TY  - THES
A1  - Önel, Ayla
T1  - Synthese und Relevanz von Oxylipinen in Blättern, Wurzeln und Samen von \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
T1  - Synthesis and relevance of oxylipins in leaves, roots and seeds of \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
N2  - Die Lipidoxidation kann sowohl enzymatisch als auch nicht enzymatisch erfolgen. Der erste Schritt der enzymatischen Oxidation wird durch Lipoxygenasen katalysiert, von welchen es in Arabidopsis thaliana sechs verschiedene Isoformen gibt. Dabei werden die Lipoxygenasen nach dem Kohlenstoffatom klassifiziert, welches sie oxidieren. Somit gehören die LOX1 und LOX5 zu den 9-Lipoxygenasen, während LOX2, LOX3, LOX4 und LOX6 zu den 13 Lipoxygenasen zählen. Während der Samenalterung findet vermehrt eine Lipidperoxidation statt, welche mit einem Verfall des Samens sowie einer verringerten Keimrate korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst erfolgreich ein System zur künstlichen Samenalterung von Arabidopsis thaliana etabliert. Bei der künstlichen Alterung stiegen ähnlich wie bei der natürlichen Samenalterung oxidierte Lipide an und die Keimrate fiel ab. Nach Alterung konnte ein Anstieg von sechs verschiedenen oxidierten Triacylglycerolen detektiert werden. Es konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Mutanten mit Defekten in mehreren der Lipoxygenase Gene gezeigt werden, dass die Oxidation dieser veresterten Fettsäuren zum größten Teil nicht enzymatisch erfolgt. Bei der Alterung stiegen zudem enzymatisch gebildete 9 Lipoxygenase Produkte wie freie Hydroxy- und Ketofettsäuren an. Bei einer Analyse der freien oxidierten Fettsäuren konnte ebenfalls mit Lipoxygenase Mutanten ermittelt werden, dass diese hauptsächlich via LOX1 oxidiert werden. Die Untersuchung der Keimraten der Lipoxygenase Mutanten nach Alterung zeigte in mehreren Versuchen eine leicht erhöhte Keimrate der lox1 im Vergleich zum Wildtyp. Eine exogene Behandlung von Wildtyp Samen mit verschiedenen 9-Lipoxygenase Produkten, welche bei der Alterung ansteigen, führte allerdings nicht zu einer Keimungshemmung. Somit scheinen Produkte wie Hydroxy- und Ketofettsäuren der 9-Lipoxygenase LOX1 nicht die Hauptursache für die Keimungshemmung nach Alterung zu sein.
Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Behandlung der Blüten des Wildtyps mit Methyljasmonat zu einer signifikant höheren Keimrate der Samen im Vergleich zu Samen von unbehandelten Pflanzen nach Alterung führt. Ein „Lipidprofiling“ der Samen von mit Methyljasmonat behandelten Pflanzen wies signifikant geringere Gehalte sowohl an freien als auch veresterten oxidierten Fettsäuren auf, was mit einer erhöhten Lebensfähigkeit korrelierte. Diese Erkenntnisse könnten von großer Relevanz für die Landwirtschaft sein, falls eine Übertragung auf Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine eingehende Untersuchung der Rolle und Funktion der LOX6. Mit Hilfe von GUS Färbungen konnte eine Lokalisation der LOX6 in Blättern und Wurzeln nachgewiesen werden. 
Zudem wurde ein 35SLOX6GFP Konstrukt erstellt und in Arabidopsis thaliana Pflanzen stabil transformiert. Mit den selektionierten Linien könnte in Zukunft auch die intrazelluläre Lokalisation der LOX6 untersucht werden. Außerdem wurden Konstrukte mit dem Reportergen GFP und AOS sowie LOX2 hinter dem 35S Promotor kloniert, welche ebenfalls für weitere Lokalisations- und Kolokalisationsstudien genutzt werden können. Zudem wurde mit der Klonierung eines Konstruktes begonnen, um in Zukunft einen spezifischen LOX6 Antikörper herstellen und auch die endogene LOX6 Lokalisation in dem Wildtyp analysieren zu können. Um die Produkte der LOX6 zu untersuchen, wurden 35SLOX6 Linien sowie die lox6 Mutante verwendet. Obwohl Hydroxyfettsäuren und Jasmonate Folgeprodukte der LOX6 sind, wiesen die 35SLOX6 Linien weder basal, noch nach Stress erhöhte Gehalte dieser im Vergleich zum Wildtyp auf. Somit geben die 35SLOX6 Linien einen Hinweis darauf, dass LOX6 im Wildtyp nicht limitierend für die Produktion von Hydroxyfettsäuren und Jasmonaten sein könnte. Um zu untersuchen, ob das Substrat der LOX6 der limitierende Faktor sein könnte, wurde eine Behandlung mit α Linolensäure durchgeführt. Dabei entstanden allerdings nicht mehr Folgeprodukte der LOX6, sondern es fand sowohl in den 35SLOX6 Linien als auch in dem Wildtyp eine massive nicht enzymatische radikalische Oxidation der Fettsäuren statt. Um festzustellen, ob sich durch eine LOX6 Überexpression das Metabolom ändert, wurde eine „untargeted Analyse“ mit 35SLOX6 Linien durchgeführt. Diese zeigte vier Metabolite, welche in den 35SLOX6 Linien im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich stark vorhanden waren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Physiologie und Stressresistenz in den Überexpressionslinien im Vergleich zum Wildtyp unterscheiden. Dabei zeichneten sich die 35SLOX6 Linien durch kleinere, hellere und rundere Blätter aus. Zudem wurden die Wurzeln der 35SLOX6 Linien bei Fraßversuchen mit Pocellio scaber im Vergleich zum Wildtyp weniger bevorzugt gefressen. Diese Erkenntnisse sowie die generierten Konstrukte und Pflanzenlinien können in der Zukunft einen weiteren Einblick in die vielfältigen Funktionen und Produkte der LOX6 gewähren.
