TY  - JOUR
A1  - Wangorsch, Gaby
A1  - Butt, Elke
A1  - Mark, Regina
A1  - Hubertus, Katharina
A1  - Geiger, Jörg
A1  - Dandekar, Thomas
A1  - Dittrich, Marcus
T1  - Time-resolved in silico modeling of fine-tuned cAMP signaling in platelets: feedback loops, titrated phosphorylations and pharmacological modulation
N2  - Background: Hemostasis is a critical and active function of the blood mediated by platelets. Therefore, the prevention of pathological platelet aggregation is of great importance as well as of pharmaceutical and medical interest. Endogenous platelet inhibition is predominantly based on cyclic nucleotides (cAMP, cGMP) elevation and subsequent cyclic nucleotide-dependent protein kinase (PKA, PKG) activation. In turn, platelet phosphodiesterases (PDEs) and protein phosphatases counterbalance their activity. This main inhibitory pathway in human platelets is crucial for countervailing unwanted platelet activation. Consequently, the regulators of cyclic nucleotide signaling are of particular interest to pharmacology and therapeutics of atherothrombosis. Modeling of pharmacodynamics allows understanding this intricate signaling and supports the precise description of these pivotal targets for pharmacological modulation. Results: We modeled dynamically concentration-dependent responses of pathway effectors (inhibitors, activators, drug combinations) to cyclic nucleotide signaling as well as to downstream signaling events and verified resulting model predictions by experimental data. Experiments with various cAMP affecting compounds including antiplatelet drugs and their combinations revealed a high fidelity, fine-tuned cAMP signaling in platelets without crosstalk to the cGMP pathway. The model and the data provide evidence for two independent feedback loops: PKA, which is activated by elevated cAMP levels in the platelet, subsequently inhibits adenylyl cyclase (AC) but as well activates PDE3. By multi-experiment fitting, we established a comprehensive dynamic model with one predictive, optimized and validated set of parameters. Different pharmacological conditions (inhibition, activation, drug combinations, permanent and transient perturbations) are successfully tested and simulated, including statistical validation and sensitivity analysis. Downstream cyclic nucleotide signaling events target different phosphorylation sites for cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA, PKG) in the vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP). VASP phosphorylation as well as cAMP levels resulting from different drug strengths and combined stimulants were quantitatively modeled. These predictions were again experimentally validated. High sensitivity of the signaling pathway at low concentrations is involved in a fine-tuned balance as well as stable activation of this inhibitory cyclic nucleotide pathway. Conclusions: On the basis of experimental data, literature mining and database screening we established a dynamic in silico model of cyclic nucleotide signaling and probed its signaling sensitivity. Thoroughly validated, it successfully predicts drug combination effects on platelet function, including synergism, antagonism and regulatory loops.
KW  - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein
KW  - VASP
KW  - cyclic nucleotide signaling
KW  - silico model
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69145
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thumati, Naresh Reddy
T1  - Characterization of new protein kinases of the EVH1 domain containing protein VASP and identification of binding partners for a new EVH1 domain of the Spred2 protein : A case study on protein interactions of EVH1 domain containing proteins
N2  - Protein interactions as mediated by catalytic or non-catalytic protein domains contribute to cellular signal transduction processes by covalent protein modification of or non-covalent binding to interaction partners. Ena/VASP homology 1 (EVH1) domains are found in different signal transduction proteins as N-terminal non-catalytic adaptor modules of ~ 115 amino acids sharing a common fold. By targeting their host proteins to subcellular sites of action they are involved in several signalling cascades which include protein phosphorylation and cytoskeletal reorganisation. In this study, protein interactions of the two EVH1 domain containing proteins VASP and Spred2 were studied according to their involvement in different and non-overlapping signal transduction pathways of the cell. EVH1 domains were first described in the Ena/VASP protein family with the Vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP being its founding member. As a cytoskeleton-associated protein VASP not only interacts with different proteins of the actin network but it is also a substrate for cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. However the full complement of protein kinases targeting VASP as their substrate is still unknown. Here we used mouse cardiac fibroblast (MCFB) cells in order to study the phosphorylation status of VASP and identify new candidate protein kinases