TY - JOUR A1 - Ye, Liqing A1 - Ambi, Uddhav B. A1 - Olguin-Nava, Marco A1 - Gribling-Burrer, Anne-Sophie A1 - Ahmad, Shazeb A1 - Bohn, Patrick A1 - Weber, Melanie M. A1 - Smyth, Redmond P. T1 - RNA structures and their role in selective genome packaging JF - Viruses N2 - To generate infectious viral particles, viruses must specifically select their genomic RNA from milieu that contains a complex mixture of cellular or non-genomic viral RNAs. In this review, we focus on the role of viral encoded RNA structures in genome packaging. We first discuss how packaging signals are constructed from local and long-range base pairings within viral genomes, as well as inter-molecular interactions between viral and host RNAs. Then, how genome packaging is regulated by the biophysical properties of RNA. Finally, we examine the impact of RNA packaging signals on viral evolution. KW - RNA virus KW - RNA KW - RNA structure KW - genome packaging KW - viral assembly KW - evolution Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246101 SN - 1999-4915 VL - 13 IS - 9 ER - TY - JOUR A1 - Van Haute, Lindsey A1 - Dietmann, Sabine A1 - Kremer, Laura A1 - Hussain, Shobbir A1 - Pearce, Sarah F. A1 - Powell, Christopher A. A1 - Rorbach, Joanna A1 - Lantaff, Rebecca A1 - Blanco, Sandra A1 - Sauer, Sascha A1 - Kotzaeridou, Urania A1 - Hoffmann, Georg F. A1 - Memari, Yasin A1 - Kolb-Kokocinski, Anja A1 - Durbin, Richard A1 - Mayr, Johannes A. A1 - Frye, Michaela A1 - Prokisch, Holger A1 - Minczuk, Michal T1 - Deficient methylation and formylation of mt-tRNA(Met) wobble cytosine in a patient carrying mutations in NSUN3 JF - Nature Communications N2 - Epitranscriptome modifications are required for structure and function of RNA and defects in these pathways have been associated with human disease. Here we identify the RNA target for the previously uncharacterized 5-methylcytosine (m5C) methyltransferase NSun3 and link m5C RNA modifications with energy metabolism. Using whole-exome sequencing, we identified loss-of-function mutations in NSUN3 in a patient presenting with combined mitochondrial respiratory chain complex deficiency. Patient-derived fibroblasts exhibit severe defects in mitochondrial translation that can be rescued by exogenous expression of NSun3. We show that NSun3 is required for deposition of m5C at the anticodon loop in the mitochondrially encoded transfer RNA methionine (mt-tRNAMet). Further, we demonstrate that m5C deficiency in mt-tRNAMet results in the lack of 5-formylcytosine (f5C) at the same tRNA position. Our findings demonstrate that NSUN3 is necessary for efficient mitochondrial translation and reveal that f5C in human mitochondrial RNA is generated by oxidative processing of m5C. KW - Methylation KW - RNA KW - Transferases Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165998 VL - 7 ER - TY - THES A1 - Steinmetzger, Christian T1 - Fluorogenic Aptamers and Fluorescent Nucleoside Analogs as Probes for RNA Structure and Function T1 - Fluorogene Aptamere und Fluoreszierende Nukleosid-Analoga als Sonden für RNA-Struktur und -Funktion N2 - RNA plays a key role in numerous cellular processes beyond the central dogma of molecular biology. Observing and understanding this wealth of functions, discovering new ones and engineering them into purpose-built tools requires a sensitive means of observation. Over the past decade, fluorogenic aptamers have emerged to fill this niche. These short oligonucleotides are generated by in vitro selection to specifically interact with small organic fluorophores and can be utilized as genetically encoded tags for RNAs of interest. The most versatile class of fluorogenic aptamers is based on derivatives of hydroxybenzylidene imidazolone (HBI), a conditional fluorophore mimicking the chromophore structure found in green and red fluorescent proteins. The respective aptamers are well-known by the “vegetable” nomenclature, including