TY - THES A1 - Wiest, Stephanie T1 - Mutationen im Leukaemia-Inhibitory-Factor (LIF)-Gen bei wiederholtem Implantationsversagen nach extrakorporaler Befruchtung T1 - Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women with recurrent failure of implantation after extracorporal fertilization N2 - Das Implantationsversagen stellt die häufigste Ursache für den Misserfolg der menschlichen Reproduktion dar und spielt wahrscheinlich eine bedeutende Rolle bei wiederholt erfolgloser assistierter Reproduktion (IVF/ICSI und ET). Die hormonell eingeleitete Regulation der Implantation beinhaltet eine komplexe Folge von Signalen zwischen Embryo und Endometrium, deren regelrechter Ablauf für die erfolgreiche Einrichtung einer Schwangerschaft entscheidend ist. Eine Fülle von Faktoren wie Zytokine und Wachstumsfaktoren spielen hier eine bedeutende Rolle. Unter diesen Mediatoren ist auch Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) am Implantationsvorgang beteiligt. Bei weiblichen Mäusen mit einer homozygoten Inaktivierung des LIF-Gens bleibt nach erfolgreicher Befruchtung ihrer Oozyten die Implantation aus, obwohl ihre Blastozysten lebensfähig sind. Die mütterliche LIF-Produktion ist also essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft bei Mäusen. Für die Beteiligung LIFs an der Kontrolle des Implantationsvorgangs auch beim Menschen gibt es eine Reihe von Hinweisen. Das LIF-Protein wird im menschlichen Endometrium zyklusabhängig mit einem Maximum zum Zeitpunkt der Implantation produziert. Menschliche Blastozysten exprimieren zum Zeitpunkt der Implantation mRNA für LIF-Rezeptoren, so dass sie als Ziel der Zytokinwirkung gelten. Ein Mangel an LIF könnte im Zusammenhang mit einigen Formen von Infertilität stehen. In uteriner Spülflüssigkeit idiopathisch infertiler Frauen wurden reduzierte LIF-Konzentrationen nachgewiesen, endometriale Zellen infertiler Frauen, sezernierten signifikant weniger LIF als die fertiler Frauen. Als Grundlage dieser Veränderungen werden Mutationen im LIF-Gen vermutet, die zu reduzierter endometrialer Produktion oder verminderter biologischer Aktivität des Zytokins führen und eine gestörte Implantation der Blastozyste im menschlichen Endometrium zur Folge haben. Im Vorfeld konnte bereits eine signifikant erhöhte Prävalenz von heterozygoten Mutationen im menschlichen LIF-Gen in einer Population von Frauen mit unterschiedlichen Infertilitätsursachen nachgewiesen werden. Bislang liegen nur unzureichende Daten zur Prävalenz von Mutationen im LIF-Gen als mögliche Ursache für ein Implantationsversagen vor. Der Nachweis von Mutationen im LIF-Gen könnte einerseits diagnostisch zur Beurteilung der endometrialen Rezeptivität und der Prognose eines IVF/ICSI-Behandlungsversuches genutzt werden. Andererseits hätte der Nachweis eines LIF-Mangels auf dem Boden einer LIF-Gen-Mutation auch therapeutische Konsequenzen, wenn in Zukunft die Substitution LIFs möglich wäre. Ziel dieser Arbeit war es, die Häufigkeit und Art der Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholt erfolgloser IVF/ICSI-Behandlung zu untersuchen, um ihre Bedeutung für das Implantationsversagen bei der assistierten Reproduktion beurteilen zu können, und zu prüfen, ob der Einsatz eines geeigneten Screeningverfahrens auf LIF-Gen-Mutationen bei diesen Patientinnen sinnvoll erscheint. Zu diesem Zweck wurden 50 Patientinnen mit wiederholtem IVF/ICSI-Versagen und 105 fertile Frauen als Kontrollgruppe auf das Vorliegen von Mutationen im LIF-Gen untersucht. Zum diesem Screening dienten die standardisierte DNA-Extraktion, deren Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Single-Strand Conformation Polymorphism-Analyse (SSCP). Zeigte sich bei der SSCP-Analyse ein abnormes Laufverhalten in den Elektrophoresebanden, erfolgte anschließend die Sequenzierung des DNA-Abschnittes zur Bestätigung und Identifizierung der genetischen Alteration als Mutation oder Polymorphismus. Eine Patientin wies im Exon 3 des LIF-Gens eine heterozygote Transversion (G3453T) auf, welche die Struktur und Funktion des LIF-Proteins jedoch nicht beeinflusst, so dass es sich nicht um eine Mutation, sondern um einen funktionell unbedeutenden Polymorphismus handelt. In einem Fall der Kontrollgruppe fand sich ebenfalls ein Polymorphismus, eine Transition (C3235T) im Intron zwischen Exon 2 und 3. Mutationen mit Auswirkungen auf das Expressionsniveau oder die Bioaktivität LIFs konnten nicht aufgedeckt werden. Die Mutationsrate bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach IVF/ICSI-Therapie ist demnach sehr niedrig und gegenüber fertilen Frauen nicht signifikant erhöht. Damit stehen die Resultate dieser Arbeit im Einklang mit Ergebnissen früherer Studien, wonach LIF beim Menschen zwar eine wichtige Teilfunktion bei der Steuerung des komplexen Implantationsvorganges einnimmt, aber nicht essentiell für seinen Erfolg ist. Aufgrund der niedrigen Prävalenz funktioneller Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach einer IFV/ICSI-Behandlung erscheint ein Screening der betroffenen Patientinnen als Routinemaßnahme zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken nicht gerechtfertigt. N2 - Implantation failure is considered as a major cause of recurrent failure of IVF/ICSI and embryo transfer. Leukaemia inhibitory factor (LIF) is a glycoprotein that plays an important role in reproduction, and particularly in the regulation of implantation. It is normally produced by the endometrium with maximum levels at time of implantation. Decreased concentrations in uterine flushings have been reported to be associated with unexplained infertility. In this study, we have analysed the prevalence of functional LIF gene mutations in women with recurrent IVF/ICSI failure. 50 women with recurrent failure of implantation after IVF/ICSI and 105 controls were screened for LIF gene mutations. Standard genomic DNA extraction, PCR amplification of the LIF gene and single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis were performed to screen for gene alterations which were subsequently confirmed by DNA sequencing. In the study group, one heterozygous LIF gene polymorphism (G3453T) in exon 3 without affecting protein conformation was identified. In the control subjects, one polymorphism (C3235T) in the intron between exon 2 and 3 was found. Mutations with effect on production or biological activity of LIF protein in the endometrium couldn’t be detected. Our study showed a low prevalence of LIF gene mutations in women with recurrent failure of implantation after IVF/ICSI and no difference in frequency of LIF gene alterations when compared with fertile control subjects. Routine screening of LIF gene mutations in this group of women is not justified for the low prevalence of functional mutations. LIF may play a partial role in human implantation, but in contrast to animals it isn’t a crucial factor in successful human implantation. KW - Infertilität KW - assistierte Reproduktion KW - Implantationsversagen KW - Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) KW - Mutationen KW - infertility KW - reproductive medicine KW - failure of implantation KW - leukaemia inhibitory factor (LIF) KW - mutations Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12864 ER - TY - THES A1 - Kuhtz, Juliane T1 - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität T1 - Epimutations of human germ cells and infertility N2 - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. N2 - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring. KW - Epigenetik KW - Sterilität KW - Epimutationen KW - geprägte Gene KW - humane Keimzellen KW - Infertilität Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248 ER -