TY - THES A1 - Steinmeyer, Ralf T1 - Untersuchungen und Simulationen zur Koordination der Ionenflüsse bei der Schließzellbewegung in Vicia faba und Arabidopsis thaliana T1 - Studies and Simulations about the Coordination of Ion Fluxes during the Guard Cell Movement in Vicia faba and Arabidopsis thaliana N2 - Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte. N2 - While the function of stomata as well as of the different proteins involved in ion fluxes across the plasma membrane are well understood, a guard cell specific model for the concerted function and coordination is still missing. Results - KAT1, the inward rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana is well characterized in terms of structure and electrophysiological function. A knock-out mutant of this channel should be restrained in stomatal opening. Nevertheless under different conditions, with light or fusicoccin as opening stimulus, no difference could be found between wild type and KAT1::En-1 mutant plants. - Glucose is found to accumulate in guard cells during the day when stomata are opened and it is thus suggested to contribute to the osmotical pressure for opening. The uptake of a fluorescent glucose derivative was found to be light dependent and impaired by addition of CCCP which eliminates the proton gradient across the plasma membrane. - A knock-out mutant of the proton/sugar cotransporter protein AtSTP1 showed a significant reduction of cells showing 2-NBDG fluorescence as compared to the wild type. This shows a prominent contribution of this transporter to the uptake of glucose. - Changes of the free running membrane potential upon light/dark transitions were measured in guard cells of intact Vicia faba plants. A majority of these cells showed repeatable hyperpolarizations in light and depolarizations in darkness. These changes in potential were mainly driven by the (in-)activation of an instantaneous positive current of about 35 mA, most probably the H+-ATPase. - In a biophysical simulation, the dependence of anion channel, inward as well as outward rectifying potassium channels and proton pump on cytosolic and apoplastic ion concentrations, pH and membrane potential were included to build a model of ion fluxes for stomatal movements. Also included were literature values for channel conductance and the kinetics of concentrations during stomatal movements. - From this model, two main predictions were made for the cooperation of transport proteins in stomatal movements: 1. At the end of the opening phase of stomata, the H+-ATPase must be deactivated, since otherwise the cytosolic potassium concentration would rise and the membrane potential would decrease both to values that were never reproduced in measurements. A desensitization of the H+-ATPase was already found after pulses of blue light, but never upon permanent white light. 2. The proton/chloride cotransporter not only needs to be active during stomal opening for chloride uptake, but also during closure. Since in guard cells of open stomata, the concentration of potassium is higher than that of chloride, a 1:1 efflux of both ions would soon end the depolarization needed for further potassium efflux. To overcome this, a chloride cycle is suggested, where the cotransporter is active and keeps the net efflux of chloride small. - Different loading techniques were tested for fluorescent calcium indicator dyes. Incubation at low pH, for the free acid form as well as low temperature for the acetoxymethyl-ester forms of the dyes were shown to be impossible in Vicia faba guard cells. During the work on this thesis, one example for a detergent-aided loading of free acid dyes was published. - For parallel recording of electrophyiological parameters and cytosolic ion concentrations, an injection technique was tested that operates by regulated air pressure on one barrel of a double-barreled pipette. The other barrel was used for measurements of the membrane potential. Experiments with a discontinuous voltage clamp amplifier failed, since the target voltage was not reached probably due to non-compensable, variable pipette capacities. KW - Ackerbohne KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Apoplast KW - Membranpotential KW - guard cell KW - ion channel KW - apoplast KW - membrane potential Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17098 ER - TY - JOUR A1 - Oehler, Beatrice A1 - Brack, Alexander A1 - Blum, Robert A1 - Rittner, Heike L. T1 - Pain Control by Targeting Oxidized Phospholipids: Functions, Mechanisms, Perspectives JF - Frontiers in Endocrinology N2 - Within the lipidome oxidized phospholipids (OxPL) form a class of chemically highly reactive metabolites. OxPL are acutely produced in inflamed tissue and act as endogenous, proalgesic (pain-inducing) metabolites. They excite sensory, nociceptive