TY - THES A1 - Zdziarski, Jaroslaw Maciej T1 - Bacterial Genome Plasticity and its Role for Adaptation and Evolution of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Strains T1 - Über die Bedeutung der bakteriellen Genomplastizität für die Adaptation und Evolution asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolate N2 - Asymptomatic bacteriuria (ABU) represents the long term bacterial colonization of the urinary tract, frequently caused by Escherichia coli (E. coli), without typical symptoms of a urinary tract infection (UTI). To investigate characteristics of ABU E. coli isolates in more detail, the geno- and phenotypes of eleven ABU isolates have been compared. Moreover, consecutive in vivo re-isolates of the model ABU strain 83972 were characterized with regard to transcriptomic, proteomic and genomic alterations upon long term in vivo persistence in the human bladder. Finally, the effect of the human host on bacterial adaptation/evolution was assessed by comparison of in vitro and in vivo-propagated strain 83972. ABU isolates represent a heterologous group of organisms. The comparative analysis of different ABU isolates elucidated the remarkable genetic and phenotypic flexibility of E. coli isolates. These isolates could be allocated to all four major E. coli phylogenetic lineages as well as to different clonal groups. Accordingly, they differed markedly in genome content, i.e., the genome size as well as the presence of typical UPEC virulence-associated genes. Multi locus sequence typing suggested that certain ABU strains evolved from UPEC variants that are able to cause symptomatic UTI by genome reduction. Consequently, the high E. coli genome plasticity does not allow a generalized view on geno- and phenotypes of individual isolates within a clone. Reductive evolution by point mutations, DNA rearrangements and deletions resulted in inactivation of genes coding for several UPEC virulence factors, thus supporting the idea that a reduced bacterial activation of host mucosal inflammation promotes the ABU lifestyle of these E. coli isolates. Gene regulation and genetic diversity are strategies which enable bacteria to live and survive under continuously changing environmental conditions. To study adaptational changes upon long term growth in the bladder, consecutive re-isolates of model ABU strain 83972 derived from a human colonisation study and from an in vitro long term cultivation experiment were analysed with regard to transcriptional changes and genome rearrangements. In this context, it could be demonstrated that E. coli, when exposed to different host backgrounds, is able to adapt its metabolic networks resulting in an individual bacterial colonisation strategy. Transcriptome and proteome analyses demonstrated distinct metabolic strategies of nutrients acquisition and energy production of tested in vivo re-isolates of strain 83972 that enabled them to colonise their host. Utilisation of D-serine, deoxy- and ribonucleosides, pentose and glucuronate interconversions were main up-regulated pathways providing in vivo re-isolates with extra energy for efficient growth in the urinary bladder. Moreover, this study explored bacterial response networks to host defence mechanisms: The class III alcohol dehydrogenase AdhC, already proven to be involved in nitric oxide detoxification in pathogens like Haemophilus influenzae, was shown for the first time to be employed in defending E. coli against the host response during asymptomatic bacteriuria. Consecutive in vivo and in vitro re-isolates of strain 83972 were also analysed regarding their genome structure. Several changes in the genome structure of consecutive re-isolates derived from the human colonisation study implied the importance of bacterial interactions with the host during bacterial microevolution. In contrast, the genome structure of re-isolates from the in vitro long term cultivation experiment, where strain 83972 has been propagated without host contact, was not affected. This suggests that exposure to the immune response promotes genome plasticity thus being a driving force for the development of the ABU lifestyle and evolution within the urinary tract. N2 - Asymptomatische Bakteriurie (ABU) stellt eine