N2  - Lipidoxidation can take place enzymatically and non-enzymatically. The first step of the enzymatic oxidation is catalysed via lipoxygenases. In Arabidopsis thaliana there are six lipoxygenase isoforms. The lipoxygenases are characterized by the carbon atom they oxidise. LOX1 and LOX5 are 9-lipoxygenases, while LOX2, LOX3, LOX4 and LOX6 are 13 lipoxygenases. During seed ageing lipid peroxidation takes place, which correlates with a deterioration of the seed and a lower germination rate. First, a method for artificial ageing of Arabidopsis thaliana seeds was successfully established as a part of this work. During artificial seed ageing, oxidised lipids increased and the germination rate decreased similar to natural ageing. During artificial ageing an accumulation of six oxidised triacylglycerols could be detected. In this work, it could be shown with the help of mutants with defects in the lipoxygenase genes, that the oxidation of esterified fatty acids mainly takes place non-enzymatically. Moreover, enzymatically formed free 9-lipoxygenase products such as hydroxy and keto fatty acids increase during the process of ageing. An analysis of the free fatty acids in lipoxygenase mutants lead to the conclusion that they are formed primarily by LOX1. The lox1 mutant showed a slightly higher germination rate than the wild type after seed ageing in the majority of the experiments. However, an exogenous treatment of wild type seeds with free 9-lipoxygenase products, which increase during ageing, did not inhibit the germination rate. Therefore, LOX1 (9-lipoxygenase) products like hydroxy and keto fatty acids do not seem to be the main cause for the inhibition of germination after ageing. 
In addition, this work shows that a methyl jasmonate treatment of wild type flowers leads to a significant higher germination rate of their seeds after ageing in comparison to the seeds of untreated wild type plants. A lipid profiling revealed significantly lower levels of oxidised esterified as well as free fatty acids after ageing in seeds of treated wild type plants compared to untreated ones, which correlates with a higher germination rate. These findings could be of great value for the agriculture if they are transferable to crop plants.
Another focus of this work was set on investigating the function and relevance of LOX6. The localization of LOX6 in leaves and roots could be confirmed with the help of GUS stainings. Furthermore, a 35SLOX6GFP construct was generated and stably transformed in Arabidopsis thaliana plants. With the selected lines it will be possible to investigate the intracellular localization of LOX6 in the future. Moreover, constructs with the reporter gene GFP and AOS or LOX2 were cloned behind the 35S promoter which can also be used for additional localization and co-localization experiments. To analyse the endogenous localization of LOX6 in the wild type, the cloning of a construct was started to generate a specific antibody in the future. To investigate the different products of LOX6, 35SLOX6 lines and the lox6 mutant were used. Although hydroxy fatty acids and jasmonates are secondary products of LOX6, neither basal nor after different stress treatments elevated levels could be detected in the overexpression lines compared to the wild type. This finding indicates that LOX6 may not be limiting for the production of jasmonates and hydroxy fatty acids in the wild type. Moreover, to investigate if the substrate of LOX6 could be a limiting factor, a treatment with α linolenic acid was performed. However, this did not lead to more LOX6 secondary products but rather to a massive increase of non-enzymatic radical triggered oxidation of fatty acids in the 35SLOX6 lines as well as in the wild type. To examine whether an overexpression of LOX6 leads to changes in the metabolom, an untargeted analysis with 35SLOX6 lines was performed. This analysis revealed four metabolites, which were present in different amounts in 35SLOX6 lines and the wild type. Apart from that, the physiology and stress resistance of the 35SLOX6 lines should be investigated for differences compared to the wild type. The overexpression lines exhibited smaller, rounder and paler leaves. In feeding experiments, the roots of 35SLOX6 plants were less attractive to the rough woodlouse Porcellio scaber than the wild type. The insights of this work, together with the generated constructs and plant lines could help to gain a better understanding of the versatile functions and products of LOX6 in the future.
KW  - Jasmonate
KW  - Lipoxygenase
KW  - Oxylipine
KW  - Samen
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Jasmonate
KW  - Künstliche Samenalterung
KW  - Lipoxygenase 6
KW  - Oxylipine
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141647
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Wehner, Nora
A1  - Weiste, Christoph
A1  - Dröge-Laser, Wolfgang
T1  - Molecular screening tools to study Arabidopsis transcription factors
N2  - In the model plant Arabidopsis thaliana, more than 2000 genes are estimated to encode transcription factors (TFs), which clearly emphasizes the importance of transcriptional control. Although genomic approaches have generated large TF open reading frame (ORF) collections, only a limited number of these genes is functionally characterized, yet. This review evaluates strategies and methods to identify TF functions. In particular, we focus on two recently developed TF screening platforms, which make use of publically available GATEWAY®-compatible ORF collections. (1) The Arabidopsis thaliana TF ORF over-Expression (AtTORF-Ex) library provides pooled collections of transgenic lines over-expressing HA-tagged TF genes, which are suited for screening approaches to define TF functions in stress defense and development. (2) A high-throughput microtiter plate based protoplast trans activation (PTA) system has been established to screen for TFs which are regulating a given promoter:Luciferase construct in planta.