neurons by activating transient receptor potential ion channels, specifically TRPA1 and TRPV1. Under inflammatory conditions, OxPL-mediated receptor potentials even potentiate the action potential firing rate of nociceptors. Targeting OxPL with D-4F, an apolipoprotein A-I mimetic peptide or antibodies like E06, specifically binding oxidized headgroups of phospholipids, can be used to control acute, inflammatory pain syndromes, at least in rodents. With a focus on proalgesic specificities of OxPL, this article discusses, how targeting defined substances of the epilipidome can contribute to mechanism-based therapies against primary and secondary chronic inflammatory or possibly also neuropathic pain. KW - oxidized phospholipids KW - TRP channel KW - ion channel KW - analgesia KW - pain therapy KW - nociception KW - therapeutic antibody KW - mimetic peptide Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223432 SN - 1664-2392 VL - 11 ER - TY - THES A1 - Koers, Sandra T1 - Die Rolle der S-Typ Anionenkanäle in der Reaktion von Gerstenschließzellen auf Blumeria graminis f. sp. hordei T1 - Role of S-type anion channels in the reaction of barley guard cells towards Blumeria graminis f. sp. hordei N2 - In ihrer Evolution mussten Pflanzen Strategien entwickeln um sich sowohl gegen Pathogene aus der Luft als auch solche im Boden zu verteidigen. Diese Resistenzmechanismen der Pflanzen zu verstehen ist von höchster Wichtigkeit für die moderne Gesellschaft. Die Weltbevölkerung wächst schnell, was zu der Notwendigkeit führt, die landwirtschaftlichen Flächen möglichst optimal zu nutzen. Ohne die Weiterentwicklung der landwirtschaftlichen Methoden wird eine ausreichende Versorgung mit Grundnahrungsmitteln nicht möglich sein. Obwohl nicht viele Daten zu diesem Thema vorliegen, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein hoher Prozentsatz der jährlichen Ernteverluste auf Pflanzenkrankheiten zurückzuführen ist (Orke et al. 1994, Pinstrup-Andersen; 2001). Der Ernteverlust ist nicht ausschließlich auf den Tod der infizierten Pflanze zurückzuführen, sondern vielmehr auf die sogenannten Resistenzkosten Walters und Heil; 2007). Um sich gegen das Pathogen zu schützen müssen Ressourcen genutzt werden, die sonst für die korrekte Entwicklung der Pflanze, sowie der Samen und Früchte verwendet würden. Die pflanzliche Cuticula, welche die Blattoberfläche bedeckt, ist die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Microorganismen, die durch die Luft verbreitet werden. Um diese Barriere zu umgehen nutzen Bakterien und einige Pilze die Stomata als Eingang in den Apoplasten der Blätter. Dies kann durch die Pflanze allerdings verhindert werden, indem diese Poren geschlossen werden. Diese Schließzellantwort wurde zunächst als Teil der Immunantwort auf Bakterien angesehen (Melotto et al. 2006). Nichtsdestotrotz konnte beobachtet werden, dass die Stomata auch während der Infektion des Mehltaupilzes schließen, obwohl dieser nicht durch die Stomata in das Blatt eindringen. Daher haben wir Einzelzellstudien an intakten Gerstenpflanzen vorgenommen um zu klären, wie die Signale erkannt und weitergeleitet werden, die schließlich zum pathogen-induzierten Stomaschluss führen (Koers et al. 2011). Zusammengefasst kann gesagt werden, dass der Stomaschluss ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Immunantwort ist. Innerhalb dieser Antwort der Stomata auf durch Wind übertragene Pathogene, spielt die Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle eine entscheidende Rolle. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Immunantwort die Licht-induzierte Inhibierung dieser Anionenkanäle außer Kraft setzt. S-Typ Anionenkanäle sind aber nicht allein in der Pathogenabwehr von Bedeutung, sondern auch in der Reaktion der Pflanzen auf Trockenstress. Es ist jedoch nicht bekannt, in wie weit sich die beiden Signalwege überschneiden. Zusammen mit den neuen mutierten Gerstenlinien, werden die in dieser Arbeit beschriebenen Techniken zur Messung von Einzelzellen tiefere Einsichten in das Zusammenspiel zwischen Trockenstress und Pathogenabwehr in Pflanzen ermöglichen. Die daraus resultierenden Ergebnisse können zur Optimierung von Getreide für die moderne Landwirtschaft genutzt werden. Dies wird einer der wichtigsten Ansätze sein, um die Menschheit auch in Zukunft mit ausreichend Nahrung versorgen zu können. N2 - During evolution, plants had to evolve potent strategies to defend themselves against airborne pathogens, as well as against those encountered in the soil. Understanding the mechanisms that provide plant immunity is crucial for modern society. The world population is growing at rapid pace, leading to the necessity of using agricultural areas as productive as possible. Without improvement of agricultural practice, a sufficient supply with staple foods