involved after serum stimulation of these cells. Using phosphosite-specific antibodies we found that serum stimulation induces a phosphorylation of VASP at Ser-157 in a time-dependent manner reaching its maximum after 90 min of stimulation. We developed an interaction graph model of possible candidate protein kinases involved. Using a pharmacological perturbation analysis with different combinations of specific protein kinase inhibitors and activators we excluded any contribution of cGMP-dependent protein kinase and Rho kinases to this process and identified a combined action of classical isoforms of PKCs and PKA in serum-stimulated VASP phosphorylation at Ser-157 positioning PKC upstream of PKA in this signalling pathway. We hypothesise that PKC receives an external stimulatory signal upon serum stimulation of MCFB cells which is passed either directly or indirectly to PKA which finally phosphorylates VASP at Ser-157. A new EVH1 domain has been described recently in the Spred proteins (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) which are inhibitors of the Ras/Raf/MAP kinase pathway. Our laboratory has been involved in the elucidation of the atomic structure of the human Spred2 EVH1 domain by protein NMR spectroscopy (PDB 2JP2; 2007). A positively charged binding interface of this EVH1 domain suggests an interaction with negatively charged ligands; however no interaction partners of this domain have been described so far. In the second part of this study, we used different genetic and biochemical screening methods to search for ligands of the Spred2 EVH1 domain. A bacterial two-hybrid system was established using a physically well characterized interaction of the VASP EVH1 domain with a panel of its ActA binding peptides as positive controls to screen a human brain cDNA expression library at different stringencies for candidate Spred2 EVH1 interaction partners. However none of the clones isolated could be genetically and physically validated to support Spred2 EVH1 specific interactions. An in-vitro screening of a 9-mer phage display peptide library using purified GST-Spred2 EVH1 fusion protein was performed together with a Fyn-SH3 fusion protein as a positive control. In contrast to the Fyn-SH3 domain the majority of phages isolated with the Spred2 EVH1 domain either carried no inserts or inserts with stop codons suggesting a highly non-specific interaction of the phage coat protein with the latter domain but neither the Fyn-SH3 domain nor the GST moiety. Isolation of a 13-mer proline-rich sequence was particularly surprising in this context. In order to address possible interactions of the Spred2 EVH1 domain with non-peptidergic ligands protein-lipid interaction assays were performed. Quantitative binding studies to purified Spred2 EVH1 using a liposome sedimentation assay however excluded any interaction of candidate phospholipids of the phosphatidyl inositol phosphate class with the Spred2 EVH1 domain. A natively folded and thus binding-competent conformation of the purified proteins used was assessed independently by 1H protein NMR spectroscopy. In summary the cumulative evidence of our genetic and biochemical screening experiments suggests that the still elusive Spred2 EVH1 ligand(s) may be formed of hydrophobic peptide epitopes larger than nine amino acids in size and carrying negative charge(s). A phosphorylation of Spred2 EVH1 binding epitopes by a post-translational modification should be seriously considered in future experiments.
N2  - Proteininteraktionen, wie sie durch katalytisch oder nicht-katalytisch wirksame Proteindomänen vermittelt werden können, spielen eine wesentliche Rolle in zellulären Signaltransduktionsprozessen durch die kovalente Modifikation oder nicht-kovalente Bindung von Interaktionspartnern. Ena/VASP Homologie 1 (EVH1) Domänen finden sich als N-terminale, nicht-katalytische, etwa 115 Aminosäuren große und konserviert gefaltete Adaptormodule in vielen verschiedenen Signaltransduktionsproteinen. Indem sie ihre jeweiligen Wirtsproteine an deren subzellulärem Wirkort verankern helfen, sind sie an vielen verschiedenen Signalkaskaden wie z.B. Proteinphosphorylierungen oder Umbauprozessen des Zytoskeletts beteiligt. In dieser Arbeiten wurden Proteininteraktionen der beiden EVH1 domänen-haltigen Proteine VASP and Spred2 untersucht, die in nicht überlappenden Signaltransduktionswegen der Zelle vorkommen. EVH1 Domänen wurden zuerst innerhalb der Ena/VASP-Proteinfamilie beschrieben, deren Gründungsmitglied das Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein VASP ist. Als zytoskelett-assoziiertes Protein wechselwirkt VASP nicht nur mit verschiedenen Aktin-bindenden Proteinen, sondern ist auch ein Substrat der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen. Der vollständige Satz jener Proteinkinasen, die VASP als eines ihrer Substrate aufweisen, ist immer noch unbekannt. Hier haben wir kardiale Mausfibroblasten (MCFB) Zellen verwendet, um nach Serum-Stimulation dieser Zellen den Phosphorylierungsstatus von VASP zu bestimmen und daran beteiligte, neue Kandidaten-Proteinkinasen zu