KW  - Biologie
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - transcription factor function
KW  - screening tools
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69226
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wehner, Nora
T1  - Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms
T1  - Establishment and application of molecular tools to analyse the Arabidopsis thaliana transcription factor ORFeome
N2  - Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene für TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufklärung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen für Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen für Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als nützliche Ressourcen für genetische Analysen zur Verfügung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden können. Ein Mikrotiterplatten-System für Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann über die Luciferaseaktivität bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalität des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie überprüft, wobei bekannte Bindungsspezifitäten der TF bestätigt werden konnten. Für das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen für Screening-Ansätze zur Verfügung. Für das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es möglich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolekülen (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ansätzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein höheres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekundärmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zusätzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-Überexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des dafür entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue Überexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erhöhte Toleranz gegenüber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert.
N2  - Transcription factors (TFs) are important cellular regulators of gene expression. In Arabidopsis approximately 1500-2000 genes encode for TFs. Until now, the majority of these genes has not been functionally characterized. To further promote the evaluation of TF function, high-throughput tools are required. In recent years, comprehensive Arabidopsis open reading frame (ORF) collections have been established, which are valuable resources for functional genomics. Based on these collections a high-throughput microtiter plate based Protoplast Trans Activation (PTA) system has been established to screen for TFs which regulate a given promoter:Luciferase construct in planta. 96 protoplast transfection experiments can be performed simultaneously in a standard microtiter plate. Transactivation of a promoter:Luciferase reporter is measured via luciferase imaging. A screening collection of roughly 950 TFs expression vectors has been assembled using Gateway® technology and can be tested in various screening approaches. In this respect, it is possible to analyze transactivating as well as repressive properties. Moreover (I) stimulus induced transcription, (II) studies of protein-protein interaction and (III) the impact of signaling molecules (e.g. kinases) on the promoters activation potential can be measured. To demonstrate the feasibility of the high-throughput system, the transactivating properties of the Ethylene Response Factor (ERF) TF family were studied in combination with the well-characterized RD29A and PDF1.2 promoters. By this means, known binding specificities of the TF family were confirmed. Furthermore, the PTA-System was applied to identify transcriptional regulators involved in plant stress responses. In one approach the influence of bZIP TFs on the auxin-inducibility of the GH3.3-promoter was studied. In particular, bZIP16 and bZIP68 showed a stronger transactivation potential than those bZIPs which were previously described to regulate this auxin-responsive promoter. In an independent approach the transcriptional regulation of tryptophan-derived antifungal compounds (indol-glycosinolates, camalexin) biosynthesis has been studied. ERF TFs of the groups VIII and IX were identified as potential regulators of several biosynthetic genes. A subsequent screening approach of a key promoter of the camalexin biosynthetic pathway disclosed further potential regulators. Among these TFs, many have been described previously in plant pathogen responses. As a second approach to examine TF function the Arabidopsis thaliana TF ORF-EXpression-library (AtTORF-EX) established by Weiste et al. (2007) was extended. The developed high-throughput transformation procedure was used to generate new TF overexpression seed collections. Afterwards the library was applied in a screening approach to identify regulators which mediate enhanced tolerance towards the oxidative stress inducing chemical Paraquat. Thus, the TFs bZIP1 and OBP1 were found to promote resistance against Paraquat when overexpressed in Arabidopsis. In summary, using both approaches novel putative regulators of plant stress response signaling were identfied.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Protoplast
KW  - High throughput screening
KW  - Genaktivierung
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - transcription factor
KW  - protoplast
KW  - high throughput screening
KW  - gene activation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Waller, Frank
A1  - Mueller, Martin J.
A1  - Pedrotti, Lorenzo
T1  - Piriformospora indica Root Colonization Triggers Local and Systemic Root Responses and Inhibits Secondary Colonization of Distal Roots
JF  - PLoS ONE
N2  - Piriformospora indica is a basidiomycete fungus colonizing roots of a wide range of higher plants, including crop plants and the model plant Arabidopsis thaliana. Previous studies have shown that P. indica improves growth, and enhances systemic pathogen resistance in leaves of host plants. To investigate systemic effects within the root system, we established a hydroponic split-root cultivation system for Arabidopsis. Using quantitative real-time PCR, we show that initial P. indica colonization triggers a local, transient response of several defense-related transcripts, of which some were also induced in shoots and in distal, non-colonized roots of the same plant. Systemic effects on distal roots included the inhibition of secondary P. indica colonization. Faster and stronger induction of defense-related transcripts during secondary inoculation revealed that a P. indica pretreatment triggers root-wide priming of defense responses, which could cause the observed reduction of secondary colonization levels. Secondary P. indica colonization also induced defense responses in distant, already colonized parts of the root. Endophytic fungi therefore trigger a spatially specific response in directly colonized and in systemic root tissues of host plants.