will not be possible. It is very likely that an important percentage of crop loss is due to plant diseases, even though precise data on this issue are lacking, (Orke et al. 1994, Pinstrup-Andersen; 2001). Crop loss is not exclusively caused by the death of infected plants, but more often by so called costs of resistance (Walters and Heil; 2007). To gain protection against an attacking pathogen, resources have to be consumed, which otherwise would be used for proper plant, crop and fruit development. Plant cuticles, that cover the leaf surface, are the first line of defence to airborne pathogenic microorganisms. To bypass this barrier, bacteria and some fungi use stomata as an entry site into the apoplastic space of leaves. The entry of pathogens through stomata can be prevented by plants upon closure of these pores. This guard cell response was proposed to contribute to plant innate immunity against bacteria (Melotto et al. 2006). However, stomata were found to close during the infection of powdery mildew fungi, which do not use open stomata to enter the leaf. We therefore pursued single cell studies within intact barley plants to elucidate the signal perception and transduction mechanisms that evoke stomatal closure during a pathogen attack (Koers et al. 2011). All results taken together, stomatal closure is an integral part of plant innate immunity. Within the stomatal response to airborne pathogens, the activation of S-type anion channels is essential. It is shown, that the immunity responses of guard cells bypass light induced inhibition of anion channels. S-type anion channels are not only crucial for responses to pathogens, but they are also involved in the response of guard cells towards drought. However, it is unknown to which extent both signals share mutual components. Together with the, now available, mutant lines of barley, the single cell techniques described in this thesis can provide a further insight into the interplay of drought and pathogen responses in plants. The results are likely to be used for optimizing crops for the future agriculture, which is a pivotal step in providing enough food for mankind in the near future. KW - Elektrophysiologie KW - Erysiphe graminis KW - Spaltöffnung KW - Gerste KW - Abwehrreaktion KW - Ionenkanal KW - electrophysiology KW - stomata KW - powdery mildew KW - immunity response KW - ion channel KW - Pflanzenphysiologie KW - Mehltau Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77335 ER - TY - JOUR A1 - Jones, Jeffrey J. A1 - Huang, Shouguang A1 - Hedrich, Rainer A1 - Geilfus, Christoph‐Martin A1 - Roelfsema, M. Rob G. T1 - The green light gap: a window of opportunity for optogenetic control of stomatal movement JF - New Phytologist N2 - Green plants are equipped with photoreceptors that are capable of sensing radiation in the ultraviolet‐to‐blue and the red‐to‐far‐red parts of the light spectrum. However, plant cells are not particularly sensitive to green light (GL), and light which lies within this part of the spectrum does not efficiently trigger the opening of stomatal pores. Here, we discuss the current knowledge of stomatal responses to light, which are either provoked via photosynthetically active radiation or by specific blue light (BL) signaling pathways. The limited impact of GL on stomatal movements provides a unique option to use this light quality to control optogenetic tools. Recently, several of these tools have been optimized for use in plant biological research, either to control gene expression, or to provoke ion fluxes. Initial studies with the BL‐activated potassium channel BLINK1 showed that this tool can speed up stomatal movements. Moreover, the GL‐sensitive anion channel GtACR1 can induce stomatal closure, even at conditions that provoke stomatal opening in wild‐type plants. Given that crop plants in controlled‐environment agriculture and horticulture are often cultivated with artificial light sources (i.e. a combination of blue and red light from light‐emitting diodes), GL signals can be used as a remote‐control signal that controls stomatal transpiration and water consumption. KW - anion channel KW - channelrhodopsin KW - Chl KW - guard cell KW - ion channel KW - light‐gated KW - membrane potential KW - phototropin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293724 VL - 236 IS - 4 SP - 1237 EP - 1244 ER - TY - THES A1 - Janzen, Dieter T1 - Functional analysis of ion channels and neuronal networks in 2D and 3D \(in\) \(vitro\) cell culture models T1 - Funktionelle Analyse von Ionenkanälen und neuronalen Netzwerken in 2D und 3D \(in\) \(vitro\) Zellkulturmodellen N2 - In the central nervous system, excitatory and inhibitory signal transduction processes are mediated by presynaptic release of neurotransmitters, which bind to postsynaptic receptors. Glycine receptors (GlyRs) and GABAA receptors (GABAARs) are ligand-gated ion channels that enable synaptic inhibition. One part of the present thesis elucidated the role of the GlyRα1 β8 β9 loop in receptor expression, localization, and function by means of amino acid substitutions at residue Q177. This residue is underlying a startle disease phenotype in the spontaneous mouse model shaky and affected homozygous animals are dying 4-6 weeks after birth. The residue is located in the β8 β9 loop and thus part of the signal transduction unit essential for proper ion channel function. Moreover, residue Q177 is involved in a hydrogen network important for ligand binding. We observed no difference in ion channel trafficking to the cellular membrane for GlyRα1Q177 variants. However, electrophysiological measurements demonstrated reduced glycine, taurine, and β alanine potency in comparison to the wildtype protein. Modeling revealed that some GlyRα1Q177 variants disrupt the hydrogen network around residue Q177. The largest alterations were observed for the Q177R variant, which displayed similar effects as the Q177K mutation present in shaky mice. Exchange with structurally related amino acids to the original glutamine preserved the hydrogen bond network. Our results underlined the importance of the GlyR β8 β9 loop for proper ion channel gating. GlyRs as well as GABAARs can be modulated by numerous allosteric substances. Recently, we focused on monoterpenes from plant extracts and showed positive allosteric modulation of GABAARs. Here, we focused on the effect of 11 sesquiterpenes and sesquiterpenoids (SQTs) on GABAARs. SQTs are compounds naturally occurring in plants. We tested SQTs of the volatile fractions of hop and chamomile, including their secondary metabolites generated during digestion. Using the patch-clamp technique on transfected cells and neurons, we were able to observe significant GABAAR modulation by some of the compounds analyzed. Furthermore, a possible binding mechanism of SQTs to the neurosteroid binding site of the GABAAR was revealed by modeling and docking studies. We successfully demonstrated GABAAR modulation by SQTs and their secondary metabolites. The second part of the thesis investigated three-dimensional (3D) in vitro cell culture models which are becoming more and more important in different part of natural sciences. The third dimension allows developing of complex models closer to the natural environment of cells, but also requires materials with mechanical and biological properties comparable to the native tissue of the encapsulated cells. This is especially challenging for 3D in vitro cultures of primary neurons and astrocytes as the brain is one of the softest tissues found in the body. Ultra-soft matrices that mimic the neuronal in vivo environment are difficult to handle. We have overcome these challenges using fiber scaffolds created by melt electrowriting to reinforce ultra-soft matrigel. Hence, the scaffolds enabled proper handling of the whole composites and thus structural and functional characterizations requiring movement of the composites to different experimental setups. Using these scaffold-matrigel composites, we successfully established methods necessary for the characterization of neuronal network formation. Before starting with neurons, a mouse fibroblast cell line was seeded in scaffold-matrigel composites and transfected with the GlyR. 3D cultured cells displayed high viability, could be immunocytochemically stained, and electrophysiologically analyzed. In a follow-up study, primary mouse cortical neurons in fiber-reinforced matrigel were grown for up to 21 days in vitro. Neurons displayed high viability, and quantification of neurite lengths and synapse density revealed a fully formed neuronal network already after 7 days in 3D culture. Calcium imaging and patch clamp experiments demonstrated spontaneous network activity, functional voltage-gated sodium channels as well as action potential firing. By combining ultra-soft hydrogels with fiber scaffolds, we successfully created a cell culture model suitable for future work in the context of cell-cell interactions between primary cells of the brain and tumor cells, which will help to elucidate the molecular pathology of aggressive brain tumors and possibly other disease mechanisms. N2 - Im zentralen Nervensystem wird die exzitatorische und inhibitorische Signaltransduktion durch die präsynaptische Ausschüttung von Neurotransmittern, die an postsynaptische Rezeptoren binden, gesteuert. Glycinrezeptoren (GlyRs) und GABAA-Rezeptoren (GABAARs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle, die die synaptische Inhibition ermöglichen. Ein Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss des GlyRα1 β8 β9-Loops auf Expression, Lokalisation und Funktion des Rezeptors. Dazu