Spinach, Broccoli and Corn, and have found numerous applications for studying RNA function in vitro and in cells. Their success, however, is somewhat overshadowed by individual shortcomings such as a propensity for misfolding, dependence on unphysiologically high concentrations of magnesium ions or, in the case of Corn, dimerization that might affect the function of the tagged RNA. Moreover, most fluorogenic aptamers exhibit limited ligand promiscuity by design, thereby restricting their potential for spectral tuning to a narrow window of wavelengths. This thesis details the characterization of a new fluorogenic aptamer system nicknamed Chili. Chili is derived from an aptamer that was originally selected to bind 4-hydroxy-3,5-dimethoxy¬hydroxy-benzylidene imidazolone (DMHBI), resulting in a green fluorescent complex. Unlike other aptamers of its kind, Chili engages in a proton transfer cycle with the bound ligand, resulting in a remarkably large Stokes shift of more than 130 nm. By means of an empirical ligand optimization approach, several new DMHBI derivatives were found that bind to Chili with high affinity, furnishing complexes up to 7.5 times brighter compared to the parent ligand. In addition, Chili binds to π-extended DMHBI derivatives that confer fluorescence in the yellow–red region of the visible spectrum. The highest affinity and degree of fluorescence turn-on for both green and red fluorogenic ligands were achieved by the incorporation of a unique, positively charged substituent into the HBI scaffold. Supplemented by NMR spectroscopy, kinetic and thermodynamic studies showed that the binding site of Chili is loosely preorganized in the absence of ligand and likely forms a G-quadruplex upon ligand binding. To showcase future applications, Chili was incorporated into a FRET sensor for monitoring the cleavage of an RNA substrate by a 10-23 DNAzyme. Besides aptamers as macromolecular fluorescent complexes, fluorescent nucleobase analogs are powerful small isomorphic components of RNA suitable for studying structure and folding. Here, the highly emissive nucleobase analog 4-cyanoindole (4CI) was developed into a ribonucleoside (r4CI) for this purpose. A new phosphoramidite building block was synthesized to enable site-specific incorporation of 4CI into RNA. Thermal denaturation experiments confirmed that 4CI behaves as a universal nucleobase, i.e. without bias towards any particular hybridization partner. Photophysical characterization established r4CI as a generally useful fluorescent ribonucleoside analog. In this work, it was employed to gain further insight into the structure of the Chili aptamer. Using several 4CI-modified Chili–HBI complexes, a novel base–ligand FRET assay was established to obtain a set of combined distance and orientation restraints for the tertiary structure of the aptamer. In addition to their utility for interrogating structure and binding, supramolecular FRET pairs comprising a fluorescent nucleobase analog donor and an innately fluorogenic acceptor hold great promise for the construction of color-switchable RNA aptamer sensor devices. N2 - Weit über das zentrale Dogma der Molekularbiologie hinaus ist RNA an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt. Um diese Prozesse aufzuklären, sie umfassend zu verstehen und sich zunutze zu machen bedarf es geeigneter Detektionsmethoden für RNA. Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurden fluorogene Aptamere als ideales Werkzeug für diesen Zweck erkannt. Dabei handelt es sich um vergleichsweise kurze Oligonukleotide, die mittels in vitro-Selektion zur spezifischen Bindung bestimmter organischer Fluorophore erzeugt werden. Analog zu fluoreszierenden Proteinen können sie zur Fluoreszenzmarkierung von RNA eingesetzt werden. Die wichtigste Klasse fluorogener Aptamere bindet und aktiviert Derivate des latenten Fluorophors 4-Hydroxybenzylidenimidazolon (HBI), welcher ursprünglich im Kern fluoreszierender Proteine autokatalytisch aus einem Tripeptid-Fragment entsteht und deren spektrale Eigenschaften bestimmt. Vertreter dieser Klasse, namentlich Spinach, Broccoli und Corn, haben sich als alltägliches Werkzeug zur Fluoreszenzmarkierung von RNA etabliert. Diesem Erfolg gegenüber stehen Unzulänglichkeiten, die das Potential einzelner Aptamere begrenzen. Beispielsweise kann es zur Ausbildung inaktiver Faltungszustände der RNA kommen oder die Fluoreszenzaktivierung erfordert eine hohe Magnesiumkonzentration, welche in Zellen nicht frei verfügbar ist. Im Fall des Corn-Aptamers bildet sich ein Homodimer, was unter Umständen die zu untersuchende RNA beeinträchtigen kann. Darüber hinaus ist, aufgrund der spezifischen Fluorophorbindung, jeweils nur geringes Potenzial zur gezielten Beeinflussung spektraler Eigenschaften vorhanden. Kern dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung des neuen Chili-Systems. Chili ist die optimierte Version eines Aptamers, welches einen grün fluoreszierenden Komplex mit 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidenimidazolon (DMHBI) ausbildet. Im Gegensatz zu anderen HBI-bindenden Aptameren vollzieht Chili einen Protonenaustausch mit seinem Liganden, woraus Fluoreszenz-emission mit einer ungewöhnlich hohen Stokes-Verschiebung von über 130 nm resultiert. Die Struktur des ursprünglichen Liganden wurde im Hinblick auf höhere Affinität und stärkere Fluoreszenzemission optimiert, wobei ein bis zu 7.5-facher Gewinn an Helligkeit erzielt wurde. Als besonders vorteilhaft hat sich dafür die Einführung eines positiv geladenen Substituenten herausgestellt, der in dieser Form ein Alleinstellungsmerkmal von Chili ist. Auch stark modifizierte DMHBI-Derivate, die ein größeres konjugiertes System besitzen, werden von Chili gebunden und fluoreszieren daraufhin im gelben bis roten Bereich des sichtbaren Spektrums. Studien zur Ligandenbindungskinetik und thermischen Denaturierung des Aptamers legen nahe, dass die zunächst strukturarme Bindungstasche durch die Aufnahme des Liganden einen G-Quadruplex ausbildet, was ebenfalls durch NMR-spektroskopische Daten bestätigt wird. Als Beispiel für mögliche Anwendungen wurde das Chili-Aptamer eingesetzt, um die Spaltung eines RNA-Substrats durch ein 10-23 DNA-Enzym zu beobachten, wobei FRET zwischen dem Aptamer und einem Fluoreszenzmarker am Substrat als Reporter ausgenutzt wurde. Neben makromolekularen Aptamer-Komplexen können fluoreszierende Nukleobasenanaloga als isomorphe Einheiten in RNA integriert werden, um deren Faltungszustand zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde das fluoreszierende Nukleobasenanalogon 4-Cyanodinol (4CI) in das entsprechende Ribonukleosid (r4CI) umgewandelt und daraus ein neuer Phosphoramiditbaustein zum Einbau des fluoreszierenden von 4CI in RNA synthetisiert. Anhand thermischer Denaturierungs¬experimente wurde gezeigt, dass es sich bei 4CI um eine universelle Base handelt, die ungeachtet des Hybridisierungskontexts toleriert wird. Die photophysikalische Charakterisierung von r4CI zeigte, dass das fluoreszierendes Ribonukleosid-Analogon seine nützlichen Eigenschaften nach dem Einbau in Oligonukleotide beibehält, sodass es zur Strukturanalyse des Chili-Aptamers verwendet werden konnte. Mithilfe 4CI-modifizierter Chili–HBI-Komplexe wurden erstmals intramolekulare FRET-Paare dieser Art erzeugt und zur Bestimmung kombinierter Abstands- und Orientierungsparameter genutzt. Über ihre Verwendung für Struktur- und Bindungsstudien hinaus stellen supramolekulare FRET-Paare aus fluoreszierenden Nukleobasen-Analoga als Donoren und intrinsisch fluorogenen Akzeptoren eine Möglichkeit dar, neue schaltbare Aptamer-basierte Sensoren zu entwickeln, welche auf die Erkennung ihrer Zielspezies mit einem Wechsel der Fluoreszenzemissionswellenlänge reagieren. KW - Aptamer KW - Nucleosidanaloga KW - RNS KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - RNA KW - FRET KW - Nucleoside KW - Nucleinsäuren Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207604 ER - TY - THES A1 - Siewert, Aaron T1 - Nucleotide analogs as rigid spin labels for DNA and RNA T1 - Nukleotidanaloga als starre Spinmarker für DNA und RNA N2 - Nucleic acids are one of the important classes of biomolecules together with carbohydrates, proteins and lipids. Both deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) are most well known for their respective roles in the storage and expression of genetic information. Over the course of the last decades, nucleic acids with a variety of other functions have been discovered in biological organisms or created artificially. Examples of these functional nucleic acids are riboswitches, aptamers and ribozymes. In order to gain information regarding their function, several analytical methods can be used. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is one of several techniques which can be used to study nucleic acid structure and dynamics. However, EPR spectroscopy requires unpaired electrons and because nucleic acids themselves are not paramagnetic, the incorporation of spin labels which carry a radical is necessary. Here, three new spin labels for the analysis of nucleic acids by EPR spectroscopy are presented. All of them share two important design features. First, the paramagnetic center is located at a nitroxide, flanked by ethyl groups to prevent nitroxide degradation, for example during solid phase synthesis. Furthermore, they were designed with rigidity as an important quality, in order to be useful for applications like pulsed electron double resonance (PELDOR) spectroscopy, where independent motion of the spin labels relative to the macromolecule has a noticeable negative effect on the precision of the measurements. Benzi-spin is a spin label which differs from most previous examples of rigid spin labels in that rather than being based on a canonical nucleoside, with a specific base pairing partner, it is supposed to be a universal nucleoside which is sufficiently rigid for EPR measurements when placed opposite to a number of different nucleosides. Benzi-spin was successfully incorporated into a 20 nt oligonucleotide and its base pairing behavior with seven different nucleosides was examined by UV/VIS thermal denaturation and continuous wave (CW) EPR experiments. The results show only minor differences between the different nucleosides, thus confirming the ability of benzi-spin to act as a universally applicable spin label. Lumi-spin is derived from lumichrome. It features a rigid scaffold, as well as a free 2'-hydroxy group, which should make it well suited for PELDOR experiments once it is incorporated into RNA oligonucleotides. EÇr is based on the Ç family of spin labels, which contains the most well known rigid spin labels for nucleic acids to this day. It is essentially a version of EÇm with a free 2'-hydroxy group. It was converted to triphosphate EÇrTP and used for primer extension experiments to test the viability of enzymatic incorporation of rigid spin labels into oligonucleotides as an alternative to solid-phase synthesis. Incorporation into DNA by Therminator III DNA polymerase in both single-nucleotide and full-length primer extensions was achieved. All three of these spin labels represent further additions to the expanding toolbox of EPR spectroscopy on nucleic acids and might prove valuable for future research. N2 - Nukleinsäuren sind neben den Kohlenhydraten, Proteinen und Lipiden eine der wichtigen Klassen von Biomolekülen. Sowohl Deoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) sind am besten für ihre Funktionen bei der Speicherung und Expression der genetischen Informationen bekannt. Während der letzten Jahrzehnte wurden Nukleinsäuren mit einer Vielzahl von Funktionen in biologischen Organismen entdeckt oder künstlich