TY - THES A1 - Strohm, Corinna Andrea T1 - Entwicklung CD40/DC-stimulierender rekombinanter Proteine mit Tumorantigen-restringierter Aktivität T1 - Development of CD40/DC-stimulating recombinant proteins with tumor antigen-dependent activity N2 - Dendritische Zellen (DC) sind spezielle Antigen-präsentierende Zellen und daher oft auch in die körpereigene Bekämpfung von Tumoren involviert. Über das CD40-CD40L-System stellen sie ein Ziel in der Tumorimmuntherapieforschung dar. CD40-spezifische Antikörper bewirken jedoch aufgrund der systemischen CD40-Aktivierung schwere Nebenwirkungen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, mit Hilfe von Tumor-spezifischen scFvs (antigenbindenden Einzelkettenfragmenten) Fusionsproteine zu generieren, die ausschließlich bzw. stark bevorzugt Tumor-lokalisiert dendritische Zellen aktivieren. In dieser Arbeit wurde anhand von Kokulturen von Tumorantigen-positiven Tumorzellen mit dendritischen Zellen gezeigt, dass dies möglich ist. Das hierfür generierte Fusionsprotein anti-CD20-Flag-CD40L führte CD20-restringiert, d.h. bei gleichzeitiger Bindung von CD20-positiven Tumorzelllinien (B-Zelllinien) zu einer deutlich verstärkten Aktivierung der DC. Mit einem solchen Fusionsprotein ist nun grundsätzlich die Möglichkeit vorhanden, DCs Tumorantigen-abhängig, das heißt im Tumorgewebe selbst verstärkt zu stimulieren. Die auf diese Weise aktivierten DCs können nun aufgrund der induzierten Veränderungen (IL-12-Produktion, Hochregulation kostimulierender Moleküle) Tumor-lokalisiert eine lokale, auf den Tumor begrenzte Immunantwort auslösen. Auf diese Weise sollte es möglich werden, Nebenwirkungen einer systemischen CD40-Aktivierung zu vermeiden bzw. zu reduzieren. Zudem stellt der Einsatz von anti-CD20-Flag-CD40L möglicherweise sogar eine Option zur Behandlung maligner B-Zell-Lymphome sowie Rituximab-resistenter Lymphome dar. N2 - Dendritic cells (DC) are special antigen presenting cells, often involved in tumor destruction of the immune system. Therefore, the CD40-CD40L-system represents an important target in tumor treatment research. However, there are severe side effects with CD40-specific antibodies because of their systemic effects. The goal of this work was to create fusion proteins with tumor specific single-chain variable fragments (scFv), which are able to activate dendritic cells only tumor located. This principle was shown to work in cocultures with tumor antigen positive tumor cells together with dendritic cells. Anti-CD20-flag-CD40L, a newly generated fusion protein causes an enhanced activation of dendritic cells when additionally ligated to CD20-positive tumorcell lines, e.g. B-cell lines. This means with this kind of protein we are able to activate DC not only in a systemic way, but local directly at the tumor. Once activated, DC are able to release an immune answer. In this way it could be possible to avoid systemic CD40-activation. Additionally, it represents an alternative treatment of malignant B-cell-lymphoms and rituximab resistent lymphoms. KW - Antigen CD40 KW - Dendritische Zelle KW - Rekombinantes Protein KW - Tumorantigen KW - scFv KW - Rituximab KW - Kokultur KW - Tumortherapie KW - IL-12 KW - CD20 KW - dendritic cell KW - CD40 KW - CD20 KW - recombinant protein KW - tumor treatment Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72525 ER - TY - THES A1 - Storim, Julian T1 - Dynamic mapping of the immunological synapse in T cell homeostasis and activation T1 - Dynamische Untersuchung der immunologischen Synapse während T-Zellhomöostase und -aktivierung N2 - Polarity and migration are essential for T cell activation, homeostasis, recirculation and effector function. To address how T cells coordinate polarization and migration when interacting with dendritic cells (DC) during homeostatic and activating conditions, a low density collagen model was used for confocal live-cell imaging and high-resolution 3D reconstruction of fixed samples. During short-lived (5 to 15 min) and migratory homeostatic interactions, recently activated T cells simultaneously maintained their amoeboid polarization and polarized towards the DC. The resulting fully dynamic and asymmetrical interaction plane comprised all compartments of the migrating T cell: the actin-rich leading edge drove migration but displayed only moderate signaling activity; the mid-zone mediated TCR/MHC induced signals associated with homeostatic proliferation; and the rear uropod mediated predominantly MHC independent signals possibly connected to contact-dependent T cell survival. This “dynamic immunological synapse” with distinct signaling sectors enables moving T cells to serially sample antigen-presenting cells and resident tissue cells and thus to collect information along the way. In contrast to homeostatic contacts, recognition of the cognate antigen led to long-lasting T cell/DC interaction with T cell rounding, disintegration of the uropod, T cell polarization towards the DC, and the formation of a symmetrical contact plane. However, the polarity of the continuously migrating DC remained intact and T cells aggregated within the DC uropod, an interesting cellular compartment potentially involved in T cell activation and regulation of the immune response. Taken together, 3D collagen facilitates high resolution morphological studies of T cell function under realistic, in vivo-like conditions. N2 - Zellpolarität und Migration sind essentielle Voraussetzungen für T Zellaktivierung und homöostase sowie für Rezirkulation, und Effektorfunktionen. Um unter homöostatischen bzw. aktivierenden