TY - THES A1 - Zinnitsch, Sabrina T1 - DNA-Strangbruchinduktion, Mikrokernbildung, Zellzyklusalteration und Apoptose durch Zahnwerkstoffe in humanen Lymphozyten T1 - DNA strand breake induction, micronuclei formation, cell cycle alteration and apoptosis through dental materials in human lymphocytes N2 - Die Zahnwerkstoffe HEMA (Hydroxyethylmethacrylat) und TEGDMA (Triethylenglycol-dimethacrylat) gehören zu den so genannten Restmonomeren. Sie liegen nach der Polymerisation noch ungebunden vor und werden anschließend freigesetzt. Sie gelangen in den Organismus über die Pulpa, die Gingiva oder über den Speichel und können biologisch wirksam werden. Bisherige Studien zeigen dosisabhängige mutagene Effekte in tierischen und menschlichen Zellen. HEMA und TEGDMA führen zu DNA-Strangbrüchen, Mikrokernbildung, Apoptosen und nehmen Einfluss auf den Zellzyklus (G1- und G2-Verzögerung). Ebenso wurden ein allergenes Potential und eine toxische Wirkung auf die Niere beschrieben. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von HEMA und TEGDMA in humanen Lymphozyten in Konzentrationsbereichen überprüft, wie sie auch im Körper auftreten können. Hierfür wurden die Lymphozyten 24 Stunden mit 10 µM, 100 µM und 1 mM HEMA und mit 1 µM, 10 µM und 100 µM TEGDMA behandelt. Mit dem Comet Assay werden DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie die Reparatur zuvor induzierter DNA-Schäden erfasst. Durch die Modifikation des Comet Assay mit dem Fpg-Protein werden zusätzlich oxidativ geschädigte Basen mit hoher Sensitivität nachgewiesen. Der Mikrokerntest weist manifeste DNA-Schäden auf DNA-Ebene in Form von Mikrokernen nach. Daneben lassen sich auch andere zelluläre Reaktionen wie Mitosen und Apoptosen sowie die Proliferationsrate der Zellen bestimmen. Der Chromosomen-aberrationstest dient zum Nachweis von Veränderungen in der Struktur und/oder in der Anzahl von Chromosomen eines Genoms. Mit dem Schwesterchromatidaustauschtest werden ebenfalls Chromosomenmutationen nachgewiesen. Durchflusszytometrische Methoden werden zum Nachweis von Apoptosen und zur Zellzyklusanalyse eingesetzt. Im herkömmlichen Comet Assay zeigen HEMA und TEGDMA keine signifikante Wirkung auf die DNA (OTM < 2). Es kann aber gezeigt werden, dass die Behandlung mit Fpg zu einer Verdoppelung des OTM führt. Bei 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA wird dadurch das OTM auf > 2 angehoben. HEMA und TEGDMA wirken sich nicht auf die Mikrokernbildung aus, jedoch wird durch den Mikrokerntest ab 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA eine Einflussnahme auf die Proliferation gezeigt. Die Rate früher (< 10%) und später Apoptosen Apoptosen (< 4 %) bleibt im Durchschnitt weitgehend konstant. Eine Ausnahme sind 1 mM HEMA, die die frühen Apoptosen auf > 10 % anheben. Eine Einflussnahme auf den Zellzyklus, in Form einer Verzögerung, üben 1 mM HEMA in der S-Phase und 100 µM TEGDMA in der G1-Phase aus. In den Chromosomentests werden einerseits ein dosisabhängiger Anstieg der Aberrationen und andererseits vermehrte Chromatidaustausche beobachtet. In dieser Arbeit wird die Verbindung von HEMA und TEGDMA zu oxidativen Stress im Comet Assay mit Fpg gezeigt. Da die tatsächlich in vivo erreichbaren Konzentrationen unter 100 µM liegen, ist zu schließen, dass HEMA und TEGDMA in diesem niedrigen Konzentrationsbereich keine nachteiligen Effekte ausüben, denn nur die hohen Konzentrationen (1 mM HEMA, 100 µM TEGDMA) sind in der Lage eine genotoxische Wirkung zu entfalten. Jedoch kann das Auslösen von Mutationen mit dem Chromosomenaberrationstest und Schwesterchromatidaustauschtest bestätigt werden. Um das Schädigungsprofil dieser häufig eingesetzten Zahnwerkstoffe detaillierter beschreiben zu können, müssen Untersuchungen auf Chromatidebene intensiviert werden. N2 - The dental materials HEMA (2-hydroxyethylmethacrylate) and TEGDMA (triethylengylcol-dimethacrylate) belong to the so-called rest monomers. After the polymerisation they are still unbound and can be released afterwards. They reach the organism through the pulp, the gingiva or through the saliva and can become biological effective. Present studies indicate dose-dependent mutagene effects in animal and human cells. HEMA and TEGDMA induce DNA strand breaks, micronuclei formation, apoptosis and have influence on the cell cycle (G1 and G2 delay). Also an