bakterielle Infektion der Harnblase über einen langen Zeitraum dar, die häufig von Escherichia coli hervorgerufen wird, ohne dass typische Symptome einer Harnwegsinfektion auftreten. Um die Charakteristika von ABU E. coli Isolaten genauer zu untersuchen, wurden die Geno- und Phänotypen von 11 ABU-Isolaten verglichen. Außerdem wurden in mehreren aufeinanderfolgenden in vivo-Reisolaten des Modell-ABU Stammes 83972 die Veränderungen im Transkriptom, Proteom und Genom während einer langfristigen Persistenz in der menschlichen Blase charakterisiert. Schließlich wurde der Effekt des menschlichen Wirtes auf die bakterielle Adaptation durch einen Vergleich von in vitro- mit in vivo-kultivierten Stämmen abgeschätzt. ABU-Isolate stellt eine heterogene Gruppe von Organismen dar. Diese können den vier phylogenetischen Hauptgruppen von E. coli sowie unterschiedlichen klonalen Gruppen zugeordnet werden. Dementsprechend unterscheiden sie sich erheblich bezüglich der Zusammensetzung des Genomes, der Genomgröße und auch der Ausstattung mit UPEC-typischen Virulenz-assoziierten Genen. Multi-Lokus-Sequenz-Typisierung legt nahe, dass bestimmte ABU Stämme sich durch Genomreduktion aus UPEC Stämmen entwickelt haben, die eine Harnwegsinfektion mit charakteristischen Symptomen auslösen konnten. Folglich erlaubt die hohe Genomplastizität von E. coli keine generalisierte Betrachtung einzelner Isolate eines Klons. Genomreduktion über Punktmutationen, Genom-Reorganisation und Deletionen resultierte in der Inaktivierung einiger Gene, die für einige UPEC Virulenz-Faktoren kodieren. Dies stützt die Vorstellung, dass eine verminderte bakterielle Aktivierung der Entzündung der Wirtsschleimhaut den Lebensstil von ABU (bei diesen E. coli-)Isolaten fördert. Genregulation und genetische Diversität sind Strategien, die es Bakterien ermöglichen unter sich fortlaufend ändernden Bedingungen zu leben bzw. zu überleben. Um die anpassungsbedingten Veränderungen bei einem langfristigen Wachstum in der Blase zu untersuchen, wurden aufeinanderfolgende Reisolate, denen eine langfristige in vivo-Kolonisierung im menschlichen Wirt beziehungsweise eine in vitro-Kultivierung vorausgegangen ist, im Hinblick auf Veränderungen Genexpression und Genomorganisation analysiert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass E. coli in der Lage ist, seine metabolischen Netzwerke verschiedenen Wachstumsbedingungen anzupassen und individuelle bakterielle Kolonisierungsstrategien entwickeln kann. Transkriptom- und Proteom-Analysen zeigten verschiedene metabolische Strategien zur Nährstoffbeschaffung und Energieproduktion bei untersuchten in vivo-Reisolaten vom Stamm 83972, die es ihnen ermöglichen, den Wirt zu kolonisieren. Das Zurückgreifen auf D-Serin, Deoxy- und Ribonucleoside sowie die bidirektionale Umwandlung zwischen Pentose und Glucuronat waren hoch-regulierte Stoffwechselwege, die die in vivo-Reisolate mit zusätzlicher Energie für ein effizientes Wachstum in der Blase versorgen. Zudem wurden in dieser Studie die Netzwerke für eine Reaktion auf Abwehrmechanismen des Wirtes erforscht: Erstmals wurde hier die Rolle der Klasse-III-Alkoholdehydrogenase AdhC, bekannt durch ihre Bedeutung bei der Entgiftung von Stickstoffmonoxid, bei der Wirtsantwort während einer asymptomatischen Bakteriurie gezeigt. Aufeinanderfolgende in vivo- und in vitro-Reisolate vom Stamm 83972 wurden ebenfalls bezüglich ihrer Genomstruktur analysiert. Einige Veränderungen in der Genomstruktur der aufeinanderfolgenden Reisolate, die von einer humanen Kolonisierungsstudie stammen, implizieren die Bedeutung einer Interaktion der Bakterien mit dem Wirt bei der Mikroevolution der Bakterien. Dagegen war die Genomstruktur von Reisolaten eines langfristigen in vitro-Kultivierungsexperiments, bei dem sich der Stamm 83972 ohne Wirtskontakt vermehrt hat, nicht von Veränderungen betroffen. Das legt nahe, dass die Immunantwort eine Genomplastizität fördert und somit eine treibende Kraft für den ABU Lebensstil und die Evolution im Harnwegstrakt ist. KW - Escherichia coli KW - Evolution KW - Virulenz KW - Molekulargenetik KW - Asymptomatic Bacteriuria KW - Infection KW - UTI KW - UPEC Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32879 ER - TY - THES A1 - Schiller, Roswitha Dorothee