TY - THES A1 - Gorbunov, Dmitry T1 - Rat organic cation transporter 1 (rOCT1): investigation of conformational changes and ligand binding T1 - Kationentransporter 1 der Ratte (rOCT1): Untersuchung der Konformationsänderungen und Ligandbindung N2 - Polyspecific organic cation transporters (OCTs) of the SLC22 family mediate downhill transport of organic cations and play an essential role in excretion and distribution of endogenous organic cations and for the uptake, elimination and distribution of cationic drugs and toxins. Although physiological and pharmacological significance of OCTs is widely accepted, many questions concerning structure and transport mechanism still remain open. To investigate conformational changes of the rat OCT1 during transport cycle, voltage-clamp fluorometry was performed with a cysteine-deprived mutant in which phenylalanine 483 in transmembrane helix (TMH) 11 close to the extracellular surface was replaced by cysteine and covalently labeled with tetramethylrhodamine-6-maleimide. Potential-dependent fluorescence changes were observed that were sensitive to the presence of substrates choline, tetraethylammonium (TEA), 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP), and of the contransported inhibitor tetrabutylammonium (TBuA). The data suggest that the transporter undergoes conformational changes in voltage- and substrate-dependent manner which are compatible with alternating access mechanism. Using potential-dependent fluorescence changes as readout, one high-affinity binding site per substrate and two highaffinity binding sites for TBuA were identified in addition to the previously described single interaction sites. Coexisting high-affinity cation binding sites in organic cation transporters may collect xenobiotics and drugs; however, translocation of organic cations across the membrane may only be induced when a low-affinity cation binding site is loaded. Whereas high-affinity binding of TBuA has no effect on cation uptake by wildtype rat OCT1, replacement by cysteine or serine of amino acids W147, F483, and F486 located in a modeled contact region between TMH2 and TMH11 outside the binding pocket leads to inhibition of MPP or TEA uptake. Thus, mutations of amino acids in transport relevant key positions, which can be distinct from the cation binding region, may transform noninhibitory highaffinity binding sites of high-affinity inhibition sites and thereby cause adverse drug reactions in patients. N2 - Polyspezifische Transporter für organische Kationen (OCTs) der SLC22 Familie transportieren organische Kationen entlang des elektrochemischen Gradienten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Ausscheidung und Gewebeverteilung von endogenen organischen Kationen und bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung von kationischen Medikamenten und Toxinen. Obwohl die physiologische und pharmakologische Bedeutung von Transportern für organische Kationen allgemein anerkannt ist, bleiben viele Fragen bezüglich der Struktur und des Transportmechanismus dieser Transporter noch offen. Um Konformationsänderungen von rOCT1 während des Transportzyklus zu untersuchen, wurde die „Voltage-clamp-Fluorometrie“ angewandt, bei der in einer cysteinarmen rOCT1 Mutante Phenylalanin 483 in der Transmembranhelix (TMH) 11 nahe an der extrazellulären Seite der Membran durch Cystein ersetzt und mit Tetramethylrhodamin-6-maleimid kovalent markiert wurde. Dabei wurden Spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen beobachtet, die durch die Anwesenheit der Substrate - Cholin, Tetraethylammonium (TEA), 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP) - und des nichttransportierten Hemmstoffes Tetrabutylammonium (TBuA) moduliert wurden. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass der Transporter Konformationsänderungen durchläuft, die spannungs- und substratabhängig sind, was mit dem „alternating access“ Mechanismus vereinbar ist. Die Analyse der spannungsabhängigen Fluoreszenzänderungen zeigte die Existenz je einer hochaffinen Bindungsstelle für Substrate und zweier hochaffinen Bindungsstellen für TBuA zusätzlich zu den früher identifizierten Bindungsstellen. Multiple hochaffine Kationenbindungsstellen in OCTs können Xenobiotika und Arzneimittel anreichern, aber die Translokation von organischen Kationen über die Membran kann erst dann erfolgen, wenn die niederaffine Bindungsstelle besetzt ist. Während die hochaffine Bindung von TBuA an den Wildtyp rOCT1 keine Wirkung auf die Aufnahme von Kationen hat, führt der Austausch der Aminosäuren W147, F483 und F486, die anhangs des Modells in der Kontaktregion zwischen TMH 2 und TMH 11 außerhalb der Bindungstasche lokalisiert sind, durch Cystein oder Serin zur Hemmung der MPP- und TEA-Aufnahme. Die Mutation der Aminosäuren in den für den Transport entscheidenden Positionen, die sich nicht unbedingt in der Kationenbindungstasche befinden, kann also eine nichtinhibitorische hochaffine Bindungsstelle in eine inhibitorische hochaffine Bindungsstelle umwandeln und dadurch unerwartete Effekte bei der Therapie mit verschiedenen Arzneimitteln hervorrufen. KW - Kationentransporter 1 der Ratte KW - rOCT1 KW - Mutationsanalyse KW - Konformationsänderungen KW - Organic cation transporters KW - rOCT1 KW - mutational analysis KW - protein conformational changes Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32645 ER - TY - THES A1 - Arndt, Petra T1 - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere T1 - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney N2 - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden. N2 - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake. KW - Ratte KW - Niere KW - Kation KW - Stofftransport KW - Molekularbiologie KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximaler Tubulus KW - Niere KW - Sekretion KW - Xenopus laevis KW - Oozyte KW - Transport KW - Inhibition KW - Homologieklonierung KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximal tubule KW - kidney KW - secretion KW - Xenopus laevis KW - oocyte KW - transport KW - inhibition KW - homology cloning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793 ER - TY - THES A1 - Aichner, Christian T1 - Die Aminosäuren W355 und A359 des rOCT1 zeigen substratabhängige Mutationseffekte und ändern nach Mutation die Affinität des Transporters zu TBuA T1 - The amino acids W355 and A359 of rOCT1 show substrate-dependent mutation effects and change the affinity of the transporter to TBuA N2 - Die Aminosäuren W355 und A359 des rOCT1 zeigen substratabhängige Mutationseffekte und ändern nach Mutation die Affinität des Transporters zu TBuA N2 - The amino acids W355 and A359 of rOCT1 show substrate-dependent mutation effects and change the affinity of the transporter to TBuA KW - rOCT1 KW - W355 KW - W359 KW - OCT Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114481 ER -