allergic potential and a toxic effect on kidneys were described. In this study genotoxic effects were checked by HEMA and TEGDMA in human lymphocytes in concentration areas as they can also appear in the body. The lymphocytes were treated 24 hours with 10 µM, 100 µM and 1 mM HEMA and with 1 µM, 10 µM and 100 µM TEGDMA. With the comet assay DNA single and double strand breaks as well as the repair before induced DNA damage are grasped. By the modification of the comet assay with the Fpg protein oxidative injured bases are proved in addition with high sensitivity. The micronucleus test proves manifest DNA damages at DNA level in the form of micronuclei. Beside other cellular reactions like mitosis and apoptosis as well as the proliferation of the cell can also be determined. The chromosomal aberration test serves for the proof of changes in the structure and/or in the number of chromosomes of a genome. With the sister chromatid exchange test chromosomal mutations are also proved. Flow cytometric methods are used to the proof by apoptosis and to the cell cycle analysis. In the conventional comet assay HEMA and TEGDMA indicate no significant effect at the DNA (OTM < 2). However, it can be shown that the treatment with Fpg leads to a duplication of the OTM. At 1 mM HEMA and 100 µM TEGDMA the OTM is thereby raised on >2. HEMA and TEGDMA do not affect the induction of micronuclei, however the micronucleus test indicate a intervention on the proliferation from 1 mM HEMA and 100 µM TEGDMA. The rate earlier (< 10 %) and late apoptosis (< 4 %) remains widely steady on average. An exception is 1 mM HEMA which raise the early apoptosis on > 10 %. 1mM HEMA have an influence on the cell cycle, in form of a delay, in the S phase and 100 µM TEGDMA in the G1 phase. In the chromosomal tests are observed dose-dependent increase of the aberrations on the one hand and increased chromatid exchanges on the other hand. In this study the connection is shown by HEMA and TEGDMA to oxidative stress in the comet assay with Fpg. Because the really in vivo available concentration lie under 100 µM, is to be closed that HEMA and TEGDMA exert no disadvantageous effects in this low concentration area, because only the high concentrations (1 mM HEMA and 100 µM TEGDMA) are able to unfold a genotoxic effect. However, the release of mutations can be confirmed by the chromosomal aberration test and the sister chromatid exchange test. To be able to describe the damage profile of these often used dental materials more detailed investigations on chromatid level must be intensified. KW - Hydroxyethylmethacrylate KW - Comet Assay KW - Apoptosis KW - Mutagenität KW - Cytotoxizität KW - Komposit KW - Chromosomenaberration KW - Zellzyklus KW - Triethylenglycoldimethacrylat KW - Mikrokernbildung KW - Zellzyklusalteration KW - Schwesterchromatidaustausch KW - triethylenglycoldimethacrylate KW - micronuclei formation KW - cell cycle alteration KW - sister chromatid exchange Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53835 ER - TY - THES A1 - Zeitz, Jonas T1 - Analyse der Funktion und Lokalisation des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 T1 - Analysis of the Function and Localization of the Anti-Apoptotic Bcl-2 Family Member A1 N2 - In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt. N2 - In multicellular organisms, apoptosis (one kind of programmed cell death) is a highly regulated natural process that can remove unwanted, redundant, or damaged cells in an orderly non-inflammatory way. In a typical human being, billions of cells undergo apoptosis every day. That way the organism can control the cell number and the size of a tissue. A dysregulation of apoptosis can have extensive consequences. While insufficient apoptosis can manifest as autoimmunity or cancer, accelerated cell death can lead to immunodeficiency or acute and chronic degenerative diseases. Therefore, analysis of apoptosis is of great importance. Mitochondria play a key role in the regulation of cell death. In the progress of apoptosis, mediators of apoptosis can be released from these organelles. These mediators then participate in the activation of caspases, enzymes that degrade proteins and as a consequence regulate the degradation of DNA. Proteins of the Bcl-2 family consisting of pro- and anti-apoptotic members, control the integrity