T1 - Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli T1 - Studies on virulence properties of typical and atypical uropathogenic Escherichia coli N2 - Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre liefern immer mehr Hinweise darauf, dass eine klare Unterscheidung von Fitness- und Virulenzfaktoren in vielen Fällen, insbesondere bei extraintestinal pathogenen Escherichia coli, nicht möglich ist. So lässt sich auch bei Harnwegsinfektionen verursachenden E. coli den bakteriellen und teils stammspezifischen Faktoren oftmals nicht eindeutig eine typische Virulenz- oder Fitness-assoziierte Funktion zuordnen. Zudem werden in neueren Studien immer häufiger atypische uropathogene Isolate von E. coli beschrieben, die in ihrem „Virulenzrepertoire“ deutlich von typischen uropathogenen E. coli (UPEC) abweichen, da sie keine klassischen UPEC-Virulenzfaktoren aufweisen. In dieser Arbeit wurden daher Virulenzeigenschaften typischer als auch atypischer UPEC untersucht. Der Effekt eines bestimmten bakteriellen Faktors auf den Wirtsorganismus wird teilweise indirekt durch sekundäre Modifikation bedingt. Dies offenbart sich beispielsweise am Autotransporterprotein AIDA-I, dessen Konformation durch posttranslationale Glykosylierung stabilisiert wird, wodurch es seine Funktionalität als Adhäsin erhält. Da bisherige Studien zum AIDA-I homologen Autotransporterprotein Antigen 43 (Ag43) auf der Analyse von künstlich glykosyliertem Protein basieren, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der natürlichen Glykosylierung von Ag43 in UPEC Stamm 536. Es zeigte sich, dass beide Ag43-Varianten von E. coli Stamm 536 natürlicherweise glykosyliert vorliegen, der Grad der Glykosylierung jedoch wesentlich geringer ausfällt als bei natürlich glykosyliertem AIDA-I. Inwieweit die natürliche Glykosylierung von Ag43 zu dessen Funktionalität beiträgt, kann erst durch die Identifizierung der für die Ag43-Glykosylierung verantwortlichen Glykosyltransferase geklärt werden. Die in silico-Analyse des Genoms von UPEC Stamm 536 für potentielle Glykosyltransferasen von Ag43 lieferte neun Kandidatengene. Die Gene wurde teils im Wildtyp-Hintergrund, teils im rfaH-negativen Hintergrund von E. coli Stamm 536 deletiert und die Mutanten im Anschluss phänotypisch charakterisiert. Die Deletion der Kandidatengene waaF, waaG und waaQ, die für Glykosyltransferasen des LPS-Biosynthesesystems kodieren, führte zu den deutlichsten Unterschieden in Bezug auf Motilität, Curli/Zellulose-Produktion, Hämolyseaktivität und Expression von Typ 1 Fimbrien. Der Einfluss des „knock-out“ der Kandidatengene auf die Glykosylierung von Ag43 muss in weiterführenden Studien untersucht werden. Zur Charakterisierung des uropathogenen Virulenzpotentials verschiedener E. coli Stämme in vivo hat sich in den letzten Jahren das murine Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion etabliert. Mit Hilfe dieses Modells wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl spezifische Deletionsmutanten prototypischer UPEC als auch atypische E. coli Harnwegsisolate bezüglich ihrer Urovirulenz getestet und verglichen. Bei der Untersuchung der klassischen UPEC lag der Fokus auf der möglichen Urovirulenzmodulation durch die folgenden spezifischen Faktoren: dem Autotransporterprotein Ag43, dem „Response regulator“ UvrY, dem Polyketid Colibactin sowie dem Exopolysaccharid poly-β-1,6-N-Acetylglucosamin (PGA). Für Ag43 war bei der Etablierung einer Harnwegsinfektion keine eindeutige Funktion feststellbar. Es ist jedoch denkbar, dass Ag43 zur Langzeitpersistenz im Harnwegstrakt beitragen kann, was in weiteren Studien belegt werden sollte. Die Expression von UvrY in der natürlichen uvrY-Deletionsmutante UPEC Stamm 536 ließ keine Erhöhung des Urovirulenzpotentials im Mausmodell erkennen. In diesem Zusammenhang konnte allerdings gezeigt werden, dass die Expression des Genotoxins Colibactin in UPEC Stamm 536 dessen Virulenz signifikant herabsetzte. Die Untersuchungen zur Relevanz des Exopolysaccharids PGA belegen deutlich, dass PGA für die Langzeitpersistenz von E. coli im murinen Harnwegstrakt benötigt wird. Für die initiale Kolonisierung scheint PGA hingegen keine Bedeutung zu haben. Für atypische UPEC Isolate, die Charakteristika von STEC und EAEC