identifizieren. Mit Hilfe von Phosphorylierungsstellen-spezifischen Antikörpern konnten wir zeigen, dass eine Serum-Stimulation eine zeitabhängige Phosphorylierung von VASP an Serin 157 induziert, die ein Maximum 90 min nach Stimulation erreicht. Wir entwickelten ein Interaktionsgraphen-Modell möglicher Kandidaten-Proteinkinasen, die an diesem Prozess beteiligt sein könnten. Mit Hilfe pharmakologischer Perturbationsexperimente auf der Grundlage spezifischer Proteinkinase-Inhibitoren und Aktivatoren konnten wir einerseits eine Beteiligung der löslichen cGMP-abhängigen Proteinkinase und von Rho-Kinasen an diesem Prozess ausschliessen und anderseits die gemeinsame Beteiligung der klassischen Proteinkinase C Isoform(en) und der cAMP-abhängigen Proteinkinase nachweisen. In diesem Signalweg liegt dabei die Proteinkinase C stromaufwärts vor letzterer. Nach unserer Interpretation der Daten wird die PKC nach Serum-Stimulation der MCFB-Zellen aktiviert und aktiviert ihrerseits direkt oder indirekt die cAMP-abhängige Proteinkinase, die schliesslich VASP als proximales Substrat am Serin 157 phosphoryliert. Eine neue EVH1 Domäne wurde kürzlich in den Spred Proteinen (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) beschrieben, die neue Inhibitoren im Ras/Raf/MAP-Kinase-Signalweg darstellen. Unser Labor war an der NMR-gestützten Aufklärung der atomaren Struktur der Spred2 EVH1 Domäne beteiligt (PDB 2JP2; 2007). Die positiv geladene Bindungsfurche dieser EVH1 Domäne legt eine Interaktion mit anionischen Liganden nahe. Interaktionspartner für diese Domäne sind bisher jedoch nicht beschrieben worden. Im zweiten Teil dieser Arbeit verwendeten wir verschiedene genetische und biochemische Suchverfahren zur Identifizierung möglicher Spred2 EVH1 Liganden. Ein bakterielles Two-Hybrid-System mit der Spred2 EVH1 Domäne als Köderprotein wurde dazu etabliert unter Verwendung der physikalisch gut charakterisierten Wechselwirkung der VASP EVH1 Domäne mit ihren ActA Bindungspeptiden als eines positiven Kontroll-Interaktionspaars und zum verschieden stringenten Durchmustern einer humanen cDNA Expressionsgenbank aus Gehirn eingesetzt. Keiner der isolierten Klone ließ sich jedoch genetisch oder nach Sequenzierung in Hinblick auf eine Spred2 EVH1 spezifische Wechselwirkung validieren. Mittels gereinigtem GST-Spred2 EVH1 Protein wurde daher eine 9-mer Peptid-Genbank im Phage-Display-Verfahren durchgemustert unter Verwendung eines Fyn-SH3 Fusionsproteins als positiver Kontrolle. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit letzterer trugen die mit der Spred2 EVH1 Domäne isolierten Phagen überwiegend keine Inserts oder solche mit Stop-Codons, was eine unspezifische Wechselwirkung mit den Phagen-Hüllenproteinen dieser Domäne nicht jedoch der Fyn-SH3 Domäne oder des GST-Partners nahelegt. Die Isolierung einer 13-mer großen prolin-reichen Bindesequenz war in diesem Zusammenhang besonders überraschend. Um eine mögliche Wechselwirkung von Spred2 EVH1 mit nicht-peptidergen Liganden zu untersuchen, wurden Protein-Phospholipid-Interaktionsassays durchgeführt. Mittels quantitativer Bindungsstudien unter Verwendung der isolierten Domäne konnte eine Interaktion mit Kandidaten-Phospholipiden aus der Klasse der Phosphatidylinositolphosphate in einem Liposomen-Sedimentationsassay ausgeschlossen werden. Eine native Faltung und damit prinzipiell bindungskompetente Konformation(en) der gereinigten Proteine konnten mittels 1H Protein-NMR-Spektroskopie sichergestellt werden. Zusammengenommen lassen unsere Experimente vermuten, dass es sich bei den noch immer nicht dingfest gemachten Spred2 EVH1 Liganden um hydrophobe, negative geladene, mehr als neun Aminosäuren umfassende Peptidepitope handeln könnte. Bei deren Identifizierung in zukünftigen Experimenten sollte mit ihrer Phosphorylierung durch post-translationale Modifikationen gerechnet werden.
KW  - VASP
KW  - Spred
KW  - EVH1 domains
KW  - Protein interactions
KW  - VASP
KW  - Spred
KW  - EVH1 domains
KW  - Protein interactions
KW  - VASP
KW  - Spred
KW  - EVH1 domains
KW  - Protein interactions
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26617
ER  - 
TY  - THES
A1  - Offner, Kristin
T1  - SH3-mediated protein interactions of Mena and VASP
T1  - SH3 vermittelte Proteininteraktionen von Mena und VASP
N2  - Regulation of actin cytoskeletal turnover is necessary to coordinate cell movement and cell adhesion. Proteins of the Enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important mediators in cytoskeleton control, linking cyclic nucleotide signaling pathways to actin assembly. In mammals, the Ena/VASP family consists of mammalian Enabled (Mena), VASP, and Ena-VASP-like (EVL). The family members share a tripartite domain organization, consisting of an N-terminal Ena/VASP homology 1 (EVH1) domain, a central proline-rich region (PRR), and a C-terminal EVH2 domain. The EVH1 domain mediates binding to the focal adhesion proteins vinculin and zyxin, the PRR interacts with the actin-binding protein profilin and with Src homology 3 (SH3) domains, and the EVH2 domain mediates tetramerization and actin binding.