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - flowering plants
KW  - fungal spores
KW  - fungi
KW  - gene expression
KW  - marker genes
KW  - plant defenses
KW  - plant signaling
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96493
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stingl, Nadja
T1  - Regulation der Jasmonatbiosynthese durch Lipasen in Arabidopsis thaliana
T1  - Regulation of the biosynthesis of jasmonates by lipases in Arabidopsis thaliana
N2  - Lipasen regulieren die Biosynthese von Jasmonaten, die eine elementare Signalfunktion bei der Entwicklung von Pflanzen und der Abwehr von Pathogenen haben. Entsprechend dem klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ dienen die aus Galaktolipiden freigesetzten Fettsäuren α-18:3 und 16:3 als Substrate der Jasmonsäure (JA)-Synthese. In den letzen zehn Jahren wurden jedoch die Intermediate der JA-Biosynthese 12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA, ausgehend von α-18:3) und Dinor-12-Oxo-Phytodiensäure (dnOPDA, ausgehend von 16:3) verestert in Galaktolipiden der Art Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Die Biosynthese und die mögiche Speicherfunktion dieser komplexen, als Arabidopside bezeichneten, Lipide war jedoch noch unklar. In der Literatur wird ein alternativer Syntheseweg postuliert, in dem analog zum klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ die Biosynthese von veresterter OPDA/dnOPDA ausgehend von veresterter α-18:3/16:3 vollständig in Galaktolipiden der Pastidenmembran stattfindet. Nach Freisetzung von OPDA/dnOPDA durch eine Lipase könnten OPDA/dnOPDA dann als Intermediate in die JA-Biosynthese einfliessen. Sowohl im klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ als auch im postulierten alternativen Syntheseweg ist die Aktivität von Lipasen von essentieller Bedeutung für die JA-Biosynthese. Für zwei plastidäre sn1-spezifische Acyl-Hydrolasen, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) und DONGLE (DGL), wurde eine zentrale Funktion innerhalb der Jasmonat-Biosynthese in Blättern von A. thaliana beschrieben. Dem zufolge ist DGL für die basalen und die frühen wundinduzierten JA-Gehalte und DAD1 für die Aufrechterhaltung der erhöhten JA-Konzentrationen in der späteren Verwundungsantwort verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wiesen drei unabhängige DGL-RNAi-Linien sowie DAD1-Knock-out-Mutanten sowohl unter basalen Bedingungen als auch zu frühen Zeitpunkten nach Verwundung sowie nach Infektion mit dem Bakterienstamm P. syringae DC3000 (avrRPM1) mit dem Wildtyp vergleichbare Konzentrationen an OPDA/JA auf. Dies steht im klaren Widerspruch zu den publizierten Daten. Die Beteiligung von DAD1 an der OPDA/JA-Biosynthese zu späten Zeitpunkten nach Verwundung konnte jedoch bestätigt werden. Ferner konnte eine dramatische Über-Akkumulation von Arabidopsiden in DAD1-defizienten Mutanten nach Verwundung nachgewiesen werden, was auf eine Beteiligung von DAD1 bei der Freisetzung von membrangebundener OPDA/dnOPDA hinweist. Die Analyse der Einzelmutanten 16 weiterer plastidärer Lipasen unter basalen Bedingungen, nach Verwundung und nach Infektion mit P. syringae DC3000 (avrRPM1) zeigte, dass keine der analysierten Mutanten eine essentielle Rolle in der JA-Biosynthese spielt. Jedoch wiesen Mutanten der sn1-spezifischen Lipasen AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) signifikant niedrigere Konzentrationen an dnOPDA, OPDA und JA nach Verwundung auf, was eine indirekte Beteiligung an der JA-Biosynthese vermuten lässt. Blattgewebe einer Quadrupel-Mutanten, welche defizient in vier DAD1-ähnlichen Lipasen (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) ist, wies nach Verwundung mit der AtPLA1-Iγ1-Mutante vergleichbar niedrige Gehalte an dnOPDA, OPDA sowie JA auf. Da stets in sn2-Position vorliegende 16:3/dnOPDA ebenfalls Substrat der JA-Biosynthese sein kann, müssen zusätzlich zu DAD1 und AtPLA1-Iγ1 noch weitere nicht identifizierte sn1- und sn2-spezifische Acyl-Hydrolasen an der JA-Biosynthese nach Verwundung und Pathogeninfektion beteiligt sein. Dies bedeutet, dass entgegen der in der Literatur vertretenen Meinung, nicht eine sondern mehrere Lipasen in redundanter Weise die Biosynthese von Jasmonaten regulieren. Zur Aufklärung der Biosynthese und möglichen Speicherfunktion der ausschließlich in Arabidopsis vorkommenden Arabidopside wurden A. thaliana Keimlinge mit D5-Linolensäure-Ethylester inkubiert, um eine D5-Markierung der komplexen Lipide zu erzielen. Durch einen anschließenden Stressstimulus mittels Zugabe von Silbernitrat wurde die Jasmonat-Synthese induziert. Die vergleichende Analyse der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide MGDG, DGDG, PC sowie der freien OPDA und JA vor und nach Zugabe des Silbernitrats zeigte, eine hohe Übereinstimmung der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B (MGDG-OPDA-OPDA) und Arabidopsid G (OPDA-MGDG-OPDA-OPDA) vor der Silbernitratbehandlung mit denjenigen der durch Silbernitratbehandlung neu gebildeten OPDA/JA. Dagegen wird die hochmarkierte freie Linolensäure nicht direkt zu freier OPDA umgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G direkte Vorstufen von freier OPDA sein können. Damit übereinstimmend konnte gezeigt werden, dass nach Silbernitratstress die Spiege der Vorstufe 18:3-18:3-MGDG abnehmen und zeitgleich die entsprechenden unmittelbaren Metabolite 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G akkumulieren.