zeigen und sich in ihrem Virulenzmuster deutlich von prototypischen UPEC unterscheiden, ließ sich im murinen Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion, verglichen mit dem UPEC Modellorganismus 536, ein ähnliches, teils sogar erhöhtes uropathogenes Virulenzpotential nachweisen. Die Ergebnisse der Arbeit untermauern somit die heutige Vorstellung bezüglich der Entwicklung und Etablierung einer Harnwegsinfektion, dass verschiedene E. coli Stämme unterschiedliche (Kontroll-) Mechanismen entwickelt haben, um erfolgreich den Harnwegstrakt kolonisieren und eine Infektion auslösen zu können. Zudem weisen sie darauf hin, dass diese Fähigkeit nicht auf Isolate typischer phylogenetischer UPEC Entwicklungslinien beschränkt und auf das Vorhandensein charakteristischer UPEC Virulenzfaktoren angewiesen ist. N2 - Research findings over the last years indicate that in many cases, including extraintestinal pathogenic Escherichia coli, a clear distinction between fitness and virulence factors is not possible. Accordingly, the classical distinction of often strain-specific virulence- and fitness-related traits of uropathogenic E. coli (UPEC) can often not be made. Furthermore, recent studies describe atypical UPEC isolates. These isolates remarkably differ in their “virulence repertoire” compared to typical UPEC, because they lack classical UPEC-related virulence factors. Therefore, the aim of the present study was the investigation of virulence properties of typical as well as atypical UPEC strains. The effect of a certain bacterial factor upon the host organism is in part indirectly influenced by secondary modifications. For instance, the conformation of the autotransporter protein AIDA-I is stabilized by posttranslational glycosylation which in turn confers its functionality as an adhesin. Prior studies on the AIDA-I homologous autotransporter protein antigen 43 (Ag43) are based on the analysis of the artificially glycosylated protein. Thus, a key aspect of the current work was to elucidate the naturally occurring glycosylation of Ag43 in UPEC strain 536. For both Ag43 variants of E. coli 536 natural glycosylation was detected. However, Ag43 was less glycosylated than naturally glycosylated AIDA-I. The future identification of the glycosyltransferase responsible for natural glycosylation of Ag43 will help to determine the impact of this posttranslational modification on the functionality of Ag43. In silico analysis of the UPEC strain 536 genome regarding potential glycosyltransferases of Ag43 revealed nine candidate genes. Corresponding deletion mutants of the identified genes were constructed in part in the wild type strain background and in part in the rfaH-negative background of UPEC 536. The most prominent differences concerning motility, curli/cellulose production, hemolytic activity and expression of type 1 fimbriae were observed upon deletion of the genes waaF, waaG or waaQ coding for glycosyltransferases of the LPS biosynthesis pathway. The impact of the deleted candidate genes on the glycosylation of Ag43 has to be further investigated. In recent years the murine model of ascending urinary tract infection was established to characterize the uropathogenic potential of E. coli strains in vivo. By means of this model the uropathogenic potential of different specific “knock-out” mutants of prototypic UPEC strains as well as of atypical E. coli urinary tract isolates was tested and compared. The analysis of the impact of specific factors on the uropathogenic potential of classical UPEC strains focused on the autotransporter protein Ag43, the response regulator UvrY, the genotoxin colibactin, and the exopolysaccharide poly-β-1,6-N-acetylglucosamine (PGA). Ag43 did not exhibit a distinct function during the establishment of urinary tract infection in mice. However, it is conceivable that Ag43 can contribute to long-term persistence in the urinary tract, which should be covered in further studies. Expression of UvrY in the natural uvrY-negative UPEC strain 536 did not increase the uropathogenic potential. However, expression of the genotoxin colibactin significantly reduced the urovirulence of UPEC strain 536. The exopolysaccharide PGA was shown to contribute to long-term persistence of UPEC