Endothelial cells line vessel walls and form a semipermeable barrier between blood and the underlying tissue. Endothelial barrier function depends on the integrity of cell-cell junctions and defective sealing of cell-cell contacts results in vascular leakage and edema formation. In a previous study, we could identify a novel interaction of the PRR of VASP with αII-spectrin. VASP-targeting to endothelial cell-cell contacts by interaction with the αII-spectrin SH3 domain is sufficient to initiate perijunctional actin filament assembly, which in turn stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, barrier function of VASP-deficient endothelial cells and microvessels of VASP- null mice is defective, demonstrating that αII-spectrin/VASP complexes regulate endothelial barrier function in vivo.
The aim of the present study was to characterize the structural aspects of the binding of Ena/VASP proteins to αII-spectrin in more detail. These data are highly relevant to understand the cardiovascular function of VASP and its subcellular targeting. In the present study, the following points were experimentally addressed:
 1. Comparison of the interaction between αII-spectrin and Mena, VASP, or EVL
In contrast to the highly conserved EVH1/EVH2 domains, the PRR is the most divergent part within the Ena/VASP proteins and may differ in binding modes and mechanisms of regulation. More specifically, VASP contains a triple GP5 motif, whereas EVL and Mena contain one or more GP6 motifs or even longer proline stretches. In the present study, we used peptide scans and competitive αII-spectrin SH3 pull-down assays with the recombinant Mena, VASP, and VASP mutants to investigate the relative binding efficiency. Our results indicate that binding of the αII-spectrin SH3 domain to GP6 motifs is superior to GP5 motifs, giving a rationale for a stronger interaction of αII-spectrin with EVL and Mena than with VASP.
2. Interaction of SH3i with Ena/VASP proteins
In the mammalian heart, an αII-spectrin splice variant exists (SH3i), which contains a 20 amino acid insertion C-terminal to the SH3 domain. We used GST-fusion proteins of αII-spectrin, comprising the SH3 domain with or without the alternatively spliced amino acids, to pull-down recombinant Mena, VASP or VASP mutants. The results demonstrate a substantially increased binding of the C-terminal extended SH3 domain as compared to the general αII-spectrin isoform without the 20 amino acid insertion. These findings were also confirmed in pull-down experiments with heart lysates and purified Mena from heart muscle. The increased binding was not due to an alternative, SH3-independent binding interface because a pointmutation of the SH3 domain (W1004R) in the alternatively spliced αII-spectrin isoform completely abrogated the interaction. To analyze the interaction of SH3i and Ena/VASP proteins in living cells, we expressed the extended SH3 domain as GFP fusion proteins in endothelial cells. Here, we observed an extensive co-localization with Mena and VASP at the leading edge of lamellipodia confirming the in vivo relevance of the interaction with potential impact on cell migration and angiogenesis.
3. Binding affinity and influence of the Ena/VASP tetramerization domain
We also determined the binding affinity of the general and the alternatively spliced αII-spectrin SH3 with Ena/VASP proteins by isothermal titration calorimetry (ITC) using a peptide from the PRR of Mena (collaboration with Dr. Stephan Feller, University of Oxford). Surprisingly, the binding affinity of the general SH3 domain was low (~900 μM) as compared to other SH3 domain- mediated interactions, which commonly display binding constants in the low micromolar range. Furthermore and in contrast to the pull-down assays, we could not detect an increased binding affinity of the C-terminally extended SH3 domain. This could be either explained by the existence of a third protein, which “bridges” the Mena/αII-spectrin complex in the pull-down assays, or, more likely, by the small size of the Mena peptide, which lacks major parts of the Mena protein, including the tetramerization domain. Indeed, it has been previously shown that the tetramerization of Ena is crucial for the interaction with the Abl- SH3 domain, although no SH3 binding sites are found in the tetramerization domain. To address this point experimentally, we used a VASP mutant that lacks the tetramerization domain in pull-down assays. Neither the general nor the alternatively spliced SH3 domain bound to the monomeric VASP, demonstrating the crucial (indirect) impact of Ena/VASP tetramerization on the interaction with αII-spectrin.
