TY - THES A1 - Pasch, Elisabeth T1 - The role of SUN4 and related proteins in sperm head formation and fertility T1 - Die Rolle von SUN4 und verwandten Proteinen in der Spermienkopfformierung und Fertilität N2 - Spermiogenesis describes the differentiation of haploid germ cells into motile, fertilization-competent spermatozoa. During this fundamental transition the species-specific sperm head is formed, which necessitates profound nuclear restructuring coincident with the assembly of sperm-specific structures and chromatin compaction. In the case of the mouse, it is characterized by reshaping of the early round spermatid nucleus into an elongated sickle-shaped sperm head. This tremendous shape change requires the transduction of cytoskeletal forces onto the nuclear envelope (NE) or even further into the nuclear interior. LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) complexes might be involved in this process, due to their general function in bridging the NE and thereby physically connecting the nucleus to the peripheral cytoskeleton. LINC complexes consist of inner nuclear membrane integral SUN-domain proteins and outer nuclear membrane KASH-domain counterparts. SUN- and KASH-domain proteins are directly connected to each other within the perinuclear space, and are thus capable of transferring forces across the NE. To date, these protein complexes are known for their essential functions in nuclear migration, anchoring and positioning of the nucleus, and even for chromosome movements and the maintenance of cell polarity and nuclear shape. In this study LINC complexes were investigated with regard to their potential role in sperm head formation, in order to gain further insight into the processes occurring during spermiogenesis. To this end, the behavior and function of the testis-specific SUN4 protein was studied. The SUN-domain protein SUN4, which had received limited characterization prior to this work, was found to be exclusively expressed in haploid stages during germ cell development. In these cell stages, it specifically localized to the posterior NE at regions decorated by the manchette, a spermatid-specific structure which was previously shown to be involved in nuclear shaping. Mice deficient for SUN4 exhibited severely disorganized manchette residues and gravely misshapen sperm heads. These defects resulted in a globozoospermia-like phenotype and male mice infertility. Therefore, SUN4 was not only found to be mandatory for the correct assembly and anchorage of the manchette, but also for the correct localization of SUN3 and Nesprin1, as well as of other NE components. Interaction studies revealed that SUN4 had the potential to interact with SUN3, Nesprin1, and itself, and as such is likely to build functional LINC complexes that anchor the manchette and transfer cytoskeletal forces onto the nucleus. Taken together, the severe impact of SUN4 deficiency on the nucleocytoplasmic junction during sperm development provided direct evidence for a crucial role of SUN4 and other LINC complex components in mammalian sperm head formation and fertility. N2 - Die Spermiogenese beschreibt die Differenzierung haploider Keimzellen zu beweglichen, fortpflanzungsfähigen Spermatozoen. Während dieses fundamentalen Entwicklungsabschnittes wird neben dem Aufbau von spermienspezifischen Strukturen und der Kompaktierung des Chromatins auch der speziesspezifische Spermienkopf geformt. Im Falle der Maus ist dies eine aktive Umformung des runden Zellkerns in einen gestreckten, sichelförmigen Spermienkopf. Eine derart gravierende Formveränderung erfordert eine Kraftweiterleitung aus dem Zytoskelett auf die Kernhülle und das Kerninnere. In diesem Zusammenhang könnten LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) Komplexe eine Rolle spielen, da ihre grundlegende Funktion darin besteht die Kernhülle zu überbrücken und somit den Kern mit dem peripheren Zytoskelett zu verbinden. LlNC Komplexe werden aus SUN und KASH Domänen Proteinen aufgebaut, welche in die innere beziehungsweise äußere Kernmembran eingelagert sind. Diese membranintegralen Proteine sind direkt miteinander verbunden, so dass sie einen Komplex bilden, der zur Kräfteübertragung geeignet ist. LINC Komplexe besitzen vielfältige Funktionen in Prozessen wie nuklearer Migration, Verankerung und Positionierung des Zellkerns, Chromosomenbewegungen und in der Aufrechterhaltung der Zellpolarität oder der Kernform. Um ein größeres Verständnis der Prozesse während der Spermiogenese zu gewinnen, wurden in dieser Studie die Funktionen von LINC Komplexen in der Spermiogenese und ihre spezifische Rolle bei der gerichteten Spermienkopf-strukturierung untersucht. Dabei wurde insbesondere das Verhalten und die Funktion des bisher wenig charakterisierten SUN Domänen Proteins SUN4 erforscht. Entsprechend der Ergebnisse dieser Studie ist SUN4 ein hodenspezifisches Protein, das ausschließlich in haploiden Keimzellen exprimiert wird. In diesen lokalisiert es in der posterioren Kernhülle, spezifisch in Regionen, an die sich die spermatidenspezifische Manschette anlagert. Dies ist eine Struktur, für die bereits gezeigt wurde, dass sie an der Verformung des Kerns beteiligt ist. SUN4 defiziente Mäuse zeigten ausschließlich Spermatiden mit stark desorganisierten Manschettenüberresten und einen gravierend verformten Spermienkopf. Insgesamt führten die Fehlbildungen zu einem globozoospermieartigen Phänotyp und männlicher Sterilität bei Mäusen. Dabei zeigte sich, dass SUN4 nicht nur zwingend erforderlich ist für den korrekten Aufbau und die Verankerung der Manschette, sondern auch für die korrekte Lokalisation von SUN3 und Nesprin1, wie auch für weitere Komponenten der posterioren Kernhülle. Interaktionsstudien zeigten, dass SUN4 sowohl mit SUN3 und Nesprin1 als auch mit sich selbst interagieren kann, vermutlich um funktionsfähige LINC Komplexe zu bilden, die die Manchette verankern und Kräfte aus dem Zytoskelett