hergestellt. Beispiele für diese funktionellen Nukleinsäuren sind Riboswitches, Aptamere und Ribozyme. Um Informationen über ihre Funktionsweisen zu erhalten, können verschiedene analytische Methoden verwendet werden. Elektronenspinresonanzspektroscopie (ESR) ist eine Analysetechnik, die Aufschluss über Struktur und Dynamik von Nukleinsäuren geben kann. Für ESR Messungen werden ungepaarte Elektronen benötigt, sodass nicht paramagnetische Verbindungen mit einem Spinmarker modifiziert werden müssen, der ein Radikal trägt. In dieser Arbeit werden drei neue Spinmarker für die ESR Analyse von Nukleinsäuren vorgestellt. Allen liegen zwei Designprinzipien zugrunde. Erstens wird als paramagnetische Verbindung ein Nitroxid verwendet, welches von Ethylgruppen flankiert wird um das Radikal zu stabilisieren, zum Beispiel gegen Reagenzien, die in der Festphasensynthese verwendet werden. Zweitens sind die Nitroxide Teil starrer Ringsysteme. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen wie Abstandsmessungen mittels Pulselektronendoppelresonanzspektroskopie (PELDOR), wo die Genauigkeit der Messung von Bewegungen der Spinmarker relativ zum Makromolekül beeinträchtigt wird. Benzi-spin unterscheidet sich von vielen anderen starren Spinmarkern dadurch, dass es nicht auf einem kanonischen Nukleosid mit einem spezifischen Bindungspartner basiert. Stattdessen handelt es sich um ein universelles Nukleosid, das unabhängig vom gegenüberliegenden Nukleosid starr genug für ESR Messungen ist. Benzi-spin wurde erfolgreich in ein Oligonucleotid eingebaut und seine Basenpaarung mit sieben verschiedenen Nukleosiden mittels UV/VIS Schmelzkurven und Continuous Wave (CW) ESR Experimenten untersucht. Die Ergebnisse zeigen nur geringe Unterschiede zwischen den verschiedenen Nukleosiden, was die Einsetzbarkeit von Benzi-spin als universeller Spinmarker bestätigt. Lumi-spin ist vom Lumichrom abgeleitet. Es zeichnet sich durch ein starres Gerüst und eine freie 2'-Hydroxygruppe aus, wodurch es gut für PELDOR Messungen in RNA geeignet sein sollte. EÇr gehört zur Ç Familie, welche die am besten bekannten starren Spinmarker für Nukleinsäuren enthält. Es handelt sich um eine Version von EÇm mit einer freien 2'-Hydroxygruppe. EÇr wurde zum Triphosphat EÇrTP konvertiert und für Primer Extension Experimente verwendet um die Möglichkeit des enzymatischen Einbaus starrer Spinmarker in Oligonukleotide als Alternative zur Festphasensynthese zu prüfen. Der Einbau in DNA mit Therminator III DNA Polymerase in Primer Extensions war erfolgreich. Alle drei Spinmarker erweitern die Möglichkeiten der ESR-spektroskopischen Untersuchung von Nukleinsäuren und können sich für zukünftige Forschung als nützlich erweisen. KW - Nucleinsäuren KW - DNS KW - RNS KW - Elektronenspinresonanzspektroskopie KW - Spin-Sonde KW - Nucleic acids KW - DNA KW - RNA KW - EPR spectroscopy KW - Spin labels Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247657 ER - TY - JOUR A1 - Schöttker, Björn A1 - Schmidt-Wolf, Ingo G. H. T1 - Pulsing with blast cell lysate or blast-derived total RNA reverses the dendritic cell-mediated cytotoxic activity of cytokine-induced killer cells against allogeneic acute myelogenous leukemia cells T1 - Pulsen mit Blastenzelllysat oder Blasten-Gesamt-RNA richtet die durch dendritische Zellen vermittelte Aktivität von Zytokin-induzierten Killerzellen gegen allogene akute myeloische Zellen JF - GMS German Medical Science N2 - Immunotherapeutic strategies may be a treatment option in patients with refractory acute myelogenous leukemia (AML) or, in cases of complete remission after conventional therapy regimens, may help to reduce disease recurrence or delay time to progression. Evidence suggests a key role of dendritic cells (DCs) in cancer immunotherapy due to their capacity to present tumour antigens to effector cells. We generated cytokine-induced killer (CIK) cells from healthy donors and examined their