In summary, we conclude that the αII-spectrin SH3 domain binds to the proline- rich region of all Ena/VASP proteins. However, binding to EVL and Mena, which both possess one or more GP6 motifs, is substantially more efficient than VASP, which only contains GP5 motifs. The C-terminally extended SH3 domain, which is present in the αII-spectrin splice variant SH3i, binds stronger to the Ena/VASP proteins than the general isoform and expression of the isolated domain is sufficient for co-localization with Ena/VASP in living endothelial cells. Finally, the tetramerization of the Ena/VASP proteins is indispensable for the interaction with either isoform of αII-spectrin.
N2  - Die Regulation des Umbaus des Aktinzytoskeletts ist für die Fortbewegung sowie die Adhäsion von Zellen essentiell. Proteine der Enabled/vasodilator- stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) Familie sind wichtige Mediatoren bei diesem Prozess, indem sie zyklische Nukleotidprotein-Signalwege mit dem Aktinzytoskelett-Aufbau verknüpfen. In Säugern besteht die Ena/VASP-Protein Familie aus mammalian Enabled (Mena), VASP und Ena-VASP-like (EVL). Diese Proteine teilen sich einen gemeinsamen strukturellen Aufbau: N-terminal befindet sich die Ena/VASP homology 1 (EVH1) Domäne, zentral liegt eine prolinreiche Region (PRR) und C-terminal befindet sich eine EVH2 Domäne. Die EVH1 Domäne vermittelt eine Interaktion mit den fokalen Adhäsionsproteinen Vinculin und Zyxin, die PRR interagiert mit dem aktinbindenden Protein Profilin sowie mit Src homology 3 (SH3) Domänen und die EVH2 Domäne vermittelt die Tetramerisierung der Proteine sowie die Interaktion mit Aktin.
Endothelzellen kleiden die Gefäßwand aus und bilden eine semipermeable Barriere zwischen Blut und dem umgebenden Gewebe. Die Funktion des Endothels hängt dabei von der Integrität der Zell-Zell-Kontakte ab. Die Zerstörung dieser Kontakte führt zu vaskulärer Leckage sowie zur Ausbildung von Ödemen. In einer vorausgehenden Arbeit konnten wir eine neue Interaktion zwischen der PRR von VASP und αII-Spektrin zeigen. Durch die Interaktion mit der SH3 Domäne von αII-Spektrin gelangt VASP an Zell-Zell-Kontakte von Endothelzellen und ist dort in der Lage die Aktinverknüpfung in der Umgebung der Zell-Zell-Kontakte zu initiieren, was wiederum die Zell-Zell-Kontakte stabilisiert und die vaskuläre Permeabilität reduziert. Umgekehrt konnten wir beobachten, dass die Barrierefunktion von Endothelzellen und Mikrogefäßen von VASP-defizienten Mäusen gestört ist, was darauf hindeutet, dass VASP/αII- Spektrin-Komplexe an der Regulation der endothelialen Barrierefunktion in vivo beteiligt sind.
Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Charakterisierung der Strukturen von Ena/VASP Proteinen und αII-Spektrin, die an der Interaktion zwischen diesen Proteinen beteiligt sind. Diese Daten sind äußerst wichtig um die genaue Funktion von VASP im kardiovaskulären System zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die folgenden Punkte genauer analysiert:
1. Vergleich der Interaktion zwischen αII-Spektrin und Mena, VASP oder EVL
Verglichen mit den hochkonservierten EVH1/2 Domänen besitzt die zentrale PRR der Ena/VASP Proteinfamilie die größte Diversität und könnte sich bezüglich der Binde- und Regulationsmechanismen zwischen den einzelnen Proteinen unterscheiden. Im Detail besitzt VASP ein sich dreifach wiederholendes GP5 Motiv wohingegen Mena und EVL ein sich ein- oder mehrfach wiederholendes GP6 Motiv oder noch längere Prolinsequenzen aufweisen. In dieser Arbeit nutzten wir peptide scan arrays und kompetitive αII- Spektrin SH3 pull-down Versuche mit rekombinantem Mena, VASP und VASP Mutanten um die relative Bindungsstärke der Interaktion zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Bindung der αII-Spektrin SH3 Domäne an GP6 Motive der Bindung an GP5 Motive überlegen ist, was darauf hindeutet, dass die Interaktion zwischen αII-Spektrin und EVL und Mena stärker ist als die Interaktion mit VASP.
