutationen	in	mbm	verursachen Proliferationsdefekte von Neuroblasten, wirken sich jedoch nicht auf deren Zellpolarität, die  Orientierung  der  mitotischen  Spindel  oder  die  Asymmetrie  der  Zellteilung  aus. Stattdessen wurde eine Reduktion der Zellgröße beobachtet, was im Einklang mit einer Beeinträchtigung der Ribosomenbiogenese steht. Insbesondere führt der Verlust der Mbm Funktion zu einer Retention der kleinen ribosomalen Untereinheit im Nukleolus, was eine verminderte  Proteinsynthese  zur  Folge  hat.  Interessanterweise  wurden  Störungen  der Ribosomenbiogenese nur in den Neuroblasten beobachtet. Zudem ist Mbm offensichtlich nicht	erforderlich,	um	Wachstum		oder	die	Proliferation	von	Zellen	der Flügelimginalscheibe und S2-Zellen zu steuern, was wiederum dafür spricht, dass Mbm eine Neuroblasten-spezifische Funktion erfüllt.
Darüber hinaus wurden die transkriptionelle Regulation des mbm-Gens und die funktionelle Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen analysiert. Mbm Transkription wird von dMyc reguliert. Ein gemeinsames Merkmal von dMyc Zielgenen ist das Vorhandensein einer konservierten „E-Box“-Sequenz in deren Promotorregionen. In
 
der Umgebung der mbm-Transkriptionsstartstelle befinden sich zwei „E-Box“-Motive. Mit Hilfe von Genreporteranalysen konnte nachgewiesen werden, dass nur eine von ihnen die dMyc-abhängige Transkription vermittelt. Die dMyc-abhängige Expression von Mbm konnte auch in Neuroblasten verifiziert werden.
Auf posttranslationaler Ebene wird Mbm durch die Proteinkinase CK2 phosphoryliert. In der C-terminalen Hälfte des Mbm Proteins wurden in zwei Clustern mit einer Abfolge von sauren Aminosäuren sechs Serin- und Threoninreste als CK2- Phosphorylierungsstellen identifiziert. Eine Mutationsanalyse dieser Stellen bestätigte deren Bedeutung für die Mbm Funktion in vivo. Weiterhin ergaben sich Evidenzen, dass die Mbm-Lokalisierung durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung gesteuert wird.
Obwohl die genaue molekulare Funktion von Mbm in der Ribosomenbiogenese noch im Unklaren ist, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die besondere Rolle von Mbm in der Ribosomenbiogenese von Neuroblasten um Zellwachstum und Proliferation zu regulieren.
N2  - Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of  proliferation of  central brain progenitor  cells (neuroblasts)  after  the  late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis.
Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts.  Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm.
Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels.
At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal  half  of  the  Mbm  protein  were  identified  as  CK2  phosphorylation  sites.
 
Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation.
Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation.
KW  - Taufliege
KW  - Mbm
KW  - Neuroblast
KW  - cell growth
KW  - proliferation
KW  - ribosome biogenesis
KW  - CK2
KW  - Myc
KW  - Vorläuferzellen
KW  - Drosophila melanogaster
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91303
ER  -