responses in vitro in an LDH release assay against three cell lines and allogeneic HLA non-matched blasts from three patients with de novo AML after coincubation with autologous peripheral blood monocyte-derived DCs. Although DCs were unable to enhance CIK cell effects against all three cell lines tested, the cytotoxic activity against the patients’ AML cells increased after coculture with mature DCs, which was significant in two of three patients. However, neither prior pulsing of the DCs with blast cell lysates nor with leukemic cell-derived total RNA further enhanced the lytic capacity of the CIK cells. On the contrary, pulsing reduced or even reversed the cytotoxic activity of the effector cells. This decrease of allogeneic cytotoxicity led us to conclude that monocyte-derived DCs may be useful in autologous or allogeneic vaccine strategies for the treatment of AML or in priming donor lymphocytes in vitro, but unfractionated antigens as pulsing agents may have inhibitory effects on T cell efficiency and their employment in immunotherapeutic strategies for AML seems questionable. N2 - Immuntherapeutische Strategien können eine Behandlungsoption bei Patienten mit refraktärer akuter myeloischer Leukämie (AML) sein oder in den Fällen einer kompletten Remission nach konventionellen Therapieformen helfen, das Wiederauftreten der Krankheit zu verhindern oder die Zeit bis zur Progression zu verlängern. Es gibt Hinweise darauf, dass dendritische Zellen (DCs) eine zentrale Rolle in der Krebs-Immuntherapie spielen aufgrund ihrer Fähigkeit, tumorantigene Effektor-Zellen zu präsentieren. Wir stellten Zytokin-induzierte Killer (CIK)-Zellen von gesunden Spendern her und untersuchten deren Reaktionen in vitro in einem Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay gegen Zelllinien und allogene HLA nicht übereinstimmende Blasten von drei Patienten mit de novo AML nach Koinkubation mit autologen aus dem peripheren Blut abgeleiteten DCs. Obwohl DCs die CIK Zellen Wirksamkeit gegen alle drei getesteten Zelllinien nicht verbessern konnten, wurde die zytotoxische Aktivität gegen die Patienten-AML-Zellen nach Kokultur mit reifen DCs in zwei von drei Patienten signifikant erhöht. Doch weder ein Pulsen der DCs mit blastären Zelllysaten noch mit aus leukämischen Zellen gewonnener Gesamt-RNA konnten die lytische Kapazität der CIK-Zellen weiter verbessern. Im Gegenteil, gepulste DCs reduzierten sogar die zytotoxische Aktivität der Effektorzellen. Dieser Rückgang der allogenen Zytotoxizität führte uns zu dem Schluss, dass von Monozyten abgeleitete DCs nützlich sein könnten in autologen oder allogenen Impfstrategien zur Behandlung von AML. Unfraktionierte Antigene zum Pulsen von DC können dagegen hemmende Wirkung auf T-Zellen haben. KW - dendritic cells KW - AML KW - blast-derived RNA KW - Zytokin-induzierte Killerzellen KW - Zelllysat KW - cytokine-induced killer cells KW - blast cell lysate KW - dendritische Zellen KW - RNA Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:0183-0001410 VL - 9 IS - Doc18 ER - TY - JOUR A1 - Schmidtke, Cornelius A1 - Findeiß, Sven A1 - Sharma, Cynthia M. A1 - Kuhfuss, Juliane A1 - Hoffmann, Steve A1 - Vogel, Jörg A1 - Stadler, Peter F. A1 - Bonas, Ulla T1 - Genome-wide transcriptome analysis of the plant pathogen Xanthomonas identifies sRNAs with putative virulence functions JF - Nucleic Acids Research N2 - The Gram-negative plant-pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) is an important model to elucidate the mechanisms involved in the interaction with the host. To gain insight into the transcriptome of the Xcv strain 85-10, we took a differential RNA sequencing (dRNA-seq) approach. Using a novel method to automatically generate comprehensive transcription start site (TSS) maps we report 1421 putative TSSs in the Xcv genome. Genes in Xcv exhibit a poorly conserved -10 promoter element and no consensus Shine-Dalgarno