of the mitochondria mainly by protein-protein and protein-membrane interactions. Many anti-apoptotic members of the Bcl-2 family are able to bind to the outer mitochondrial membrane by a C-terminal transmembrane domain. A1, an anti-apoptotic member of this protein family, lacks this typical transmembrane domain. Function and localization of this protein are discussed very controversially. Therefore, the aim of this thesis was to analyze the localization and function of A1. The intracellular distribution of various versions of genetically modified A1 proteins was analyzed by confocal microscopy. Eventually, the contribution of the proteasomal degradation pathway in regulating the amount of A1 inside cells was investigated by applying relevant inhibitors. By fusing the C-terminal end of A1 to the enhanced green fluorescent protein, we analyzed the function and localization features of the A1 C-terminus by confocal microscopy and flow-cytometry. We could show that the C-terminal end of A1 made the chimeric protein very unstable. Treating the cells with a proteasomal inhibitor lead to a stabilization of the fusion protein. Furthermore the chimeric protein showed a diffuse distribution in 293T cells. These results indicate that the C-terminus of A1 is not sufficient to mediate localization to special intracellular organelles, but is responsible for the instability and proteasomal degradation of the protein. By analyzing the localization of the full length protein A1 in 293T cells by confocal microscopy we could demonstrate that A1 is mainly found in the cytosol with accumulation at the mitochondria. As the C-terminus of A1 by itself was not sufficient for specific intracellular targeting of the protein, other N-terminal regions of A1 seem to contribute in targeting the protein to these organelles. Taken together, we could show that the C-terminus of A1 plays an important role for the stability of this anti-apoptotic Bcl-2 family member. KW - Apoptosis KW - Immunsystem KW - A1 KW - Bcl-2 KW - Apoptosis KW - A1 KW - Bcl-2 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37071 ER - TY - THES A1 - Wüst, Simone T1 - Analyse des Wirkmechanismus von Kortikosteroiden bei der Therapie der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell für Multiple Sklerose T1 - Analysis of the mechanism of action of corticosteroids in the therapy of experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for multiple sclerosis N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Hochdosis-GC-Pulstherapie im Zusammenhang mit akuten Schüben von MS-Patienten anhand des Tiermodells der MS, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), untersucht. Die EAE wurde in C57Bl/6 Mäusen und diversen GR-defizienten Mäusen durch Immunisierung mit Myelinoligodendrozytenglykoprotein (MOG35-55) induziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Dexamethason (Dex) den Krankheitsverlauf dosisabhängig verbessert. Die Untersuchung heterozygoter GR Knock-out Mäuse und hämatopoetischer Stammzellchimären verdeutlichte, dass der zytosolische GR (cGR) für die Vermittlung therapeutischer GC-Effekte von sehr großer Bedeutung ist. Der Einsatz zelltyp-spezifischer GR-defizienter Mäuse zeigte auf zellulärer Ebene, dass für die Vermittlung von GC-Wirkungen die Expression des GR vor allem in T-Zellen unabdingbar ist, wohingegen die GR-Expression in myeloiden Zellen in diesem Kontext keine Bedeutung hat. Durch die Analyse des molekularen Mechanismus konnte festgestellt werden, dass diese Effekte durch Apoptoseinduktion und Herunterregulieren von Adhäsionsmolekülen in peripheren, aber nicht ZNS-residenten T-Zellen erzielt wurden. Überdies wurde ersichtlich, dass Dex die T-Zellmigration in das ZNS verhinderte. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass Dex durch Apoptoseinduktion und Immunmodulation hauptsächlich auf periphere T-Zellen wirkt und somit den ständigen Influx neuer Immunzellen in das ZNS verhindert. Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die therapeutische Gabe hochdosierten Methylprednisolons (MP) in diesem EAE-Modell ebenfalls zu einer dosisabhängigen Verbesserung der EAE führte. Diese beruhte auf einer reduzierten Lymphozyteninfiltration in das ZNS, war allerdings im Vergleich zur Dex-Therapie aufgrund geringerer Wirkpotenz weniger stark ausgeprägt. Im Gegensatz dazu führte die präventive MP-Applikation zu einem verstärkten EAE-Verlauf, der nach der Beeinflussung peripherer, hämatopoetischer Immunzellen auf eine verstärkte Proliferation autoreaktiver T-Zellen zurückzuführen ist. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde als möglicher Ersatz für die Hochdosis-GC-Pulstherapie eine nicht-steroidale, antiinflammatorische Substanz im chronischen EAE-Modell der C57Bl/6 Maus etabliert. Erste tierexperimentelle Untersuchungen mit Compound A (CpdA) offenbarten eine lediglich geringe therapeutische Breite dieser Substanz, wobei innerhalb pharmakologischer Dosierungen dennoch therapeutische Wirkungen vermittelt werden konnten. Anhand von in vitro Experimenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass CpdA GR-unabhängig Apoptose induzierte, wobei Immunzellen und neuronale Zellen gegenüber CpdA besonders empfindlich reagierten. Der Einsatz T-Zell-spezifischer GR-defizienter Mäuse konnte zeigen, dass CpdA für die Vermittlung therapeutischer Wirkungen den cGR benötigt. Ferner wurde offensichtlich, dass CpdA in Abwesenheit des cGR in T-Zellen eine signifikante Verschlechterung der EAE verursachte. Durch die Anwendung physikochemischer Analysenmethoden, wie der Massenspektrometrie und 1H-NMR-Spektroskopie, konnte festgestellt werden, dass CpdA in vitro in gepufferten Medien in eine zyklische, chemisch sehr reaktive Verbindung (Aziridin) metabolisiert wird. Diese kann sehr wahrscheinlich für die Apoptose-Induktion in Zellen und die in Mäusen beobachteten neurotoxischen Ausfallerscheinungen verantwortlich gemacht werden. Durch chemische Analysen konnte in vitro in wässriger CpdA-Lösung ein weiterer Metabolit, das sympathomimetisch wirksame Synephrin, identifiziert werden. Um die Wirksamkeit adrenerger Substanzen in vivo zu testen, wurde das ß1/2-Sympathomimetikum Isoproterenol appliziert. Dieses verbesserte die EAE-Symptomatik, was sehr wahrscheinlich auf eine reduzierte Antigenpräsentation und einer damit verbundenen verminderten T-Zellinfiltration in das ZNS zurückzuführen ist. N2 - High-dose glucocorticoids (GC) are used to treat acute relapses of multiple sclerosis (MS) patients. In this work the underlying mechanisms of this therapy have been investigated using the animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). EAE was induced in C57Bl/6 mice and several strains of glucocorticoid receptor (GR) deficient mice by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55). It was shown that the application of dexamethasone (Dex) leads to a dose-dependent amelioration of the disease course. Analysis of heterozygous GR-knock out mice and hematopoietic stem cell chimeras revealed, that the cytosolic GR (cGR) is a prerequisite for mediating therapeutic GC effects. Furthermore, the use of cell type-specific GR-deficient mice showed at the cellular level that GR-expression is particularly needed in T cells, while it is dispensible in myeloid cells in this context. Analysis of molecular mechanisms determined that these effects are mainly achieved by apoptosis induction and down regulation of adhesion molecules in peripheral T cells, but not in CNS-residing T cells. In addition, it could be observed that Dex inhibited the T cell migration into the CNS. These findings confirm the hypothesis that Dex mainly acts on peripheral T cells by apoptosis induction and immunomodulation and thus inhibits the influx of new immune cells into the CNS. Furthermore, this work shows that therapeutic application of methylprednisolone (MP) in this EAE-model leads to a dose-dependent amelioration of the disease course as well. This improvement is based on a reduced lymphocyte infiltration into the CNS, but is less pronounced than that after Dex treatment due to reduced potency. In contrast to this, preventive MP-application induces an increased disease course. This aggravation is ascribed to interference with peripheral hematopoietic immune cells and an increased proliferation of autoreactive T cells. In the search of alternatives to high-dose GC therapy a novel antiinflammatory compound was established in the chronic EAE-model of the C57Bl/6 mouse. First in vivo experiments revealed that this non-steroidal substance, compound A (CpdA), has only little therapeutic index, but is able to mediate therapeutic effects within pharmacological dosages. On the