N2  - Lipases regulate the biosynthesis of jasmonates. Jasmonates have an essential role in the development and defense of plants. According to the classical „Vick-Zimmerman-Pathway“ α-18:3/16:3 released by hydrolases out of galactolipids serve as substrate for the biosynthesis of jasmonic acid. In the last ten years also the metabolites of the biosynthesis of jasmonic acid OPDA (derived from α-18:3) and dnOPDA (derived from 16:3) were found to be esterified in galactolipids of arabidopsis. The synthesis and function of these complex lipids, named arabidopsides, is yet not known. An alternative Pathway is postulated in the literature. According to this the synthesis of dnOPDA/OPDA takes place in galactolipids. Free dnOPDA/OPDA released by hydrolases may then serve as substrates for the biosynthesis of jasmonic acid. In the classical „Vick-Zimmerman-Pathway“ as well as in the alternative Pathway the activity of lipases have an essential impact on the biosynthesis of jasmonates. Two plastidic acyl-hydrolases with sn1-substrate specificity, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) and DONGLE (DGL), were published to have a essential role in the biosynthesis of jasmonates in leaves of Arabidopsis thaliana. DGL should be responsible for the formation of jasmonic acid under basal conditions and at early timepoints after wounding, DAD1 should maintain the elevated concentrations of jasmonic acid at later timepoints after wounding. In this work the involvement of DAD1 in the biosynthesis of OPDA/JA at later timepoints after wounding was confirmed. However, no differences could be detected in three independent DGL-RNAi-lines and DAD1-knock-out-mutants in comparison to the wild type under basal conditions and at early timepoints after wounding which is contradictory to the published data. In addition, in these mutants wild type oxylipin levels were found after infection with an avirulent bacterial strain of Pseudomonas syringae. Furthermore DAD1-deficient mutants displayed dramatic accumulation of arabidopsides at later timepoints after wounding. Therefore it is suspected that DAD1 is responsible for the release of OPDA esterified in galactolipids. The analysis of single mutants of 16 additional lipases localised in plastids showed no strong differences in comparison to the wildtype under basal conditions, after wounding as well as after infection with P. syringae. Hence, none of the tested lipases plays an essential role in the biosynthesis of jasmonates. However mutants of the sn1-specific acyl-hydrolase AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) showed significant lower concentrations of dnOPDA, OPDA and JA after wounding in comparison to the wildtype. This indicates an involvement of AtPLA1-Iγ1 in the biosynthesis of jasmontes. A quadruple mutant defective in four DAD1-like lipases (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) displayed jasmonate levels similar to the mutant line of AtPLA1-Iγ1 after wounding. The lipids 16:3/dnOPDA are always esterified in sn2 position of glycerolipids. Furthermore 16:3/dnOPDA may also serve as substrates for the biosynthesis of jasmonic acid. The results suggest that, in addition to DAD1 and AtPLA1-Iγ1, still unidentified enzymes with sn1- and sn2-hydrolase activity are involved in wound- and pathogen-induced jasmonate formation, indicating functional redundancy within the lipase family. To clarify the biosynthesis and storage function of arabidopsides, seedlings of A.thaliana were incubated with D5-linolenic acid ethyl ester to produce labelling of complex membrane lipids. Subsequent application of silver nitrate induced the biosynthesis of jasmonates. The analysis of the complex lipids MGDG, DGDG, PC as well as OPDA/JA before and after treatment with silver nitrate showed a high consistency of labelling of the complex lipids 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, arabidopside B (OPDA-OPDA-MGDG) as well as arabidopside G (OPDA-OPDA-MGDG-OPDA) before application of silver nitrate with labelling of the newly synthesised OPDA/JA induced by treatment with silver nitrate. The results suggest, that MGDG-18:3-18:3, 18:3-OPDA-MGDG, arabidopsid B and arabidopsid G are precursors or metabolites of free OPDA, which is a precursor of JA. Furthermore, simultaneous decrease of 18:3-18:3-MGDG and concomitant increase of arabidopsid B and arabidopsid G after application of silver nitrate could be shown. This suggests synthesis of OPDA/dnOPDA in-situ via the alternative pathway.
KW  - Lipasen
KW  - Jasmonate
KW  - Stoffwechselweg
KW  - Regulation
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Jasmonatbiosynthese
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Arabidopside
KW  - Lipases
KW  - Jasmonates
KW  - Biosynthesis of Jasmonates
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Arabidopsides
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56393
ER  - 
TY  - THES
A1  - Steinert, Claudia
T1  - Detektion, Isolierung und Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten aus Ancistrocladus congolensis und Arabidopsis thaliana
T1  - Detection, Isolation, and Struture Elucidation of Secondary Metabolites in Ancistrocladus congolensis and Arabidopsis thaliana
N2  - Die Produktion von Abwehr-, Signal- und Botenstoffen sichert vielen Pflanzen und Mikroorganismen das Überleben in einer sich ständig wandelnden Umwelt mit zahlreichen Konkurrenten und Feinden. Diese Sekundärmetabolite können oft medikamentös gegen Pathogene eingesetzt werden, die den Menschen befallen und Krankheiten verursachen. Die Herausforderung besteht dabei in der selektiven und sensitiven Detektion, der schonenden Isolierung und der richtigen und kompletten Strukturaufklärung dieser Moleküle, sowie der eventuellen synthetischen Modifikation, um eine bessere Verträglichkeit oder Wirkung für den menschlichen Körper zu erreichen. Leistungsfähige chromatographische Instrumente zur Trennung wie HPLC und CZE, emfindliche Detektoren wie UV- und Massenspektrometer, sowie aussagekräftige Messverfahren zur Charakterisierung struktureller Merkmale wie NMR- und CD-Spektroskopie und quantenchemische Rechnungen sind dabei von essentieller Bedeutung. 
Mit diesen – und weiteren – Methoden gelang in der vorliegenden Arbeit die Detektion, Isolierung und Strukturaufklärung neuer Naphthylisochinolin-Alkaloide aus zwei tropischen Ancistrocladus-Lianen, die Charakterisierung von bekannten und neuen Polyketiden aus einem Pilz der Gattung Streptomyces, sowie die Analyse von Glucosinolaten im Phloemsaft der Modellpflanze Arabidopsis thaliana.
N2  - Plants and microorganisms produce a plethora of substrates that ensure immediate and reliable defense and signal transmission processes, to survive in a mostly hostile and rival-dominated enviroment. These compounds often show pharmacological properties which are beneficial for the human health and/or can help to heal and prevent human diseases that are caused by pathogens. To profit from the favorable effects of the metabolites, it is essential to have a high sensitivity and selectivity for the detection, a smooth isolation procedure, and effective methods that lead to the unequivocal elucidation of the absolute stereostructure, which then can be synthetically modified in order to increase the pharmacological impact and/or the tolerance in the human body. Powerful tools to overcome these challenges are chromatographic instruments for the separation like HPLC and CZE, sensitive detection devices like UV and mass spectrometer, and specialized characterization methods like NMR- and CD spectroscopy and quantum-chemical calculations. 