Bedingungen die Koordi¬nation von Polarisation und Migration von T Lymphozyten, die mit dendritischen Zellen (DC) interagieren, zu untersuchen, wurde ein Kollagenmatrix-Model mit niedriger Kollagendichte für konfokale Zeitraffermikro¬skopie und die hochaufgelöste Rekonstruktion fixierter Proben genutzt. Bei kurzen (5-15 min), migratorischen homöostatischen Kontakten behielten voraktivierte T-Zel¬len ihr amöboide Polarisation bei, während sie sich gleichzeitig Richtung DC polarisierten. Die hieraus resultie¬rende, dynamische und asymmetrische Kontaktflä¬che bestand aus allen Kompartimenten der migrierenden T-Zelle: Der F-Aktin-reiche vordere Zellpol („leading edge“) sorgte für Vor¬schub, hatte aber nur einen geringen Anteil an der Singaltransduktion; im mittleren Bereich („mid-zone“) waren MHC/TCR-abhängige Signale mit homöostatischer Proliferation assozi¬iert; und im als Uropod bezeichneten hintere Zellpol fanden sich vor allem MHC-unabhän¬gige Signale, die möglicherweise im Zusammenhang mit kontaktabhängigem Überleben stehen. Diese „dynamische immuno¬logische Synapse“ mit ihren Signaltransduktionsbereichen versetzt wan¬dernde T-Zellen in die Lage, nacheinander Kontakt zu mehreren antigenpräsen¬tierenden oder gewebsspezifischen Zellen aufzunehmen und so Informationen „im Vorbeigehen“ zu sammeln. Im Gegensatz zu homöostatischen Kontakten führte die Bindung des spezifischen Antigens zu langlebigen T Zellen/DC Kontakten, die mit der Abrundung der T Zelle und der Pola¬risation Richtung DC, der Auflösung ihres Uropods sowie der Ausbildung einer symmetri¬schen Kontaktfläche einher gin¬gen. Die Polarität der währenddessen fortge¬setzt migrierenden DC blieb dem gegenüber erhal¬ten und T-Zellen akkumulierten im DC-Uropod, einem interes¬santen Zellkompartiment, dass an T Zell-aktivierung und der Regu¬lation der Immunantwort beteiligt sein könnte. Zusammenge¬fasst ermöglicht das 3D Kollagenmatrix-Modell die hoch aufgelöste morphologische Untersu¬chung von T-Zell¬funk¬tionen unter realistischen, in vivo-artigen Bedingungen. KW - T-Lymphozyt KW - Dendritische Zelle KW - Zellmigration KW - Immunologische Synapse KW - T-Zellaktivierung KW - T-Zellhomöostase KW - Kollagen KW - T lymphocyte KW - dendritic cell KW - immunological synapse KW - migration Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70114 ER - TY - THES A1 - Stade, Anne-Kathrin T1 - Die Bedeutung der LPS-Sialylierung für die Interaktion von Neisseria meningitidis mit humanen Wirtszellen T1 - The impact of the LOS sialylation for the interaction of Neisseria meningitidis with human host cells N2 - Neisseria meningitidis kann rasch tödlich verlaufende Erkrankungen wie die Meningokokken-Meningitis und –Sepsis hervorrufen. In den Industriestaaten werden diese Infektionen meist durch Meningokokken der Serogruppen B und C hervorgerufen. Während für die Serogruppe C bereits ein suffizienter Polysaccharidimpfstoff existiert, konnte ein solcher für Stämme der Serogruppe B aufgrund der Immuntoleranz gegen deren N-acetylneuraminsäure noch nicht gefunden werden. Eine Lebendvakzine könnte dieses Problem lösen, da hier viele verschiedene Antigene, welche eine Immunantwort im menschlichen Körper induzieren, zur Verfügung stünden. Die Voraussetzung für eine Lebendvakzine ist Attenuierung eines B-Meningokokken-Stammes durch die Deletion verschiedener Gene. In früheren Untersuchungen ergaben sich Hinweise darauf, dass die LOS-Sialylierung einen Virulenzfaktor darstellt. Das lst-Gen codiert für die α-2,3-Sialyltransferase, deren Aufgabe es ist, die Sialinsäurereste an die Lacto-N-Neotetraose des LOS zu binden. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass eine lst-Deletionsmutante des Serogruppe-B-Stammes MC58 herstellbar ist. Das Wachstumsverhalten der Mutante in PPM+-Medium unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Auch die Resistenz der Bakterien gegenüber humanem Serum (bis 80%) blieb von der Deletion des lst-Gens unbeeinflusst. Bei der Interaktion mit Epithel- und Endothelzellen allerdings zeigte sich bei der Mutante eine erhöhte Invasivität. Da die Invasion durch Oberflächenproteine wie Opa und Opc vermittelt wird, wäre eine mögliche Begründung für diese Veränderung die bessere Zugänglichkeit dieser Proteine durch das Fehlen der LOS-Sialylierung. Meningokokken mit nicht sialyliertem LOS wurden außerdem von dendritischen Zellen signifikant besser phagozytiert als Wildtyp-Bakterien. Besonders deutlich zeigte sich dies bei fehlender Kapsel. Auch hier ist sicherlich die Maskierung von Bindungsstellen durch Sialinsäuregruppen ein Grund für diese Beobachtung. Weiterhin wurde die Interaktion von Meningokokken verschiedener Serogruppen mit dendritischen Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Polysaccharidkapsel untersucht. Die Meningokokken der untersuchten Serogruppen A, B und C wurden von dendritischen Zellen gut phagozytiert und abgetötet. Allerdings waren sowohl die Adhärenz als auch die Phagozytose bei Vorhandensein einer Polysaccharidkapsel stark inhibiert. Neisseria meningitidis-Stämme aller drei getesteten Serogruppen induzierten eine starke Ausschüttung der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-8. Als ein Induktor dieser Substanzen erwiesen sich die Lipooligosaccharide der Meningokokken. Allerdings zeigte sich in den Versuchen auch, dass noch weitere Bakterienbestandteile eine Zytokinausschüttung hervorrufen können. Die Sialylierung der Lipooligosaccharide hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der produzierten Zytokine. Mit dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass dendritische Zellen mit der Ausschüttung von Zytokinen und der Phagozytose von Bakterien eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Erkrankungen durch Meningokokken spielen könnten. Auch beim Zusammenspiel mit DC-s wirkt die Kapsel als Schutzfaktor vor dem Angriff des menschlichen Immunsystems. Dieser Schutz kann durch die LOS-Sialylierung zusätzlich gesteigert werden. Die Deletion des lst-Gens könnte also als ein Baustein für die Konstruktion eines attenuierten Lebendvakzine-Stammes fungieren. N2 - Neisseria meningitidis can cause fulminant diseases like meningococcal meningitis and sepsis. In the industrialized countries these infections are usually induced by Neisseria meningitidis serogroup B or C. While for serogroup C an effective polysaccharide vaccine has already been developed, such is not available for serogroup B yet due to the immune tolerance against their N-acetylneuraminic acid. A live vaccine could solve this problem since many different antigens, which induce an immune answer in the human body, would be expressed here. A live vaccine does require the attenuation of a N. meningitidis B strain by the deletion of different genes. In earlier investigations there was evidence, that sialylation of neisserial lipooligosaccharide (LOS) is one of the virulence factors of menigococci. The lst-gene codes for the α-2,3-sialyltransferase that terminally links sialic acid to the lacto-N-neotetraose residue of neisserial LOS. In our work we could show, that the deletion of lst-gene from N. meningitidis B wild type strain MC58 is possible. The replication of the mutant in PPM+ medium did not differ from that of the wild type strain. Even the resistance in 80% human serum remained uninfluenced by the deletion of lst-gene. The interaction with human epithelial and endothelial cells however was changed by the mutation. Our lst-deletion-mutant was obvious more invasive than the wild type strain. Since the invasion is dependent on surface proteins such as Opa and Opc, a possible reason for this change would be the better accessibility of these proteins by the lost of sialic acid on LOS. In addition MC58 lst was significantly better phagocytosed by dendritic cells than MC58 wild type. Also here the masking of neisserial surface molecules is for sure a reason for this observation. Furthermore we investigated the interaction of dendritic cells with meningococci of different serogroups. N. meningitidis of the examined serogroups A, B and C was well phagocytosed and killed by dendritic cells. However both the adherence and phagocytosis were strongly inhibited by presence a polysaccharide capsule. N. meningitidis of all three tested serogroups induced a strong production of the cytokines TNF-α, IL-6 and IL-8. Lipooligosaccharide was proved to be an inductor of these substances. However we’ve learned from the investigation that there must be other bacteria components that can cause cytokine production. The sialylation of LOS did not have significant influence on the quantity of the produced cytokines. With this work we were able to prove that dendritic cells could play an important role in the pathogenesis of meningococcal diseases by phagocytosis and production of cytokines. The neisserial polysaccharide capsule is also in regard to the interaction with dendritic cells the key mechanism to avoid the attack of the human immune system. Additionally this protection can be increased by the sialylation of LOS. Therefore the deletion of lst-gene could be one of the components for the construction of an attenuate live vaccine. KW - Neisseria meningitidis KW - Meningokokken KW - LPS-Sialylierung KW - Sialyltransferase KW - dendritische Zellen KW - Neisseria meningitidis KW - meningococci KW - LOS sialylation KW - sialyltransferase KW - dendritic cell Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22374 ER - TY - THES A1 - Song, Bong-Seok T1 - Morphodynamiken der Interaktion zwischen T-Zelle und dendritischer Zelle in dreidimensionaler extrazellulärer Matrix T1 - Physical morphodynamics of T cell-DC-interaction in 3D extracellular matrix N2 - Die Aktivierung der T Zelle bedarf der spezifischen Interaktion zwischen T Zelle und Antigen-präsentierender Zelle unter Ausbildung einer engen Anlagerung beider Zellmembranen („immunologische Synapse“) für Rezeptoren-Interaktionen und konsekutive Signaltransduktion. In dreidimensionaler Kollagenmatrix zeigte sich ein stereotypes, dynamisches Muster bei der Interaktion zwischen CD45RO-positiven humanen T Zellen und antigenpräsentierenden dendritischen Zellen. i) Die Kontaktaufnahme wurde stets über das Leading edge der T Zelle initiiert. ii) Beim dynamischen Kontakt wanderte die T Zelle polarisiert, mit vielen Richtungsänderungen und mit reduzierter Geschwindigkeit auf der DC-Oberfläche, nur unterbrochen von kurzen Stopp- und Abrundungsphasen. Der Uropod der T Zelle stand während der dynamischen Kontakts in kontinuierlicher Verbindung zur DC. iii) Die Loslösung der T Zelle von der DC war ein aktiver Prozess, der durch Interaktion der Vorderfront der T Zelle zu benachbarten Kollagenfasern eingeleitet wurde, gefolgt von der Lösung des Zellkörpers und des Uropods. Alternativ wurden Kontakte durch Uropod-mediierte Retention der T Zelle auf der DC-Oberfläche verlängert. Zur dynamischen molekularen Charakterisierung der Kontaktfläche wurde eine Methode zur Darstellung von Lipid-Rafts an lebenden Zellen in der 3D ECM mit BTRITC etabliert. Die Ergebnisse zeigen ein neues 3-Schritt-Konzept dynamischer und produktiver Interaktionen zwischen T Zelle und DC in