in the murine model of urinary tract infection. For the initial colonization of the urinary tract, PGA seems to be dispensable. The atypical UPEC isolates investigated in this study display typical characteristics of STEC and EAEC and differ significantly in their virulence gene content compared to prototypic UPEC strains. Nevertheless, in the murine model of ascending UTI many atypical UPEC isolates exhibited a comparable and sometimes even increased uropathogenic potential relative to UPEC model strain 536. The results of this work support the current idea regarding the development and establishment of a urinary tract infection that different E. coli strains have evolved diverse (control-) mechanisms to successfully colonize the urinary tract and provoke an infection. In addition, the findings point out that the ability to cause a urinary tract infection is not limited to phylogenetic lineages of classical UPEC isolates and the presence of characteristic UPEC virulence traits. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Glykosylierung KW - UPEC KW - Autotransporterprotein KW - Glykosyltransferase KW - murines Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907 ER - TY - THES A1 - Hess, Petra T1 - Genetische und molekularbiologische Analyse von fim Determinanten bei Citrobacter freundii und Escherichia coli T1 - Genetical and molecular biological analysis of fim determinants from Citrobacter freundii and Escherichia coli N2 - Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro über einen ausschließlich Mikrotubuli-abhängigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identität zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 Stämmen Invasivität. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adhäsindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Invasionsfähigkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 Stämme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. Für die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Phänotyps demonstriert. Darüber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der für die Invasivität essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut überein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 Stämmen gelang es in Westernblots, das Adhäsin FimCfH an der Bakterienoberfläche nachzuweisen. Dies konnte auch für FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 Stämmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 Stämmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli über das Adhäsin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren vermögen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli Stämmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsfähigkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adhäsintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollständig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den übrigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den übrigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim ähnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli Stämme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend für die Invasivität. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert. N2 - Citrobacter freundii, which belong to the family of Enterobacteriaceae, are Gram-negative, motile and rod shaped bacteria. As an opportunistic pathogen they are known to be involved in urinary tract infections as well as in newborn meningitis. In vitro, the internalization of C. freundii 3009 into the endosomes of the urinary bladder epithelial cell line T24 exclusively follows a microtubule dependent mechanism. Previously, a chromosomal invasion determinant of C. freundii 3009 has been identified and cloned in plasmid pTO3. This invasion determinant shows high identity to the type 1 fimbrial gene cluster (fim) of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Interestingly, non-invasive E. coli K12 strains become invasive, when they are transformed with plasmid pTO3. In contrast, recombinant E. coli K12 strains harbouring the fim operon of either S. enterica serovar Typhimurium and E. coli, respectively, or other E. coli adhesin determinants were not invasive. In this work the genes of this chromosomal