By applying these – and further – analytical and chiroptical methods, the detection, isolation, and structural elucidation of naphthylisoquinoline alkaloids from two tropical Ancistrocladus lianas, the characterization of known and new polyketides from a Streptomyces strain, and the analysis of glucosinolates in the phloem of the model plant Arabidopsis thaliana were achieved within this thesis. ...
KW  - Ancistrocladaceae
KW  - Ancistrocladus
KW  - Glucosinolat
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Sekundärmetabolit
KW  - Strukturaufklärung
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117656
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rienmüller, Florian Christian
T1  - Untersuchung der oxidativen und pH-abhängigen Regulation der vakuolären Protonen-ATPase und calciumabhängigen vakuolären Membranleitfähigkeiten von Arabidopsis thaliana
T1  - Investigation of the oxidative and pH dependent regulation of vacuolar proton-ATPase and calcium dependent vacuolar membrane conductance of Arabidopsis thaliana
N2  - Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium.
Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen. 
Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss.
N2  - This dissertation provides new insights into the oxidative, pH- and ATP-dependent regulation of the V-ATPase function in A. thaliana. For this purpose the proton transport and its regulation was examined electrophysiologically by patch-clamp experiments on mesophyll cells. Additionally intracellular microelectrodes combined with the application of fluorescence imaging on intact root epidermal cells of A. thaliana seedlings allowed investigation of vacuolar membrane conductance and their regulation via cytosolic calcium in vivo.
The voltage dependency of the V-ATPase was recorded at various luminal pH values by the patch-clamp technique. Furthermore thermodynamic calculations showed a decrease of the proton transport rate per hydrolyzed ATP molecule due to an increase of the vacuolar proton concentration. Different cytosolic and vacuolar pH-values combined with increasing ATP-concentrations also provided deeper insights into the principles of the pH dependent regulation of the V-ATPase activity. 
Changes in the cytosolic and luminal pH values on either side of the membrane were found to affect the entire function of the enzyme and thus seem to be transferred to the other side within the V-ATPase. Additionally the data of this dissertation was used by Prof. Dr. Ingo Dreyer (University Politecnica, Madrid, Spain) in the context of cooperation to create a mathematic model. It confirms a feedback system of the proton concentration on the maximum proton transport rate (vmax) and the ATP binding affinity (Km). This model proposes a pH-dependent dissociation of the protons from the V-ATPase also under unfavorable intracellular conditions. Further examinations of the V-ATPase regulation with different mutants in collaboration with Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel and co-workers (University of Bielefeld, Germany) revealed oxidative inhibition of V-ATPase activity due to the removal of disulfide-bond formation within the pump protein. Additionally a possible effect of disulfide-bridge formation on proton coupling rate was shown.
The intracellular microelectrode measurements on intact root cells in the second part demonstrate that changes in the vacuolar membrane conductance of A. thaliana atrichoblasts are related to stress factors caused by the impalement of the electrodes. Further studies by a new method combining the application of fluorescence imaging with the two-electrode voltage-clamp allowed recording of calcium changes and electric membrane conductance within trichoblasts simultaneously. As a result it could be shown that a transient rise of cytosolic calcium is linked to increasing currents of vacuolar membrane conductances in vivo. The unknown origin of these conductances however has to be dedicated to known transport proteins.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - oxidative and pH dependent regulation
KW  - Biomembran
KW  - V-ATPasen
KW  - Leitfähigkeit
KW  - vacuolar proton-ATPase
KW  - calcium dependent membrane conductance
KW  - oxidative and pH dependent regulation
KW  - oxidative und pH-abhängige Regulation
KW  - calciumabhängige Membranleitfähigkeiten
KW  - Arabidopsis thaliana
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104891
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reyer, Antonella
T1  - Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen
T1  - Characterisation of Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii as a non-invasiv, optogenetic tool for the functional analysis of electical signals in plants
N2  - Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert.