basis of in vitro analysis CpdA induces apoptosis in a GR-independent manner, whereas immune cells and neuronal cells are most sensitive. Using T cell-specific GR-deficient mice it could be observed that CpdA requires the cGR for mediating therapeutic effects. Furthermore, the application of CpdA led to an aggravation of the EAE course in absence of the cGR in T cells. Physicochemical analysis such as mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy revealed that CpdA metabolizes in vitro in buffered media into a cyclic, highly reactive compound, aziridine. Presumably, this metabolite may be responsible for apoptosis induction in diverse cells and neurotoxic deficits observed in mice. Using the same methods, an adrenergic substance, synephrine, could be identified in vitro after resolving CpdA in water and PBS. In order to test the efficacy of adrenergic substances in EAE in vivo, the ß1/2-adrenergic drug isoproterenol, was applied. Isoproterenol led to an amelioration of the disease course which may be ascribed to decreased antigen presentation and reduced T cell infiltration into CNS. KW - Multiple Sklerose KW - Tiermodell KW - Glucocorticosteroide KW - Apoptosis KW - Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis KW - Adhäsionsmoleküle KW - Glukokortikoid-Rezeptor Modulator KW - Experimental autoimmune encephalomyelitis KW - adhesion molecules KW - glucocorticoid-receptor modulator Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32961 ER - TY - THES A1 - Wiese, Katrin Evelyn T1 - Sensing supraphysiological levels of MYC : mechanisms of MIZ1-dependent MYC-induced Apoptosis in Mammary Epithelial Cells T1 - Mechanismen der MIZ1-abhängigen MYC-induzierten Apoptose in Brustepithelzellen N2 - Deregulated MYC expression contributes to cellular transformation as well as progression and maintenance of human tumours. Interestingly, in the absence of additional genetic alterations, potentially oncogenic levels of MYC sensitise cells to a variety of apoptotic stimuli. Hence, MYC-induced apoptosis has long been recognised as a major barrier against cancer development. However, it is largely unknown how cells discriminate physiological from supraphysiological levels of MYC in order to execute an appropriate biological response. The experiments described in this thesis demonstrate that induction of apoptosis in mammary epithelial cells depends on the repressive actions of MYC/MIZ1 complexes. Analysis of gene expression profiles and ChIP-sequencing experiments reveals that high levels of MYC are required to invade low-affinity binding sites and repress target genes of the serum response factor SRF. These genes are involved in cytoskeletal dynamics as well as cell adhesion processes and are likely needed to transmit survival signals to the AKT kinase. Restoration of SRF activity rescues MIZ1- dependent gene repression and increases AKT phosphorylation and downstream function. Collectively, these results indicate that association with MIZ1 leads to an expansion of MYC’s transcriptional response that allows sensing of oncogenic levels, which points towards a tumour-suppressive role for the MYC/MIZ1 complex in epithelial cells. N2 - Eine Deregulation der MYC Expression trägt entscheidend zur malignen Transformation und Progression humaner Tumoren bei. In Abwesenheit von zusätzlichen genetischen Läsionen machen potentiell onkogene MYC Proteinmengen Zellen jedoch anfällig für eine Reihe Apoptoseauslösender Reize. Daher kann MYC-induzierte Apoptose als bedeutende tumorsuppressive Maßnahme und wichtige Barriere gegen die Entstehung von Krebs betrachtet werden. Mechanistisch unklar ist allerdings wie genau Zellen physiologische von supraphysiologischen MYC-Mengen unterscheiden um adäquat darauf reagieren zu können. Die Experimente in dieser Dissertation zeigen, dass die repressive Eigenschaft von MYC/MIZ1 Komplexen für die Induktion von Apoptose in Brustepithelzellen essentiell ist. Die Analyse von Genexpressions- und ChIP-Sequenzier-Experimenten verdeutlicht, dass hohe Level an MYC benötigt werden um niedrig-affine Bindestellen im Genom zu besetzen und Zielgene des SRF (serum response factor ) Transkriptionsfaktors zu reprimieren. Diese Gene haben eine wichtige Funktion in Prozessen wie Zytoskelettdynamik und Zelladhäsion und sind vermutlich daran beteiligt notwendige Überlebenssignale