TY - THES A1 - Riedel, Simone Stefanie T1 - Characterization of the fluorescence protein FP635 for in vivo imaging and establishment of a murine multiple myeloma model for non-invasive imaging of disease progression and response to therapy T1 - Charakterisierung des Fluoreszenzproteins FP635 für die in vivo Bildgebung und Etablierung eines Maus Modells für die nicht invasive Bildgebung des Krankheitsverlaufes und Ansprechen auf Therapien imMultiplen Myelom N2 - Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen. N2 - Optische in vivo bildgebende Verfahren haben die Felder der Stammzelltransplantation, Graft-versus-Host Krankheit und Graft-versus-Tumor Reaktion vorangebracht. Zwei gut bekannte optische Methoden, die auf der transmission von Licht durch das Versuchtier basieren, sind die Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und die Fluoreszenz Bildgebung (FLI). Beide Methoden erlauben die in vivo Ganzkörperbildgebung desselben Tieres über lange Zeit wärenddessen die Zellverteilung und Proliferation sichtbar gemacht werden kann. Vorteil der BLI ist, dass beinahe keine unspezifischen Hintergrundsignale erzeugt werden und keine Notwendigkeit für Anregungslicht besteht. Daher ist BLI eine hochsensitive und verlässliche Detektionsmethode. Jedoch erlaubt der BLI Reporter, die Luziferase, keine Anwendung mit gängigen Mikroskopieanwendungen und verhindert daher, dass diese Methode für die Bildgebung auf zellulärer Ebene genutzt werden kann. FLI wiederum bietet die attraktive Möglichkeit einen fluoreszenten Reporter sowohl für die Bildgebung des gesamten Körpers, als auch auf zellulärer Ebene durch die Anwendung von Mikroskopietechniken zu nutzen. Derzeit bestehen noch größere Einschränkungen bei der Arbeit mit fluoreszent markierten Zellen innerhalb eines Tieres. Die allgemeine Autofluoreszenz des umliegenden Gewebes führt zu hohen Hintergrundsignalen. Zusätzlich werden sowohl das Anregungslicht als auch die emittierte Fluoreszenz durch das umliegende Gewebe abgeschwächt. Die Absorption des Lichtes geschieht hauptsächlich durch Melanin und Hämoglobin in Wellenlängen bis zu 650 nm. Daher könnte der Wellenlängenbereich über 650 nm sensitive optische Bildgebung auch in tief liegendem Gewebe ermöglichen. Aus diesem Grund werden erhebliche Anstrenungen unternommen um Fluoreszenzproteine (FP) in diesem spektralen Bereich zu isolieren oder genetisch verbesserte zu entwickeln. „Katushka“ auch FP635 genannt hat eine Emission, die nahe an diesem günstigen Spektrum liegt und wurde als eines der hellsten dunkelroten FPs beschrieben. Wir untersuchten FP635 für die Anwendung als sensitiver Einzelreporter für die Detektion immunologischer Prozesse von der Ganzkörper- bis zur Einzelzellbildgebung. Unsere Experimente zeigten auch deutlich die Überlegenheit der BLI über die FLI für die Ganzkörperbildgebung. Basierend auf diesen Ergebnissen setzten wir die überlegene BLI für die Etablierung eines präklinischen Mausmodells des Multiplen Myeloms (MM) ein. MM ist eine B-Zell Erkrankung wobei maligne Plasmazellen klonal im Knochenmark (BM) älterer Menschen expandieren und erhebliche Morbidität und Sterblichkeit verursacht. Chromosomale Abnormitäten gelten als Kennzeichen des MM, sind bei beinahe allen Patienten vorhanden und können sich während des Krankheitsverlaufes anhäufen oder verändern. Die Diagnose des MM basiert auf klinischen Syptomen inklusive der folgenden Kriterien: erhöhte Serum Kalzium Konzentration, Niereninsuffizienz, Anämie und Knochenläsionen (osteolytische Läsionen oder Osteoporose mit Kompressionsfrakturen). Weitere klinische Symptome beinhalten Hyperviskosität, Amyloidose und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Zusätzlich zeigen Patienten verbreitet mehr als 30% klonale BM Plasmazellen und monoklonales Protein ist in Serum und/oder Urin detektierbar. Mit derzeitigen Standardtherapien bleibt MM unheilbar und Patienten, die zwischen 2001 und 2007 mit MM diagnostiziert wurden hatten eine relative 5-jahres Überlebensrate von nur 41%. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente und immunzellbasierten Therapien wünschenswert und notwendig. Zu diesem Zweck entwickelten wir das auf der Zelllinie MOPC-315 basierende syngene MM Mausmodell. Die MOPC-315 Zellen wurden für die in vivo Detektion mittels BLI mit Luziferase markiert. Wir validierten die nichtinvasiv gewonnenen BLI Daten mit Histopathologie, der Messung des idiotypen IgA Spiegels im Serum und Durchflusszytometrie. Alle Methoden bekräftigten die Zuverlässigkeit in vivo BLI Daten für dieses Modell. Wir stellten fest, dass dieses orthotope MM Modell einige Hauptmerkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Die MOPC-315 Zellen wanderten effizient in das BM Kompartiment inklusive darauffolgender Proliferation. Ausserdem, streuten die Zellen in entfernte Teile des Skeletts aus was zum typischen multifokalen MM Wachstum führte. Wir stellten auch osteolytische Läsionen und Knochenumbau fest. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich die Zelllinie Plastizität bewahrte was durch die dynamische Regulation der Rezeptorexpression in verschiedenen Kompartimenten, wie dem BM und der Milz, sichtbar wurde. KW - Fluoreszenzproteine KW - Plasmozytom KW - Biolumineszenzmessung KW - Maus KW - Multiple myeloma KW - bioluminescence imaging KW - fluorescence imaging KW - FP635 KW - mouse model KW - nichtinvasive Bildgebung KW - Multiples Myelom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77894 ER - TY - JOUR A1 - Read, Hannah M. A1 - Mills, Grant A1 - Johnson, Sarah A1 - Tsai, Peter A1 - Dalton, James A1 - Barquist, Lars A1 - Print, Cristin G. A1 - Patrick, Wayne M. A1 - Wiles, Siouxsie T1 - The in vitro and in vivo effects of constitutive light expression on a bioluminescent strain of the mouse enteropathogen Citrobacter rodentium JF - PeerJ N2 - Bioluminescent reporter genes, such as those from fireflies and bacteria, let researchers use light production as a non-invasive and non-destructive surrogate measure of microbial numbers in a wide variety of environments. As bioluminescence needs microbial metabolites, tagging microorganisms with luciferases means only live metabolically active cells are detected. Despite the wide use of bioluminescent reporter genes, very little is known about the impact of continuous (also called constitutive) light expression on tagged bacteria. We have previously made a bioluminescent strain of Citrobacter rodentium, a bacterium which infects laboratory mice in a similar way to how enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) infect humans. In this study, we compared the growth of the bioluminescent C. rodentium strain ICC180 with its non-bioluminescent parent (strain ICC169) in a wide variety of environments. To understand more about the metabolic burden of expressing light, we also compared the growth profiles of the two strains under approximately 2,000 different conditions. We found that constitutive light expression in ICC180 was near-neutral in almost every non-toxic environment tested. However, we also found that the non-bioluminescent parent strain has a competitive advantage over ICC180 during infection of adult mice, although this was not enough for ICC180 to be completely outcompeted. In conclusion, our data suggest that constitutive light expression is not metabolically costly to C. rodentium and supports the view that bioluminescent versions of microbes can be used as a substitute for their non-bioluminescent parents to study bacterial behaviour in a wide variety of environments. KW - bioluminescence KW - lux KW - luciferase KW - biophotonic imaging KW - bioluminescence imaging KW - enteric pathogens KW - animal model KW - reporter genes KW - phenotypic microarray KW - biolog Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166576 VL - 4 IS - e2130 ER - TY - JOUR A1 - Hertlein, Tobias A1 - Sturm, Volker A1 - Jakob, Peter A1 - Ohlsen, Knut T1 - \(^{19}\)F Magnetic Resonance Imaging of Perfluorocarbons for the Evaluation of Response to Antibiotic Therapy in a Staphylococcus aureus Infection Model JF - PLoS ONE N2 - Background The emergence of antibiotic resistant bacteria in recent decades has highlighted the importance of developing new drugs to treat infections. However, in addition to the design of new drugs, the development of accurate preclinical testing methods is essential. In vivo imaging technologies such as bioluminescence imaging (BLI) or magnetic resonance imaging (MRI) are promising approaches. In a previous study, we showed the effectiveness of \(^{19}\)F MRI using perfluorocarbon (PFC) emulsions for detecting the site of Staphylococcus aureus infection. In the present follow-up study, we investigated the use of this method for in vivo visualization of the effects of antibiotic therapy. Methods/Principal findings Mice were infected with S. aureus Xen29 and treated with 0.9% NaCl solution, vancomycin or linezolid. Mock treatment led to the highest bioluminescence values during infection followed by vancomycin treatment. Counting the number of colony-forming units (cfu) at 7 days post-infection (p.i.) showed the highest bacterial burden for the mock group and the lowest for the linezolid group. Administration of PFCs at day 2 p.i. led to the accumulation of \(^{19}\)F at the rim of the abscess in all mice (in the shape of a hollow sphere), and antibiotic treatment decreased the \(^{19}\)F signal intensity and volume. Linezolid showed the strongest effect. The BLI, cfu, and MRI results were comparable. Conclusions \(^{19}\)F-MRI with PFCs is an effective non-invasive method for assessing the effects of antibiotic therapy in vivo. This method does not depend on pathogen specific markers and can therefore be used to estimate the efficacy of antibacterial therapy against a broad range of clinically relevant pathogens, and to localize sites of infection. KW - staphylococcus aureus KW - abscesses KW - vancomycin KW - antibiotics KW - magnetic resonance imaging KW - emulsions KW - bioluminescence imaging KW - in vivo imaging Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130113 VL - 8 IS - 5 ER -