N2  - Like animals, plants have the ability to generate electrical signals – membrane potential changes on the plasma membrane. Electrical signals represent the earliest answers that can be observed in plant cells in the course of changing external and internal conditions. Stimuli such as cold, heat, wounding, herbivory and pathogens, as well as physiological processes such as growth and pollination, lead to changes in the potential of the plasma membrane of plant cells. Most of these membrane potential changes consist of rapid depolarization, followed by repolarization of the membrane potential, the kinetics of which can be highly variable depending on the stimulus. In contrast to animals, knowledge about the molecular basis of the generation and transmission of electrical signals in plants is poorly understood. Exceptions include "classically excitable plants" such as the Venus fly trap or mimosa, in which a touch stimulus leads to the triggering of a characteristic action potential, which subsequently leads to an elastic movement based on differential turgor changes. In all other plants, the kinetics of membrane potential changes are highly variable, depending on the stimulus and the physiological state of the cells and – with the exception of the reaction to a cold stimulus – can only be repeated after long latency periods. This prevents a systematic analysis of the molecular basis of electrical signals in most plants. The aim of this work was therefore to establish a non-invasive tool for the functional analysis of electrical signals in plants based on the channelrhodopsin-2 ChR2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, which has been used in neurobiology since 2005. ChR2 is a blue light-activated cation channel that needed all-trans retinal as a cofactor in order to function. In this work, different variants of the ChR2, with a focus on C128T and especially D156C, also known as ChR2-XXL, were used. ChR2 could already be functionally represented by M. Baumann in the context of her dissertation in the transient expression system Nicotiana benthamiana. In the present work, the system was expanded and particularly promising ChR2 variants were characterized not only in N. benthamiana, but also in stable Arabidopsis thaliana lines. The ChR2-XXL identified a suitable optogenetic tool for examining electrical signals in plants. ChR2-XXL offers the possibility to depolarize the membrane potential by short, 5 s blue light pulses on average by 95 mV and then to investigate the repolarization phase. Blue light-inducible, ChR2-XXL-mediated depolarizations could be triggered reproducibly and repeatedly on the same cells as often as desired. ChR2-XXL enables research into the previously inadequate molecular components of the repolarization of the membrane potential in plants. In animal cells, voltage-dependent sodium channels generate depolarization, while voltage-dependent potassium channels determine the depolarization kinetics. The ion gradients changed compared to animal cells suggest that plant depolarization is essentially due to Ca2+-dependent anion channels, which depolarize the membrane potential through the efflux of Cl-. For repolarization, the involvement of outward rectifying potassium channels is postulated. On the other hand, participation of PM H+-ATPases is also suspected, which at the same time make an essential contribution to the generation of the resting potential. In the present work, the use of ChR2-XXL made it possible for the first time to investigate both potential components of the repolarization phase, potassium channels and PM H+-ATPases, using a non-invasive, anion-independent method of depolarization. Through the use of mutants and potassium channel inhibitors, a possible contribution of the outward rectifying potassium channel Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (GORK) to the repolarization phase in Arabidopsis mesophyll cells could almost be excluded. The outward-rectifying potassium channel GORK only opens at membrane potentials more positive than the equilibrium potential for potassium ions (EK (-118 mV)). Since the ChR2-inducible depolarizations, like many natural stimuli, hardly reach this value or only exceed it slightly, GORK makes a minor contribution to repolarization. This suggested that the repolarization from EK to the resting potential at approximately -180 mV, on the other hand, may be accomplished by PM H+-ATPases. The effects of the PM H+-ATPase inhibitor sodium orthovanadate and the PM H+-ATPase activator fusicoccin on the repolarization phase supported this hypothesis. The repolarization kinetics were slowed by inhibition of the PM H+-ATPases and accelerated by their activation. This made it possible for the first time to study the exact influence of the PM H+-ATPases on restoring the membrane potential during repolarization in mesophyll cells. It was also observed that repolarization could be accelerated in the presence of the potassium channel blocker Ba2+. In accordance with the 'pump-and-leak' model, this indicates that weakly inwardly-rectifying potassium channels, such as the Arabidopsis K+ Transporter 2 (AKT2) counteract the PM H+-ATPase-generated proton gradient and thus the resting potential from the sum of the moving charges of pumps and potassium channels is determined. The potential of optogenetic, rhodopsin-based tools for the molecular analysis of electrical signals, in particular using the wide range of light-controlled pumps and channels, their spectral diversity and their intersection with selected Arabidopsis mutants is discussed.
KW  - pflanzliche Elektrophysiologie
KW  - Channelrhodopsin-2
KW  - elektrische Signale
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Optogenetik
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reisberg, Eva
T1  - Der Einfluss von Trichomen und kutikulären Lipiden auf die bakterielle Besiedelung von Arabidopsis thaliana-Blättern
T1  - The influence of trichomes and cuticular lipids on Arabidopsis thaliana leaf-associated bacterial communities
N2  - Die oberirdischen Oberflächen von Pflanzen sind von komplexen mikrobiellen Konsortien besiedelt deren Zusammensetzung von verschiedenen Faktoren abhängig ist. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden zwei Eigenschaften pflanzlicher Oberflächen auf mögliche Auswirkungen auf ihre bakterielle Besiedelung hin untersucht. Dazu wurden Wildtyplinien und Mutanten von Arabidopsis thaliana eingesetzt. Zunächst wurde die bakterielle Besiedelung von A. thaliana Wildtyplinien in kultivierungsbasierten Experimenten untersucht. Es wurde hierbei ein Überblick über die kultivierbare Diversität auf Pflanzen, die unter kontrollierten Bedingungen im Klimaschrank gewachsen waren und Pflanzen, die einen Freilandaufenthalt durchlaufen hatten, gewonnen. Der Einfluss von nicht-drüsigen Trichomen von A. thaliana auf die Quantität und Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde am A. thaliana Col-0-Wildtyp mit normaler Behaarung und der trichomlosen gl1-Mutante untersucht. Mithilfe von DAPI-Färbungen und nachfolgender Zellzählung wurden die bakteriellen Gemeinschaften der beiden Pflanzenlinien quantifiziert. Dabei zeigten sich keine pflanzenlinienspezifischen Unterschiede. Durch die Amplifizierung der bakteriellen 16S rRNA-Gene der Gemeinschaft und den nachfolgenden Einsatz der Denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) wurde ein Überblick über die Diversität der vorherrschenden Bakteriengruppen gewonnen. Obwohl Trichome als bevorzugte Siedlungsplätze von Bakterien gelten, wurden hier auch hinsichtlich der Diversität der bakteriellen Gemeinschaften keine Unterschiede zwischen den untersuchten Pflanzenlinien gefunden. Als weiteres artspezifisches Merkmal von Pflanzenoberflächen wurde die Zusammensetzung der kutikulären Wachse als Einflussfaktor untersucht. Dafür wurden vier eceriferum-Mutanten (cer) von A. thaliana in Landsberg erecta (Ler) Wildtyp-Hintergrund eingesetzt, die sich hinsichtlich der kutikulären Wachszusammensetzung ihrer Blätter unterschieden. Zur Untersuchung der Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde zunächst ein DGGE-Screening durchgeführt. Hier zeigten sich deutliche pflanzenlinienspezifische Unterschiede, die vor allem die Gemeinschaften der cer9- und der cer16-Mutante betrafen. Zur genaueren Charakterisierung der bakteriellen Gemeinschaften der fünf Pflanzenlinien wurde die Amplicon-Pyrosequenzierung eingesetzt. Hierbei stellte sich die bakterielle Diversität auf allen Pflanzenlinien entsprechend des Phyllosphärenhabitats moderat divers und ungleich verteilt dar. Die Identifizierung der sequenzierten Phylotypen ließ eine bakterielle Kerngemeinschaft erkennen. Weiterhin wurden 35 Phylotypen identifiziert, die differenziell auf einzelnen Pflanzenlinien auftraten. Hier handelte es sich um den pflanzenlinienspezifischen Teil der bakteriellen Gemeinschaften. Die statistische Analyse zeigte deutlich divergente Muster für die analysierten Bakteriengemeinschaften der fünf Pflanzenlinien. Vor allem die Gemeinschaften der cer6-, cer9- und cer16-Linie konnten in einer UniFrac-basierten Clusteranalyse von den anderen Pflanzenlinien abgegrenzt werden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Mutationen in der Wachsbiosynthese zu divergenten bakteriellen Gemeinschaften führten.