vitro. Die assymetrische Kontaktzone impliziert distinkte Funktionen von Vorderfront und Uropod der T Zelle und definiert eine neuartige dynamische Kontaktform für die Signalübertragung zwischen beweglichen Zellen. N2 - Activation of T cells is initiated through specific interaction between a T cell and an antigen-presenting cell. It is believed to be facilitated through formation of an interaction plane at the contact site, called the "immunological synapse" (IS).The IS is defined by recruitment and segregation of cell-surface receptors and adaptor proteins at the cell–cell junction, and is responsible for sustained transmission of intracellular signals. In three-dimensional collagen matrices interaction between CD45RO positive human T cells and autologous antigen-presenting dendritic cells (DC) showed a stereotypical, dynamic pattern. i) First contact was initiated through the leading edge of the migrating T cell. ii) The T cell continued to migrate across the surface of the APC during the dynamic contact with the DC, only interrupted by short static episodes or even rounding. T cell morphology during the migration on the DC was polarized, with a sticky tail called uropod being in continuous contact to the DC surface. The leading edge on the contrary continuously interacted with both the DC-surface and the surrounding interphase, iii) eventually resulting in active traction of the T cell front and body away from the DC. The uropod either detached from the DC surface as well or retained the T cell in contact to the DC, thereby prolonging the interaction. In order to characterize the dynamic molecular pattern of the contact plane a new method for visualization of lipid rafts with BTRITC within living cells in 3D extracellular matrix was established. In summary, a new 3-step-concept of dynamic and productive interactions between T cells and dendritic cells in vitro can be shown. The assymetric interaction plane between the polarized T cell and the DC implies discrete functions of leading edge and uropod of the T cell. A new form of dynamic interaction for signaling between mobile cells has been defined morphologically. KW - Immunologie KW - Morphodynamik KW - T Zell-Aktivierung KW - Dendritische Zelle KW - Lipid Rafts KW - T cell activation KW - immunology KW - morphodynamics KW - dendritic cell KW - lipid rafts Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15397 ER - TY - THES A1 - Mezger, Markus T1 - Interaktion zwischen dem humanen Cytomegalievirus, Aspergillus fumigatus, dendritischen Zellen und neutrophilen Granulozyten T1 - Interaction of the human cytomegalovirus, Aspergillus fumigatus, dendritic cells and polymorphonuclear neutrophils N2 - Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen. N2 - Patients after allogenic stem cell transplantation (alloSCT) have an increased risk to suffer from viral and fungal infections, which are mainly caused by the human cytomegalovirus (HCMV) and the mold Aspergillus fumigatus. Due to their localization in tissues under lung epithelia and the gastrointestinal tract, dendritic cells (DCs) are considered to be the first cells coming into close contact with HCMV and A. fumigatus for the activation of innate and adaptive immune mechanisms. Within the scope of this dissertation, the role of human monocyte-derived DCs in the abatement of HCMV and A. fumgatus was analyzed. In order to work with HCMV, a cell culture system for effective culturing of the clinical relevant HCMV strain TB40E had to be established first. The viral particles up-cleaned from lung fibroblasts were used for infection of DCs and successful infection was approved by different staining methods. For this reason, it was possible to determine a time-dependent expression profile of class I interferons (IFN-alpha, IFN-beta), selected cytokines (CXCL10, CXCL11, Rantes) and immunoreceptors (TLR3, DC-SIGN). A RNA interference (RNAi) system for human DCs was established to significantly knock-down expression of TLR3 without the induction of an unwanted pro-inflammatory cytokine response. Stimulation experiments with the synthetic polymer poly I:C (which resembles dsRNA of infectious viruses) identified TLR3 as a receptor for triggering expression of IFN-beta. However, whether there is a direct activation of TLR3 through dsRNA intermediates, possibly emerging during replication of HCMV, can not be answered to date definitively, because TLR3 small interfering RNA (siRNA) transfection prior to HCMV infection did not result in minor expression of IFN-beta. Gene expression pattern of DCs after co-cultivation with living A. fumigatus germ tubes was studied by whole genome microarray analysis and real-time PCR, demonstrating an upregulation of a broad spectrum of cytokines (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), chemokines (IL-8, CCL20, CXCL10), co-stimulatory molecules (CD40, CD80, CD83, CD86), prostaglandin synthesis genes (PTGS2), as well as genes involved in fungal recognition (PTX-3, TLR2, TLR4) and cytoskeleton organization / phagocytosis. As the sentries of the immune system, DCs must recognize fungi at an early step of infection. Pathogen detection is mediated by different receptors comprising TLRs, C-type lectins and Pentraxines (PTX), but only little is known about their relevance for DCs. Using specific siRNAs, expression of TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN), Pentraxin-3 (PTX-3) and caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) was significantly diminished, respectively. In contrast to control experiments with TLR4 siRNA and LPS stimulation, A. fumigatus induced expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-12) was not reduced when TLR2 and TLR4 expression was knocked-down by specific siRNAs prior to infection. However, using siRNAs directed against Dectin-1 allowed demonstration of an interaction between Dectin-1 and A. fumigatus germlings, Candida albicans germ tubes and Zymosan. In an independent approach, cytokine secretion could be blocked by anti-Dectin-1 antibody treatement prior to fungal exposure. In conclusion, Dectin-1 was identified as an important fungal receptor on DCs whereas TLR2 and TLR4 seemed to play a negligible role. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in various cellular receptor genes are associated with the susceptibility to and severity of infectious diseases. In this study, genetic polymorphisms in genes encoding for virus entry receptors have been analyzed for their association to HCMV reactivation and disease in patients after allogeneic stem cell transplantation. A comparison of different genotyping methods highlighted the advantages of the Light Cycler system, the cycle-suequencing and the matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS) when using small quantities of patients’ DNA. Two markers (rs735240, rs2287886) in the promoter region of DC-SIGN were found to be significantly associated with an increased susceptibility to HCMV. In addition, three SNPs (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 elevated the risk for the development of invasive aspergillosis. Screening of patients after alloSCT for the presence of these defined genetic polymorphisms may help to predict the individual risk to suffer from HCMV and A. fumigatus after alloSCT. KW - Aspergillus fumigatus KW - Cytomegalie-Virus KW - Dendritische Zelle KW - Granulozyt KW - SNP KW - Microarray KW - Toll-like-Rezeptoren KW - RNS-Interferenz KW - Aspergillus fumigatus KW - human cytomegalovirus KW - dendritic cell KW - polymorphonuclear neutrophil KW - SNP KW - Microarray KW - Toll-like Receptor KW - RNA interference Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27254 ER - TY - THES A1 - Matuschek, Anja T1 - Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells T1 - Charakterisierung tolerogener dendritischer Knochenmarkszellen und regulatorischer T-Lymphozyten aus der Ratte N2 - Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. N2 - Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Allogene Zelle KW - Transforming Growth Factor beta KW - tolerogen KW - Dendritische Zelle KW - regulatorische T-Zellen KW - allogen KW - TGF-ß KW - tolerogenic KW - dendritic cell KW - regulatory T cells KW - allogenic KW - TGF-ß Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708 ER - TY - THES A1 - Kretzschmar, Eva T1 - Stimulation von humanen gamma delta T-Lymphozyten durch Poly-Inosin-: Poly-Cytidyl-Säure (Poly (I:C)) T1 - Stimulation of human gamma delta T lymphocytes by polyinosinic-polycytidylic acid (poly(I:C)) N2 - Humane gamma delta T-Zellen stellen eine Gruppe von T-Lymphozyten dar, die neben NKT- und NK-Zellen auch als lymphatische Effektorzellen der angeborenen Immunität beschrieben werden. Nach ihrer Stimulierung tragen sie, in Analogie zu den NK-Zellen, zur schnellen, unspezifischen Infektionsabwehr bei. In dieser Arbeit wurde erstmals der Einfluss von ds-RNS (Poly (I:C)) auf humane gamma delta T-Zellen untersucht. Diese Substanz simuliert in vivo und in vitro die Infektion mit einem Virus und übt pleiotrope Effekte auf eine Reihe von verschiedenen Zellen aus, u. a. auch auf NK-Zellen. Diese Arbeit beschreibt die potente kostimulierende Wirkung von Poly (I:C) auch auf gamma delta T-Zellen: Es induziert deren partielle Aktivierung, sichtbar am Oberflächenmolekül CD69. Daneben stimuliert die ds-RNS die Antigen-spezifische gamma delta T-Zell-Antwort, nachweisbar an einer Zunahme der Proliferation. Die Sekretion von IFN-gamma durch gamma delta T-Zellen ist jedoch nicht gesteigert. Die Wirkungsmechanismen von Poly (I:C) auf gamma delta T-Zellen sind, im Gegensatz zu den NK-Zellen, in erster Linie indirekt. Durch Depletion von CD11c-positiven dendritischen Zellen wird die Poly (I:C)-vermittelte Aktivierung der gamma delta T-Zellen vollständig aufgehoben. Ebenso kann durch Neutralisierung von Typ I Interferonen, die v. a. nach Poly (I:C)-vermittelter Stimulation dieser DCs sezerniert werden, größtenteils eine Aufhebung der Poly (I:C)-vermittelten CD69-Expression auf gamma delta T-Zellen erzielt werden. Diese Ergebnisse legen eine Antigen-unabhängige, schnelle Aktivierung von gamma delta T-Zellen im Rahmen viraler Infektionen nahe. N2 - Human gamma delta T cells are a subset of T lymphocytes, belonging to lymphatic effector cells of innate immunity beside NKT cells and NK cells. After stimulation they contribute in analogy of NK cells to rapid unspecific immune responses. This work investigated for the first time the effect of a double-stranded RNA (mimicked by poly (I:C)) to human gamma delta T cells. This substance simulates a virus infection in vivo and in vitro and exerts pleiotrophic effects on NK cells among a variety of different cells. The thesis states that poly (I:C) has potent gamma delta T cell co-stimulatory capacity: Within PBMCs gamma delta T cells are partially activated expressing increased levels of CD69. Beside this poly (I:C) co-stimulates an antigen-mediated proliferation in response to IPP. The secretion of IFN-gamma isn’t enhanced however. The effect of poly (I:C) on gamma delta T cells is mediated mainly indirectly, in contrast to NK cells. Depletion