auf den Kern übertragen. Zusammenfassend zeigen die schwerwiegenden Auswirkungen auf die kernzytoplasmatische Verbindung während der Spermienentwicklung, die durch den Verlust von SUN4 entstanden, einen direkten Nachweis einer entscheidenden Rolle von SUN4 und anderen LINC-Komplex-Komponenten für die Spermienkopfentwicklung und Fertilität bei Säugetieren. KW - Maus KW - spermiogenesis KW - Fertilität KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Molekularbiologie KW - LINC complex KW - SUN domain proteins KW - sperm head formation KW - fertility KW - Spermiogenese KW - Spermienbildung KW - Kernproteine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139092 ER - TY - THES A1 - Dagvadorj, Nergui T1 - Improvement of T-cell response against WT1-overexpressing leukemia by newly developed anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins T1 - Verbesserung der T-Zellantwort gegen WT1-überexprimierende Leukämie mit neu entwickelten anti-hDEC205-WT1-Antikörperfusionsproteinen N2 - Wilms tumor protein 1 (WT1) is a suitable target to develop an immunotherapeutic approach against high risk acute myeloid leukemia (AML), particularly their relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). As an intracellular protein traversing between nucleus and cytoplasm, recombinant expression of WT1 is difficult. Therefore, an induction of WT1-specific T-cell responses is mostly based on peptide vaccination as well as dendritic cell (DC) electroporation with mRNA encoding full-length protein to mount WT1-derived peptide variations presented to T cells. Alternatively, the WT1 peptide presentation could be broadened by forcing receptor-mediated endocytosis of DCs. In this study, antibody fusion proteins consisting of an antibody specific to the human DEC205 endocytic receptor and various fragments of WT1 (anti-hDEC205-WT1) were generated for a potential DC-targeted recombinant WT1 vaccine. Anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins containing full-length or major parts of WT1 were not efficiently expressed and secreted due to their poor solubility and secretory capacity. However, small fragment-containing variants: anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were obtained in good yields. Since three of these fusion proteins contain the most of the known immunogenic epitopes in their sequences, the anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were tested for their T-cell stimulatory capacities. Mature monocyte-derived DCs loaded with anti-hDEC205-WT191-138 could induce ex vivo T-cell responses in 12 of 16 blood samples collected from either healthy or HSC transplanted individuals compared to included controls (P < 0.01). Furthermore, these T cells could kill WT1-overexpressing THP-1 leukemia cells in vitro after expansion. In conclusion, alongside proving the difficulty in expression and purification of intracellular WT1 as a vaccine protein, our results from this work introduce an alternative therapeutic vaccine approach to improve an anti-leukemia immune response in the context of allogeneic HSCT and potentially beyond. N2 - Für die Entwicklung eines immuntherapeutischen Ansatzes zur Behandlung von hoch Risikopatienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und insbesondere zur Vorbeugung von Rezidiven nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) stellt das Wilms-Tumor-Protein 1 (WT1) ein geeignetes Angriffsziel dar. Die rekombinante Expression von WT1, welches als Transkriptionsfaktor vom Zytosol in den Zellkern transloziert, gestaltet sich äußerst schwierig. WT1-spezifische T-Zellantworten werden daher hauptsächlich mittels Peptidvakzinierung oder Transfektion dendritischer Zellen (DC) mit mRNA, welche das vollständige WT1-Protein kodiert, herbeigeführt. Letzterer Ansatz bietet den Vorteil, dass passierenden T-Zellen eine größere Vielfalt an WT1-Peptidvarianten präsentiert werden kann. Eine verbesserte Peptidpräsentation kann außerdem über eine Optimierung der Rezeptor-vermittelten Endozytose der DCs erzielt werden. Ziel der folgenden Arbeit war es, ein rekombinantes DC-gerichtetes WT1-Vakzin zu entwickeln. Dazu wurden anti-hDEC205-WT1-Fusionsproteine, bestehend aus einem Antikörper gegen den humanen DEC205-Endozytoserezeptor und verschiedenen WT1-Fragmenten, konstruiert. Während sich Fusionsproteine, die das vollständige WT1-Protein oder große Teile dessen beinhalteten, aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und schwachen Sekretion kaum exprimieren und aufreinigen ließen, lieferte die Produktion der Fusionsproteine mit kürzeren WT1-Fragmenten, anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273 und anti-hDEC205-WT1324-371, sehr gute Ausbeuten. Da letztere drei Proteine die meisten bislang bekannten immunogenen WT1-Peptide in ihrer Sequenz enthalten, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur T-Zellstimulation untersucht. Dabei konnte in 12 von 16 Blutproben, die entweder von gesunden Spendern oder SZT-Patienten stammten, gezeigt werden, dass mit anti-hDEC205-WT191-138 beladene, reife, aus Monozyten generierte DCs ex vivo signifikant stärkere T-Zellantworten auslösen als die jeweils mitgeführten Kontrollen (P < 0.01). Nach Expansion waren die so aktivierten WT1-spezifischen T-Zellen sogar in der Lage, die WT1-überexprimierende AML-Zelllinie THP-1 in vitro zu lysieren. In der vorliegenden Arbeit konnten daher nicht nur die bereits bekannten Schwierigkeiten der WT1-Expression und Aufreinigung bestätigt werden, sondern darüber hinaus konnte eine alternative therapeutische Vakzinierungsmethode zur Optimierung der anti-leukämischen Immunantwort im Rahmen einer allogenen SZT entwickelt werden. KW - antileukemia vaccine KW - Wilms tumor protein 1 KW - anti-hDEC205-WT1 antibody fusion protein KW - dendritic cell-targeting KW - Akute myeloische Leukämie KW - Immuntherapie KW - Molekularbiologie Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149098 ER -