2. Interaktion von SH3i mit Ena/VASP Proteinen
Im Säugerherzen kommt eine αII-Spektrin Splicevariante (SH3i) vor, die eine Insertion aus 20 Aminosäuren C-terminal der SH3 Domäne enthält. Wir nutzten GST-αII-Spektrin Fusionsproteine, die die SH3 Domäne mit oder ohne Aminosäuren-Insertion beinhalteten, im pull-down Versuch mit rekombinantem Mena, VASP oder mit VASP Mutanten. Die Ergebnisse zeigten eine deutlich ansteigende Bindungsrate bei der C-terminal verlängerten SH3 Domäne verglichen zu der üblichen αII-Spektrin Isoform ohne Aminosäureninsertion. Diese Ergebnisse konnten auch durch pull-down Versuche mit Herzlysat und aufgereinigtem Mena aus Herzmuskulatur bestätigt werden. Dieser Effekt auf die Bindung war dabei nicht bedingt durch ein alternatives, SH3-unabhängiges Bindungsmuster, da eine Punktmutation (W1004R) in der Sequenz der SH3 Domäne der alternativ gespleißten αII-Spektrin Isoform die Interaktion komplett aufhob. Um die Interaktion von SH3i und Ena/VASP Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen, exprimierten wir die verlängerte SH3 Domäne als GFP- Fusionsprotein in Endothelzellen. Hierbei konnten wir eine ausgeprägte Kolokalisation mit Mena und VASP an Lamellipodien beobachten, was die Relevanz der Interaktion im lebenden Organismus bestätigt und auf einen potentiellen Effekt auf Zellmigration und Angiogenese schließen lässt.
3. Bindungsaffinität und Einfluss der Ena/VASP Tetramerisierungsdomäne
Zusätzlich wurde die Bindungsaffinität der üblichen sowie der alternativ gespleißten αII-Spektrin SH3 Domäne mit den Ena/VASP Proteinen mittels isothermal titration calorimetry (ITC) bestimmt, wobei ein Peptid bestehend aus der PRR von Mena genutzt wurde (Kollaboration mit Dr. Stephan Feller, Universität von Oxford). Überraschenderweise war die Bindungsaffinität der üblichen SH3 Domäne verglichen mit anderen SH3 Interaktionen, die normalerweise Bindungskonstanten im unteren mikromolaren Bereich aufweisen, niedrig (~900 μM). Außerdem und im Kontrast zu den Ergebnissen der pull-down Versuche konnten wir keine gesteigerte Bindungsaffinität der C- terminal verlängerten SH3 Domäne feststellen. Dies könnte entweder durch die Beteiligung eines dritten Proteins erklärt werden, das den Mena/αII-Spektrin- Komplex in den pull-down Versuchen überbrückt, oder aber, was wahrscheinlicher ist, durch die geringe Größe des Mena Peptids, dem wichtige Bestandteile des Mena Proteins inklusive der Tetramerisierungsdomäne fehlen. Tatsächlich wurde erst kürzlich gezeigt, dass die Tetramerisierung von Ena essentiell für eine Interaktion mit der Abl SH3 Domäne ist, obwohl keine SH3 Bindestellen in der Tetramerisierungsdomäne gefunden wurden. Um dieser Beobachtung nachzugehen, nutzten wir eine VASP Mutante in pull-down Versuchen, der die Tetramerisierungsdomäne fehlt. Weder die übliche noch die alternativ gespleißte SH3 Domäne interagierte mit dem monomeren VASP, was einen essentiellen (indirekten) Einfluss der Tetramerisierung von Ena/VASP Proteinen auf die Interaktion mit αII-Spektrin nahelegt.
Zusammengefasst können wir sagen, dass die αII-Spektrin SH3 Domäne an die prolinreiche Region aller Ena/VASP Proteine bindet. Jedoch ist festzuhalten, dass die Bindung an EVL und Mena, die beide ein oder mehrere GP6 Motive enthalten, deutlich effizienter ist als die Bindung an VASP, das ausschließlich GP5 Motive beinhaltet. Die C-terminal verlängerte SH3 Domäne, die in der alternativ gespleißten αII-Spektrin Variante SH3i vorkommt, bindet stärker an Ena/VASP Proteine als die übliche αII-Spektrin Isoform und bereits die Expression der isolierten Domäne alleine ist für eine Kolokalisation mit Ena/VASP Proteinen in lebenden Endothelzellen ausreichend. Letztlich konnten wir zeigen, dass die Tetramerisierung der Ena/VASP Proteine unentbehrlich für die Interaktion mit allen untersuchten αII-Spektrin Isoformen ist.