of CD11+ dendritic cells abrogates the poly (I:C)-mediated activation of gamma delta T cells completely. Neutralizing antibodies against interferons type I secreted by activated DCs almost completely prevent the poly (I:C)-mediated up-regulation of CD69 on gamma delta T cells. These results indicate an antigen independent rapid activation of gamma delta T cells during viral infections. KW - Poly (I:C) KW - gamma delta T-Zelle KW - dendritische Zelle KW - Typ I Interferon KW - Poly(I:C) KW - gamma delta T cell KW - dendritic cell KW - type I interferons Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22754 ER - TY - THES A1 - Kolb-Mäurer, Annette T1 - Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes T1 - Interaction of human dendritic cells with Listeria monocytogenes N2 - Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger. N2 - Dendritic cells (DC) activate naive CD4+ and CD8+ lymphocytes and are therefore critical for the initiation of an immune response against microorganisms. In this work the interaction between DC and L. monocytogenes was examined. Immature DC show a very efficient uptake of L. monocytogenes. Phagocytosis was much higher in the presence of human plasma than with plasma free media or media with fetal calf serum (FCS). However, the addition of immunoglobulins showed a concentration dependent increase in phagocytosis comparable with the addition of human plasma. Human plama contains antibodies against the listerial surface protein p60. By using a iap-deletion mutant it was shown that antibodies against p60 are the main opsonin for the uptake of L. monocytogenes into DC. Because no difference in the uptake of this deletion mutant in the presence or absence of human plasma was observed; antibodies against p60 appear to be resonsible for the efficient uptake of L. monocytogenes and other apathogenic Listeria strains. A major portion of internalized bacteria is found in membrane-bound phagosomes and rarely free in the cytosol. Most of the bacteria that were taken up by DC were killed very efficiently in the phagosome. Interestingly, infection with L. monocytogenes caused maturation of the immature DC into mature DC. This effect appeared to be largely mediated by listerial lipoteichoic acid. Although L. monocytogenes infection is known to induce death in other cell types, DC were relatively resistant and only 20 per cent of infected DC underwent cell death. Uptake, maturation and resistance to apoptosis suggest that DC are essentiel antigen presenting cell (APC) for L. monocytogenes immunity. Thus these observations into the interaction of L. monocytogenes with human DC provide an important into the pathogenesis of Listeria infection as well as providing a basis for Listeria-based vaccination strategies. KW - Mensch KW - Dendritische Zelle KW - Listeria monocytogenes KW - Dendritische Zelle KW - Listeria monocytogenens KW - Apoptose KW - dendritic cell KW - Listeria monocytogenes KW - apoptosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1638 ER - TY - THES A1 - Jesper, Daniel T1 - Einfluss des Tyrosinkinase-Inhibitors Dasatinib auf die Interleukinsekretion und Signaltransduktion dendritischer Zellen T1 - Effects of the tyrosine kinase inhibitor on the secretion of interleukines and signal transduction in dendritic cells N2 - Ziel: Unter dem Tyrosinkinaseinhibitor Dasatinib haben sich bei Patienten Nebenwirkungen gezeigt, die eine immunmodulierende Wirkung des Medikamentes vermuten lassen. Diese Arbeit hatte daher zum Ziel die Auswirkungen von Dasatinib auf dendritische Zellen zu untersuchen. Material und Methoden: Es wurden dendritische Zellen mittels Zugabe von IL4 und GM-CSF aus Monozyten gesunder Spender generiert. Anschließend wurden die Zellen nach Zugabe von Dasatinib mit Zymosan (25 µg/ml) oder LPS (100 ng/ml)zur Ausreifung gebracht und die Phosphorylierung der Signaltransduktionsproteine p38, ERK, Akt, c-jun sowie die Translokation der NFkB-Bestandteile RelA und RelB in den Zellkern mittels Westernblot gemessen. Zudem erfolgt eine Konzentrationsbestimmung der sekretierten Interleukine 10 und 12 im Kulturmedium mittels ELISA. Ergebnisse: Dasatinib inhibierte die die Phosphorylierung der Kinasen p38 und ERK nach Stimulation mit LPS und Zymosan. Zudem kam es zu einer reduzierten Sekretion von Interleukin 10 und einer vermehrten Sekretion von Interleukin 12 unter Dasatinib nach Stimulation mit LPS. Fazit: Dasatinib verstärkt die Sekretion von Interleukin 12 und vermindert die Sekretion von Interleukin 10 in ausgereiften dendritischen Zellen durch Hemmung der Kinasen p38 und ERK, vermutlich indirekt vermittelt über Src-Kinasen. Dies könnte eine Erklärung für immunmodulatorische Effekte wie das Auftreten von Autoimmunerkrankungen und eine LGL-Expansion bei mit Dasatinib behandelten Patienten bieten. N2 - Objective: The tyrosine kinase inhibitor Dasatinib has shown to cause side effect in patients, which suggest a immunomodulating effect of the drug. This study therefore aimed to examine the effects of Dasatinib on dendritic cells. Materials and methods: We generated dendritic cells out of monocytes of healthy individuals under the influence of IL4 and GM-CSF. We then added Dasatinib to the cell culture and induced maturation with zymosan (25 µg/ml) or LPS (100 ng/ml)and examined the phosphorylation of the signaling proteins p38, ERK, Akt and c-jun and the translocation of NFkB-members RelA and RelB into the nucleus with westernblot. We also measured the concentration of secreted interleukin 10 and 12 in the cell culture medium using ELISA. Results: Dasatinib inhibited the phosphorylation of p38 and ERK following LPS- and zymosan-induced maturation. It also enhanced the secretion of interleukin 12 and decreased the secretion of Interleukin 10 after LPS-induced maturation. Conclusion: Dasatinib enhances the secretion of interleukin 12 and inhibits the secretion of interleukin 10 in mature dendritic cells via reduced phosphorylation of p38 and ERK, probably indirectly via inhibition of Src-kinases. These results could provide an explanation for immunomodulating effect of Dasatinib observed in patients like autoimmune disorders and LGL-expansion. KW - Dendritische Zelle KW - Dasatinib KW - dendritic cell Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171794 ER - TY - THES A1 - Döhler, Anja T1 - Regulation der Toleranzinduktion von steady-state migratorischen Dendritischen Zellen durch den Transkriptionsfaktor RelB T1 - Regulation of tolerance induction by steady-state migratory dendritic cells through the transcription factor RelB N2 - Toleranz gegenüber Selbstantigenen in den peripheren Geweben kann durch CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermittelt werden. Diese Zellen entstehen entweder in Folge der thymischen T-Zellselektion (natürlich vorkommende Tregs, nTreg) oder durch Konversion aus naiven T-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen (induzierte Tregs, iTregs). Im Vorfeld der Arbeit war bereits bekannt, dass Dendritische Zellen (DZ) eine wichtige Rolle bei der Generierung von iTreg spielen. Allerdings bestand weitestgehend Unklarheit darüber, welche DZ in welchem Reifungszustand dazu in der Lage sind, iTregs gegen peripher-exprimierte Selbstantigene zu induzieren. Steady-state migratorische DZ (ssmDZ) gelten in dieser Hinsicht als potentielle Kandidaten, da bekannt ist, dass diese DZ bereits unter homöostatischen Bedingungen Selbstantigene aus peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort T-Zellen präsentieren können. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, den Phänotyp und die tolerogene Kapazität der ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten näher zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ssmDZ einen semireifen MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ Phänotyp aufweisen und in vitro mit Hilfe von endogenem TGF-β iTregs induzieren können. Darüber hinaus belegt diese Arbeit zusammen mit weiteren Daten aus unserer Arbeitsgruppe, dass ssmDZ in transgenen K5mOVA-Mäusen zellassoziertes epidermales OVA aus der Haut in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort an CD4+ OVA-spezifische TZR-transgene OT-II T-Zellen präsentieren können. Innerhalb der ssmDZ konnten die Langerin+ dermalen DZ als die DZ-Subpopulation eingegrenzt werden, die für die Konversion von naiven OT-II T-Zellen in CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs verantwortlich war. Ferner zeigte sich, dass CD103 nicht als Marker für ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten herangezogen werden kann. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor RelB auf die partielle Reifung und Migration der ssmDZ hat. RelB ist ein Mitglied der NF-κB-Familie und wird mit der Reifung von DZ in Verbindung gebracht. Erste Experimente zeigten eine nukleäre Translokation von RelB in ssmDZ sowie eine verringerte Frequenz dieser DZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von relB+/- Mäusen und Mäusen mit einer Defizienz für den RelB-Bindungspartner p52. Allerdings konnte bei Mäusen mit einer DZ-spezifischen RelB-Inaktivierung (RelBDCko Mäuse) eine erhöhte Frequenz an ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten festgestellt, die nicht auf einer Zunahme an DZ in der Haut der Tiere zurückzuführen war. Diese Ergebnisse legen einerseits die Vermutung nahe, dass es sich bei den beobachteten Effekte in den relB+/- Mäusen um DZ-extrinsische Auswirkungen auf die ssmDZ handelt. Andererseits scheint RelB unter homöostatischen Bedingungen die Erhaltung und Migration der ssmDZ eher negativ zu beeinflussen. Weitere durchflusszytometrische Analysen wiesen zudem darauf hin, dass RelB in ssmDZ die Expression von Reifungsmarkern nur partiell reguliert. So konnte auf den ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von RelBDCko Mäusen eine erhöhte Expression von CD40 beobachtet werden, während andere Reifungsmarker wie MHC II, CD80 und CD86 nicht signifikant in ihrer Expression betroffen waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem untersucht, wie sich eine RelB-Defizienz in DZ auf die Homöostase und Induktion von Tregs auswirkt. Die hierzu analysierten RelBDCko Mäuse wiesen eine erhöhte Frequenz und absolute Zellzahl an Tregs in allen untersuchten lymphatischen Organen (hautdrainierende Lymphknoten, Milz und Thymus) auf. Darüber hinaus war in diesen Organen auch eine verstärkte Proliferation der Tregs gegenüber den Kontrolltieren festzustellen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation der Tregs in RelBDCko Mäusen in den hautdrainierenden Lymphknoten sogar stärker ausfiel als in der Milz. RelB scheint somit die tolerogene Kapazität der DZ zur Regulation der Treg-Expansion im Thymus und in der Peripherie zu beeinflussen. Unter Verwendung von neutralisierenden αIL-2-Antikörpern konnte zudem belegt werden, dass die periphere Proliferation der Tregs in den RelBDCko Mäusen von IL-2 abhängig ist. Damit einhergehend zeigten erste Vorversuche eine erhöhte IL-2-Produktion in den peripheren lymphatischen Organen von RelBDCko Mäusen. Zusammenfassend legen die Daten dieser Arbeit den Schluss nahe, dass ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten in der Lage sind, Toleranz durch Induktion von iTregs gegen epidermale Selbstantigene zu induzieren. Untersuchungen an neuartigen Mäusen mit einer konditionalen RelB-Inaktivierung spezifisch in DZ deuten darauf hin, dass die Migration und Reifung von ssmDZ partiell durch RelB reguliert wird. Da Tregs eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der peripheren Toleranz einnehmen, ist die Beobachtung, dass eine RelB-Defizienz in allen DZ zu einer verstärkten Treg-Proliferation und somit zu einer veränderten Treg-Homöostase führt, ein intererssanter Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen. N2 - Tolerance against self-antigens from peripheral tissues can be mediated through CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Tregs). These cells develop either during thymic T cell selection (nTregs) or by conversion from naive CD4+ CD25- Foxp3- T cells in peripheral lymphoid organs (induced Tregs, iTregs). During the last years, a role for dendritic cells (DC) in the generation of iTregs has been clearly established. However, the precise DC subset and maturation stage which are required to induce iTregs against peripheral self-antigens remain unknown. Steady-state migratory DC (ssmDC) are a good candidate to carry out such function, since these cells are able to transport self-antigen from peripheral tissues to draining lymph nodes under steady-state conditions. Thus one aim of this thesis was to define the phenotype and tolerogenic capacity of ssmDC in skin-draining lymph nodes. Here, we show that ssmDC display a partially mature MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ phenotype and that these DC used endogenous TGF-β to convert naive T cells into iTregs in vitro. This study, together with former data generated in our laboratory, demonstrate that in transgenic K5mOVA mice, ssmDC transport and present cell-associated epidermal OVA to CD4+ OVA-specific TCR-transgenic OT-II T cells in the skin-draining lymph nodes. We also identified langerin+ dermal DC cells among the different subsets of ssmDC, as the subset which mediates the conversion of naïve OT-II T cells into CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs. Furthermore, we observed that CD103 was not a suitable marker for ssmDC in skin-draining lymph nodes despite that it has been correlated with tolerogenic DC in the intestine. An additional aim of this work was to investigate the impact of the transcription factor RelB on the partial maturation and migration of ssmDC. RelB is a member of the NF-κB family and has been associated with DC maturation. Initial experiments showed nuclear translocation of RelB in ssmDC and in addition, relB+/- mice as well as mice with a deficiency of the RelB-binding partner p52 had a reduced migration of ssmDC to skin-draining lymph nodes. Nevertheless, the analysis of mice with a DC-specific ablation of RelB (RelBDCko mice) revealed an increased frequency of ssmDC in skin-draining lymph nodes which was not due to an increased number or altered distribution of DC in the skin. On the one hand, these data suggest that the effects on ssmDC seen in the relB+/- mice were mediated by DC-extrinsic mechanisms. On the other hand, the increase of ssmDC in RelBDCko mice indicated that RelB might be rather a negative regulator of ssmDC migration under homeostatic conditions. Moreover, RelB also affected the maturation of ssmDC partially, since ssmDC in the skin-draining lymph nodes of RelBDCko mice expressed more CD40 on their surface, while other maturation markers as MHC II, CD80 and CD86 were not significantly altered. Finally, it was investigated how RelB deficiency in DC affects the induction and homeostasis of Tregs. To this aim we examined RelBDCko mice in which we observed an increased frequency and absolute number of Tregs in all lymphatic organs analyzed (skin-draining lymph nodes, spleen and thymus). Furthermore, Tregs showed an increased proliferation in these organs compared to control mice. In particular, Tregs in RelBDCko mice proliferated more vigorously in the skin-draining lymph nodes compared to the spleen. Thus, RelB seems to influence the tolerogenic DC capacity by regulating the expansion of Tregs generated in the thymus as well as their peripheral maintenance. By using a neutralizing anti-IL-2 antibody, we could also demonstrate that the peripheral proliferation of Tregs in the RelBDCko mice was dependent on IL-2, indicating that production of IL-2 either by conventional T cells or DC themselves is affected through RelB deficiency. In accordance with this observation, preliminary experiments showed an increased IL-2 production in the peripheral lymphoid organs of RelBDCko mice. Taken together, the data of this study strongly suggest that ssmDZ are potent inducers of iTregs in response to epidermal self-antigens in skin-draining lymph nodes. Moreover, the analysis of a novel conditional mouse model with a DC-specific deletion of RelB indicated that the migration and maturation of ssmDC is partially regulated by RelB. Since Tregs play a key role in the maintenance of peripheral tolerance, our finding that a deficiency of RelB in all DC affects the proliferation and therefore the homeostasis of Tregs provides an interesting starting-point for further investigation. KW - Dendritische Zelle KW - Nuklearfaktor Kappa B KW - Immuntoleranz KW - regulatorische T-Zellen KW - dendritic cell KW - NF-kappaB KW - regulatory T cells KW - immunologic tolerance Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72343 ER -