wurde ein Aminosäureaustausch an Position Q177 durchgeführt, welche dem Startle-Krankheit-Phänotyp des spontanen Mausmodells shaky zugrunde liegt. Betroffene homozygote Tiere versterben 4-6 Wochen nach Geburt. Die Position befindet sich im β8 β9-Loop und ist damit Teil einer Signaltransduktionseinheit, die essenziell für die korrekte Rezeptorfunktion ist. Zudem ist Position Q177 teil eines Wasserstoffbrückennetzwerks, welches für die Ligandenbindung erforderlich ist. Wir konnten keinen Einfluss der GlyRα1Q177-Varianten auf den Transport des Rezeptors zur Zellmembran feststellen. Allerdings zeigten elektrophysiologische Messungen eine verringerte Wirksamkeit von Glycin, Taurin und β Alanin verglichen mit dem Wildtyp-Protein. Mithilfe von Proteinmodellierung konnte gezeigt werden, dass manche der GlyRα1Q177-Varianten das Wasserstoffbrückennetzwerk im Umfeld von Position Q177 stören. Die größten Effekte wurden bei der Q177R-Variante beobachtet, die sich ähnlich zur Q177K-Mutation der shaky-Maus verhielt. Der Austausch zu einer Aminosäure, die strukturell ähnlich zum ursprünglichen Glutamin ist, störte das Wasserstoffbrückennetzwerk hingegen nicht. Unsere Ergebnisse zeigen, wie wichtig der GlyR β8 β9-Loop für die Aufrechterhaltung der Rezeptorfunktion ist. Sowohl GlyRs als auch GABAARs können durch verschiedenste allosterische Substanzen moduliert werden. Zuletzt zeigten wir positive allosterische Modulation von GABAARs durch Monoteperne aus Pflanzenextrakten. Hier haben wir uns auf den Effekt von 11 Sesquiterpenen und Sesquiterpenoiden (SQTs) auf GABAARs fokussiert. SQTs sind natürlich in Pflanzen vorkommende Stoffe. Wir testeten SQTs aus dem flüchtigen Anteil von Hopfen und Kamille, sowie deren sekundäre Metaboliten, die während der Verdauung entstehen. Mithilfe der Patch-Clamp-Methode konnten wir in transfizierten Zellenlinien und neuronalen Primärzellen signifikante Modulation von GABAARs durch einige der SQTs beobachten. Außerdem wurde mithilfe von Docking-Simulationen eine mögliche Bindung von SQTs in der Neurosteroid-Bindungstasche gezeigt. Zusammengefasst haben wir erfolgreich die Modulation von GABAARs durch SQTs und deren sekundäre Metaboliten demonstriert. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dreidimensionalen (3D) in vitro Zellkulturmodellen, die zunehmend an Bedeutung gewinnen. Die dritte Dimension erlaubt die Entwicklungen von komplexen Modellen, die sich der natürlichen Umgebung von Zellen annähern. Dafür werden Materialien benötigt, deren mechanische und biologische Eigenschaften denen des ursprünglichen Gewebes der eingeschlossenen Zellen ähneln. Dies ist insbesondere eine Herausforderung bei 3D in vitro Kulturen von primären Neuronen und Astrozyten, da das Gehirn eines der weichsten Gewebe des Körpers ist. Ultraweiche Matrizen, welche die neuronale Umgebung nachahmen, sind schwer zu handhaben. Wir haben dieses Problem gelöst, indem wir ultraweiches Matrigel mit Fasergerüsten verstärkten, die mithilfe von Melt Electrowriting gedruckt wurden. Somit können diese Matrigel-Faser-Komposite für strukturelle und funktionelle Experimente benutzt werden, die häufige Bewegung und Transport der Proben voraussetzen. Mit diesen Matrigel-Faser-Kompositen haben wir Methoden etabliert, die für die Charakterisierung von neuronalen Netzwerken erforderlich sind. Anstelle von Neuronen haben wir dafür eine Mausfibroblasten-Zelllinie benutzt und mit dem GlyR transfiziert. Zellen in den Matrigel-Faser-Komposite zeigten eine hohe Viabilität, konnten immunocytochemisch angefärbt werden, und mithilfe von elektrophysiologischen Methoden gemessen werden. Darauf aufbauend haben wir primäre kortikale Mausneurone in faserverstärktem Matrigel für bis zu 21 Tage wachsen lassen. Die Neurone zeigten eine hohe Viabilität und durch Quantifikation von Neuritenlänge und Synapsendichte konnte ein vollständig ausgeformtes Netzwerk nach 7 Tagen in 3D-Kultur demonstriert werden. Mithilfe von Calcium-Imaging und Patch-Clamp-Experimenten wurden spontane Netzwerkaktivität, funktionelle spannungsgesteuerte Natriumkanäle, sowie Aktionspotentiale nachgewiesen. Somit konnten wir durch Kombination von einem ultraweichen Hydrogel mit Fasergerüsten erfolgreich ein Zellkulturmodell entwickeln, das zukünftig für die Erforschung von Zell-Zell-Interaktionen zwischen primären Gehirnzellen und Tumorzellen benutzt werden kann. Damit kann die molekulare Pathologie von aggressiven Hirntumoren und möglicherweise anderen Krankheitsmechanismen weiter aufgeklärt werden. KW - Zellkultur KW - Ionenkanal KW - Aminobuttersäure KW - Glycin KW - Rezeptor KW - 3D cell culture KW - neuronal network KW - ion channel KW - glycine receptor KW - GABA receptor KW - 3D-Zellkultur KW - Nervennetz KW - Glycinrezeptor KW - GABA-Rezeptor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251700 ER -