sequence. Moreover, 14% of all mRNAs are leaderless and 13% of them have unusually long 5'-UTRs. Northern blot analyses confirmed 16 intergenic small RNAs and seven cis-encoded antisense RNAs in Xcv. Expression of eight intergenic transcripts was controlled by HrpG and HrpX, key regulators of the Xcv type III secretion system. More detailed characterization identified sX12 as a small RNA that controls virulence of Xcv by affecting the interaction of the pathogen and its host plants. The transcriptional landscape of Xcv is unexpectedly complex, featuring abundant antisense transcripts, alternative TSSs and clade-specific small RNAs. KW - SUBSP carotovora KW - regulatory RNA KW - gene-cluster KW - campestris PV vesicatoria KW - escherichia coli KW - determines pathgenicity KW - hypersensitive response KW - ralstonia solanacearum KW - extracellular enzymes KW - secretion systems KW - transcription initiation site KW - RNA sequence analyses KW - messanger RNA KW - plants KW - libraries KW - genome KW - genes KW - gene expression profiling KW - genetic transcription KW - northern blotting KW - untranslated regions KW - xanthomonas KW - xanthomonas campestris KW - bacteria KW - virulence KW - pathogenetic organism KW - RNA KW - small RNA KW - pathogenicity KW - type III secretion system pathways KW - maps KW - consesus KW - host (organism) KW - type III protein secretion system complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131781 VL - 40 IS - 5 SP - 2020 EP - 2031 ER - TY - INPR A1 - Scheitl, Carolin P. M. A1 - Mieczkowski, Mateusz A1 - Schindelin, Hermann A1 - Höbartner, Claudia T1 - Structure and mechanism of the methyltransferase ribozyme MTR1 T2 - Nature Chemical Biology N2 - RNA-catalysed RNA methylation was recently shown to be part of the catalytic repertoire of ribozymes. The methyltransferase ribozyme MTR1 catalyses the site-specific synthesis of 1-methyladenosine (m\(^1\)A) in RNA, using O\(^6\)-methylguanine (m\(^6\)G) as methyl group donor. Here we report the crystal structure of MTR1 at a resolution of 2.8 Å, which reveals a guanine binding site reminiscent of natural guanine riboswitches. The structure represents the postcatalytic state of a split ribozyme in complex with the m1A-containing RNA product and the demethylated cofactor guanine. The structural data suggest the mechanistic involvement of a protonated cytidine in the methyl transfer reaction. A synergistic effect of two 2'-O-methylated ribose residues in the active site results in accelerated methyl group transfer. Supported by these results, it seems plausible that modified nucleotides may have enhanced early RNA catalysis and that metabolite-binding riboswitches may resemble inactivated ribozymes that have lost their catalytic activity during evolution. KW - Methyltransferase Ribozyme MTR1 KW - Crystal structure of MTR1 KW - RNA-catalyzed RNA methylation KW - X-ray crystallography KW - RNA Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272170 ET - submitted version ER - TY - JOUR A1 - Okuda, Takumi A1 - Lenz, Ann-Kathrin A1 - Seitz, Florian A1 - Vogel, Jörg A1 - Höbartner, Claudia T1 - A SAM analogue-utilizing ribozyme for site-specific RNA alkylation in living cells JF - Nature Chemistry N2 - Post-transcriptional RNA modification methods are in high demand for site-specific RNA labelling and analysis of RNA functions. In vitro-selected ribozymes are attractive tools for RNA research and have the potential to overcome some of the limitations of chemoenzymatic approaches with repurposed methyltransferases. Here we report an alkyltransferase ribozyme that uses a synthetic, stabilized S-adenosylmethionine (SAM) analogue and catalyses the transfer of a propargyl group to a specific adenosine in the target RNA. Almost quantitative conversion was achieved within 1 h under a wide range of reaction conditions in vitro, including physiological magnesium ion concentrations. A genetically