KW  - SH3
KW  - proteininteraction
KW  - Mena
KW  - VASP
KW  - Proteininteraktion
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154481
ER  - 
TY  - THES
A1  - Merkel, Carla Jennifer
T1  - Characterisation of Mena Promoter Activity and Protein Expression in Wild-type and Gene-trapped Mice
T1  - Charakterisierung der Mena-Promotor-Aktivität und Protein-Expression in Wildtyp- und Gene-trap-Mäusen
N2  - Proteins of the Ena/VASP protein family are important regulators of actin and participate in cell-cell and cell-matrix adhesions. To date, the physiological importance of Ena/VASP proteins for integrity of the cardiovascular system has remained unclear. To study cardiovascular functions of Mena and VASP, we used an established VASP knockout mouse in combination with a novel gene-trap-based model to ablate Mena function. In the mutated Mena mouse, the endogenous Mena gene is disrupted by the insertion of a β-galactosidase construct and β-galactosidase expression is under the control of the endogenous Mena promoter. X-gal staining of mouse organs revealed Mena promoter activity in smooth muscle layers of vessels, intestines and bronchioles, but also in cells of the brain, in cardiomyocytes and in the respiratory epithelium of bronchioles. In wild-type mice, Western blotting revealed differing protein expression patterns of VASP and Mena. Mena expression was observed in almost every tissue, predominantly in heart, lung, stomach, large intestine, testis, brain and eye. Additionally, the neuronalspecific Mena isoform was expressed in brain, eye, and slightly in heart and stomach. VASP protein, in contrast, was predominantly detected in spleen and thrombocytes. In gene-trapped mice, Mena expression was largely reduced in heart, lung and stomach but only slightly decreased in brain and testis. Immunofluorescence microscopy revealed colocalisation of Mena and F-actin at intercalated discs of cardiomyocytes and strong colocalisation of Mena and α- smooth-muscle-actin in vessels and bronchioles. Functional analysis of Mena/VASP-mutated and wild-type mice using electrocardiography suggested that the depletion of either Mena or VASP does not interfere with normal heart function. However, in double-deficient mice, the resting heart rate was significantly increased, probably reflecting a mechanism to compensate defects in ventricle contraction and to maintain a normal cardiac output. In agreement, cardiac catheter investigations suggested dilated cardiomyopathy in doubledeficient mice. Thus, although Western blot analysis showed differing protein expression patterns of Mena and VASP, these findings suggest that Mena and VASP mutually compensate for each other. Concerning Mena, we propose an important role of the protein in vessel walls, cardiomyocytes and bronchioles.
N2  - Proteine der Ena/VASP-Familie sind wichtige Regulatoren der Aktin-Dynamik und sind Bestandteile von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakten. Bis heute ist die physiologische Bedeutung der Ena/VASP-Proteine speziell im kardiovaskulären System noch nicht geklärt. Um die kardiovaskuläre Funktion von Mena (mammalian Ena) und VASP zu untersuchen, nutzten wir eine etablierte VASP-Knockout-Maus in Kombination mit einem neuen Gene-trap-Maus-Modell, welches die Mena-Funktion ausschaltet. In der mutierten Mena-Maus wird das endogene Mena-Gen durch die Insertion eines β-Galaktosidase-Konstrukts gespalten, sodass die Mena-Funktion ausfällt und die β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des endogenen Mena-Promoters steht. X-Gal-Färbungen von Mausorganen ließen Mena-Promoter-Aktivität in glatter Muskulatur von Gefäßen, Darm und Bronchiolen, aber auch in Zellen des Gehirns, in Kardiomyozyten und im respiratorischen Flimmerepithel der Bronchiolen erkennen. In Wildtyp-Mäusen, zeigten Western-Blot-Untersuchungen unterschiedliche Protein-Expressionsmuster für VASP und Mena. Mena-Expression wurde in fast allen Geweben entdeckt, hauptsächlich in Herz, Lunge, Magen, Dickdarm, Hoden, Gehirn und in den Augen. Zusätzlich wurde die neuronale Mena-Isoform im Gehirn, in den Augen und ein wenig auch in Herz und im Magen exprimiert. Im Gegensatz dazu, wurde VASP hauptsächlich in Thrombozyten und in Milzgewebe gefunden. In den auf dem Gene-trap basierenden Mäusen war die Expression von Mena im Herz, in der Lunge und im Magen deutlich reduziert, während nur eine leichte Verringerung im Gehirn und im Hodengewebe festzustellen war. Immunfluoreszenz-Mikroskopie legten Kolokalisation von Mena und F-Aktin an Glanzstreifen von Kardiomyozyten und deutliche Kolokalisation von Mena und glattmuskulärem Aktin in Gefäßen und Bronchien dar. Funktionsanalysen von Mena/VASPmutierten und Wildtyp-Mäusen anhand von EKG-Aufzeichnungen, ließen vermuten, dass ein Verlust von entweder Mena oder VASP die normale Herzfunktion nicht negativ beeinträchtigt. Wohingegen die Ruheherzrate von doppeldefizienten Mäusen deutlich erhöht war, was möglicherweise auf einen Mechanismus zur Kompensation der defizienten Ventrikelkontraktion zurückzuführen ist, um ein normales Herz-Zeit-Volumen aufrecht zu erhalten. Dies stimmt mit Herzkatheter-Untersuchungen überein, die auf eine Dilatative Kardiomyopathie bei doppeldefizienten Mäusen hindeuteten. Folglich ist davon auszugehen, dass Mena- und VASP-Proteine füreinander kompensieren können, obwohl Western-Blot-analysen unterschiedliche Expressionsmuster gezeigt haben. Mena betreffend, vermuten wir eine wichtige Rolle des Proteins in Gefäßwänden, in Kardiomyozyten und in Bronchien.