N2  - The above-ground parts of plants are colonized by diverse microbial consortia. Their composition is determined by several different factors. In the present study, two common features of plant surfaces and their potential effects on phyllosphere bacteria were investigated. Wildtype lines and several mutants of Arabidopsis thaliana were chosen for these investigations. Initially the bacterial communities on A. thaliana were investigated by a cultivation based approach. First insights into the culturable bacterial diversity on plants, that were grown under controlled climatic conditions or had experienced an outdoor growth period, could be provided. The influence of non-glandular trichomes of A. thaliana leaf surfaces on the quantity and diversity of associated bacterial communities was studied. The A. thaliana Col-0 wildtype which has trichomes on its leaves and the trichomeless gl1-mutant were used for the experiments. For quantification of the bacterial communities DAPI-staining and counting of total cells was applied. No plant line-specific differences were observed. To gain an overview on the diversity of the microbiota of the two plant lines, 16S rRNA-gene-based Denaturing Gradientgelelectrophoreses (DGGE) was used. Trichomes have been described to be preferred colonization sites for bacteria. However, in these experiments no differences in the diversity of the bacterial communities on the two plant lines were observed. Moreover the potential effect of plant cuticular wax composition on phyllosphere bacterial communities was studied. Consequently, four eceriferum (cer) wax mutants with distinct alterations in cuticular wax composition and the A. thaliana Landsberg erecta wildtype were selected. For diversity analysis of the communities an initial DGGE-screening was conducted. The community profiles and subsequent statistical analyses showed distinct patterns for the five plant lines, especially for the cer9 and the cer16 mutant. For a more detailed community analysis, a next generation amplicon pyrosequencing approach was conducted. Upon application of this methodology the communities on all five plant lines were shown to be moderately diverse and uneven, typical for phyllosphere habitats. Identification of community members showed a bacterial core community shared by all plant lines. However, a considerable plant line-specific community was detected, consisting of 35 phylotypes which were differentially present on certain plant lines. Statistical analyses of the sequenced bacterial communities showed distinct patterns for the five plant lines. Specifically, the cer6, cer9 and cer16-mutant communities formed distinct clusters in a UniFrac-based analysis. The results showed that the mutations affecting the wax biosynthesis of the investigated plant lines led to divergent associated bacterial communities.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Bakterien
KW  - Phyllosphäre
KW  - phyllosphere
KW  - amplicon pyrosequencing
KW  - bacterial communities
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - cuticular waxes
KW  - Botanik
KW  - Mikrobiologie
KW  - Bakterien
KW  - Ökologie
KW  - Phyllosphäre
KW  - Kutikula
KW  - Vielfalt
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83971
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Nuhkat, Maris
A1  - Brosché, Mikael
A1  - Stoezle-Feix, Sonja
A1  - Dietrich, Petra
A1  - Hedrich, Rainer
A1  - Roelfsema, M. Rob G.
A1  - Kollist, Hannes
T1  - Rapid depolarization and cytosolic calcium increase go hand-in-hand in mesophyll cells' ozone response
JF  - New Phytologist
N2  - Plant stress signalling involves bursts of reactive oxygen species (ROS), which can be mimicked by the application of acute pulses of ozone. Such ozone-pulses inhibit photosynthesis and trigger stomatal closure in a few minutes, but the signalling that underlies these responses remains largely unknown.
We measured changes in Arabidopsis thaliana gas exchange after treatment with acute pulses of ozone and set up a system for simultaneous measurement of membrane potential and cytosolic calcium with the fluorescent reporter R-GECO1.
We show that within 1 min, prior to stomatal closure, O\(_{3}\) triggered a drop in whole-plant CO\(_{2}\) uptake. Within this early phase, O\(_{3}\) pulses (200–1000 ppb) elicited simultaneous membrane depolarization and cytosolic calcium increase, whereas these pulses had no long-term effect on either stomatal conductance or photosynthesis. In contrast, pulses of 5000 ppb O\(_{3}\) induced cell death, systemic Ca\(^{2+}\) signals and an irreversible drop in stomatal conductance and photosynthetic capacity.
We conclude that mesophyll cells respond to ozone in a few seconds by distinct pattern of plasma membrane depolarizations accompanied by an increase in the cytosolic calcium ion (Ca\(^{2+}\)) level. These responses became systemic only at very high ozone concentrations. Thus, plants have rapid mechanism to sense and discriminate the strength of ozone signals.
KW  - reactive oxygen species (ROS)
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Ca\(^{2+}\) indicator
KW  - Ca\(^{2+}\) signalling
KW  - membrane depolarization
KW  - mesophyll
KW  - ozone
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259646
VL  - 232
IS  - 4
ER  -