encoded version of the SAM analogue-utilizing ribozyme (SAMURI) was expressed in HEK293T cells, and intracellular propargylation of the target adenosine was confirmed by specific fluorescent labelling. SAMURI is a general tool for the site-specific installation of the smallest tag for azide-alkyne click chemistry, which can be further functionalized with fluorophores, affinity tags or other functional probes. KW - Alkyltransferase Ribozyme SAMURI KW - Site-specific RNA labelling KW - bioorthogonal SAM analogue ProSeDMA KW - Chemical modification KW - RNA Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328762 ER - TY - JOUR A1 - Mieczkowski, Mateusz A1 - Steinmetzger, Christian A1 - Bessi, Irene A1 - Lenz, Ann-Kathrin A1 - Schmiedel, Alexander A1 - Holzapfel, Marco A1 - Lambert, Christoph A1 - Pena, Vladimir A1 - Höbartner, Claudia T1 - Large Stokes shift fluorescence activation in an RNA aptamer by intermolecular proton transfer to guanine JF - Nature Communications N2 - Fluorogenic RNA aptamers are synthetic functional RNAs that specifically bind and activate conditional fluorophores. The Chili RNA aptamer mimics large Stokes shift fluorescent proteins and exhibits high affinity for 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene imidazolone (DMHBI) derivatives to elicit green or red fluorescence emission. Here, we elucidate the structural and mechanistic basis of fluorescence activation by crystallography and time-resolved optical spectroscopy. Two co-crystal structures of the Chili RNA with positively charged DMHBO+ and DMHBI+ ligands revealed a G-quadruplex and a trans-sugar-sugar edge G:G base pair that immobilize the ligand by π-π stacking. A Watson-Crick G:C base pair in the fluorophore binding site establishes a short hydrogen bond between the N7 of guanine and the phenolic OH of the ligand. Ultrafast excited state proton transfer (ESPT) from the neutral chromophore to the RNA was found with a time constant of 130 fs and revealed the mode of action of the large Stokes shift fluorogenic RNA aptamer. KW - Fluorogenic RNA Aptamers KW - Synthetic Functional RNAs KW - Chili RNA Aptamer KW - Co-Crystal Structures of Chili RNA KW - RNA KW - Optical Spectroscopy KW - Structural Biology KW - X-ray Crystallography Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254527 VL - 12 ER - TY - JOUR A1 - Mieczkowski, Mateusz A1 - Steinmetzger, Christian A1 - Bessi, Irene A1 - Lenz, Ann-Kathrin A1 - Schmiedel, Alexander A1 - Holzapfel, Marco A1 - Lambert, Christoph A1 - Pena, Vladimir A1 - Höbartner, Claudia T1 - Large Stokes shift fluorescence activation in an RNA aptamer by intermolecular proton transfer to guanine JF - Nature Communications N2 - Fluorogenic RNA aptamers are synthetic functional RNAs that specifically bind and activate conditional fluorophores. The Chili RNA aptamer mimics large Stokes shift fluorescent proteins and exhibits high affinity for 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene imidazolone (DMHBI) derivatives to elicit green or red fluorescence emission. Here, we elucidate the structural and mechanistic basis of fluorescence activation by crystallography and time-resolved optical spectroscopy. Two co-crystal structures of the Chili RNA with positively charged DMHBO+ and DMHBI+ ligands revealed a G-quadruplex and a trans-sugar-sugar edge G:G base pair that immobilize the ligand by π-π stacking. A Watson-Crick G:C base pair in the fluorophore binding site establishes a short hydrogen bond between the N7 of guanine and the phenolic OH of the ligand. Ultrafast excited state proton transfer (ESPT) from the neutral chromophore to the RNA was found with a time constant of 130 fs and revealed the mode of action of the large Stokes shift fluorogenic RNA aptamer. KW - RNA KW - optical spectroscopy KW - structural biology KW - X-ray crystallography Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270274 VL - 12 ER -