KW  - Spectrin
KW  - Genfallen-Insertion
KW  - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein
KW  - Mena
KW  - Mena-Promotor-Aktivität
KW  - X-Gal-Färbung
KW  - Mena
KW  - VASP
KW  - Mena promoter ativity
KW  - gene-trap
KW  - X-Gal staining
KW  - Spectrin
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70414
ER  - 
TY  - THES
A1  - Benz, Peter Michael
T1  - Cytoskeleton assembly at endothelial cell-cell contacts is regulated by Alpha-II-spectrin/vasp complexes
T1  - Das Aktin Zytoskelett an endothelialen Zell-Zell-Kontakten wird durch αII-Spektrin/VASP Komplexe reguliert
N2  - Directed cortical actin assembly is the driving force for intercellular adhesion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) participates in actin-fiber formation and VASP activity is regulated by phosphorylations. We screened for endothelial cell proteins, which bind to VASP dependent on its phosphorylation status. Differential proteomics identified αII-spectrin as novel VASP-interacting protein. αII-spectrin binds to the triple GP5-motif in VASP via its SH3 domain. cAMP-dependent protein kinase-mediated VASP phosphorylation at Ser157 inhibits αII-spectrin/VASP complex formation. VASP becomes dephosphorylated upon formation of cell-cell contacts and in confluent but not in sparse endothelial cells αII-spectrin colocalizes with non-phosphorylated VASP at cell-cell junctions. Ectopic expression of the αII-spectrin SH3 domain fused to claudin-5 translocates VASP to cell-cell contacts and is sufficient to initiate the formation of cortical actin cytoskeletons. αII-spectrin SH3 domain overexpression stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, permeability of VASP-deficient endothelial cells is elevated. In a skin edema model, microvascular leakage is increased in VASP-deficient over wild-type mice. We propose that αII-spectrin/VASP complexes regulate cortical actin cytoskeleton assembly with implications for formation of endothelial cell-cell contacts and regulation of vascular permeability.
N2  - Der zielgerichtete Aufbau eines kortikalen Aktin-Zytoskeletts ist die treibende Kraft für die interzelluläre Adhäsion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) ist maßgeblich an der Bildung von Aktin-Fasern beteiligt und die VASP Aktivität wird durch seine Phosphorylierung geregelt. Wir haben in einem systematischen Ansatz nach endothelialen Proteinen gesucht, die an VASP, abhängig von seinem Phosphorylierungszustand, binden. Mit Hilfe differenzieller Massenspektrometrie konnte αII-Spektrin als neuer VASP Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei bindet die αII-Spektrin SH3 Domäne an die drei GP5-Motive in VASP. Die Phosphorylierung von VASP durch die cAMP-abhängige Protein Kinase hemmt die αII-Spektrin/VASP Komplexbildung. Bei der Bildung von Zell-Zell Kontakten wird VASP dephosphoryliert und in konfluenten - nicht aber in vereinzelten Endothelzellen - kolokalisieren αII-Spektrin und nicht-phosphoryliertes VASP an Zell-Zell Kontakten. Die ektopische Expression der αII-Spektrin SH3 Domäne als Fusionsprotein mit Claudin-5 führt zu einer Translokation von VASP an Zell-Zell Kontakte und ist hinreichend um die Bildung von kortikalen Aktin-Fasern einzuleiten. Funktionell stabilisiert die Überexpression der αII-Spektrin SH3 Domäne Zell-Zell Kontakte und führt zu einer Abnahme der Endothelzellpermeabilität. Dementsprechend ist die Permeabilität von VASP-defizienten Zellen erhöht. In einem Hautödem-Modell zeigt sich nach Bradykinin-Stimulation eine Erhöhung der mikrovaskuläre Permeabilität von VASP-defizienten Mäusen gegenüber wild-typ Tieren. Unsere Forschungsergebnisse legen nahe, dass αII-Spektrin/VASP Komplexe den Aufbau des kortikalen Aktin-Zytoskeletts regulieren und damit für die Bildung von endothelialen Zell-Zell Kontakten und die Regulation der vaskulären Permeabilität eine Rolle spielen.
KW  - VASP
KW  - Spektrin
KW  - Aktin Zytoskelett
KW  - Endotheliale Zell-Zell-Kontakte
KW  - VASP
KW  - Spectrin
KW  - Cortical Actin Cytoskeleton
KW  - Endothelial Cell-Cell Contacts
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23802
ER  -