determinant, which are essential for invasiveness, were identified. This was achieved on one hand by subcloning parts of the invasion determinant of plasmid pTO3. Subsequently, the ability of the resulting plasmids to confer invasiveness to E. coli K12 strains was examined by gentamicin protection assays. Interestingly, the internalization of those recombinant E. coli K12 strains is not only inhibited by an analogue of the natural receptor of the adhesin FimCfH, namely mannose, but also by chitin hydrolysate [(GlcNAc)n]. On the other hand, mutants of wild type C. freundii 3009 were constructed by deleting the central part of this particular invasion determinant. These chromosomal deletion mutants showed a considerable lower invasion rate of the human epithelial cell line T24 in comparison to the wild type. Complementation of one of these mutants fully restored the wild type phenotype. Furthermore, it is known that C. freundii 3009 is capable to invade and replicate in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC). The results presented here demonstrate that not only C. freundii 3009 is capable to breach the blood-brain-barrier in a newborn rat animal model, but also recombinant E. coli strain HB101pPH1 which carries the chromosomal fimCf determinant. In addition to the functional analysis of the C. freundii 3009 fim determinant by performing gentamicin protection assays and mannose sensitive yeast agglutination, the expression of the corresponding gene products was shown. Proteins essential for invasion, namely FimCfA, FimCfD, FimCfF and FimCfH, were specifically radio labelled using a T7 phage expression system and their molecular weight was determined. The observed molecular weights are in agreement with the calculated ones from deduced amino acid sequences. Furthermore, the presence of the fimbrial adhesin minor subunit FimCfH on the outer surface of C. freundii 3009 as well as appropriate recombinant E. coli K12 strains was shown using Westernblot technique. Expression of the minor subunit FimCfF on the outer surface was also shown for the recombinant E. coli K12 strains using the same technique. However, electron microscopic studies of C. freundii 3009 or E. coli K12 strains harbouring the fimCf determinant indicate that FimCf protein subunits are not assembled in hair like appendages called fimbriae. Since certain type 1 fimbrial variants of E. coli are able to induce bacterial internalization by bladder epithelial cells via the adhesin FimEcH, the fimEc gene cluster from human pathogenic E. coli strains 536 (uropathogenic isolate) and IHE3034 (newborn meningitis isolate) were cloned in order to examine the role of type 1 fimbriae of these strains in invasiveness. In addition, E. coli K1 strain IHE3034 and the isogenic fim negative insertion mutant IHE3034-2 were characterized for their invasion capability. Although type 1 fimbriae are known to be an indispensable virulence factor of uropathogenic E. coli (UPEC), several clinical UPEC strains, which are incapable of expressing this particular adhesin, were isolated and identified. By performing genetic analysis, it could be demonstrated that the fimEc operon is completely deleted from the chromosome in 11 of those isolates. In another 6 isolates the presence of only the 3´-end of the gene fimECH could be found. Furthermore, an IS1 element inserted in the fim deletion was identified in these 6 strains. In the remaining 11 isolates also the DNA region adjacent to the fimEc cluster was affected by this deletion process. In conclusion, it was ascertained that in C. freundii 3009 a fim like determinant functions as an invasion system. Type 1 fimbriae of E. coli strains 536 and IHE3034 are necessary but not sufficient to confer invasiveness. Although type 1 fimbriae of uropathogenic E. coli are known to be an important virulence factor, in several clinical uropathogenic E. coli strains the fimEc operon was deleted. KW - Citrobacter freundii KW - Virulenzfaktor KW - Molekulargenetik KW - Citrobacter freundii KW - UPEC KW - Invasion KW - Typ 1 Fimbrien KW - Harnwegsinfektionen KW - Citrobacter freundii KW - UPEC KW - invasion KW - type 1 fimbriae KW - urinary tract infection Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7635 ER -