an die Kinase AKT weiterzuleiten. Eine Wiederherstellung der SRF Aktivität revertiert die MIZ1-abhängige Repression der Zielgene und führt zu einer vermehrten AKT Phosphorylierung und Funktion. Insgesamt deuten diese Resultate auf eine tumorsuppressive Rolle des MYC/MIZ1 Komplexes in epithelialen Zellen hin, da eine Veränderung der genregulatorischen Aktivität als Folge der Assoziation mit MIZ1 dazu beiträgen könnte onkogene Mengen an MYC zu erkennen. KW - Myc KW - Apoptosis KW - Myc KW - Miz1 KW - Apoptose KW - Repression KW - ChIP-sequencing KW - Repression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132532 ER - TY - JOUR A1 - Wedel, Steffen A1 - Hudak, Lukasz A1 - Seibel, Jens-Michael A1 - Makarevic, Jasmina A1 - Juengel, Eva A1 - Tsaur, Igor A1 - Waaga-Gasser, Ana A1 - Haferkamp, Axel A1 - Blaheta, Roman A. T1 - Molecular targeting of prostate cancer cells by a triple drug combination down-regulates integrin driven adhesion processes, delays cell cycle progression and interferes with the cdk-cyclin axis JF - BMC Cancer N2 - Background: Single drug use has not achieved satisfactory results in the treatment of prostate cancer, despite application of increasingly widespread targeted therapeutics. In the present study, the combined impact of the mammalian target of rapamycin (mTOR)-inhibitor RAD001, the dual EGFr and VGEFr tyrosine kinase inhibitor AEE788 and the histone deacetylase (HDAC)-inhibitor valproic acid (VPA) on prostate cancer growth and adhesion in vitro was investigated. Methods: PC-3, DU-145 and LNCaP cells were treated with RAD001, AEE788 or VPA or with a RAD-AEE-VPA combination. Tumor cell growth, cell cycle progression and cell cycle regulating proteins were then investigated by MTT-assay, flow cytometry and western blotting, respectively. Furthermore, tumor cell adhesion to vascular endothelium or to immobilized extracellular matrix proteins as well as migratory properties of the cells was evaluated, and integrin alpha and beta subtypes were analyzed. Finally, effects of drug treatment on cell signaling pathways were determined. Results: All drugs, separately applied, reduced tumor cell adhesion, migration and growth. A much stronger anticancer effect was evoked by the triple drug combination. Particularly, cdk1, 2 and 4 and cyclin B were reduced, whereas p27 was elevated. In addition, simultaneous application of RAD001, AEE788 and VPA altered the membranous, cytoplasmic and gene expression pattern of various integrin alpha and beta subtypes, reduced integrin-linked kinase (ILK) and deactivated focal adhesion kinase (FAK). Signaling analysis revealed that EGFr and the downstream target Akt, as well as p70S6k was distinctly modified in the presence of the drug combination. Conclusions: Simultaneous targeting of several key proteins in prostate cancer cells provides an advantage over targeting a single pathway. Since strong anti-tumor properties became evident with respect to cell growth and adhesion dynamics, the triple drug combination might provide progress in the treatment of advanced prostate cancer. KW - Growth-factor receptor KW - Mammalian target KW - Radical prostatectomy KW - Up-regulation KW - C-MYC KW - Pathway KW - Expression KW - Activation KW - Inhibition KW - Apoptosis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141075 VL - 11 IS - 375 ER - TY - THES A1 - Warnke, Clemens T1 - Mechanismen TNF-induzierter Genexpression T1 - Mechanisms of TNF-induced gene expression N2 - TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte. N2 - In this dissertation, membrane bound TNF and its receptor selective muteins are shown to induce gene expression and to selectively bind to TNFR1 and TNFR2. Furthermore, in GST-Fishing experiments membrane bound TNF induced signal transduction leading to NFkB and apoptosis induction was further investigated. Two existing different models of TNFalpha induced apoptosis in the literature were compared, the model of two sequential signaling complexes and the model of compartmentalisation. In this dissertation, it was shown that the model of two sequential signaling complexes is more likely to be able to explain membrane bound TNF induced apoptosis. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - Entzündung KW - Zytokine KW - cytokine KW - NFkB KW - Signaltransduktion KW - cytokine KW - tnf KW - apoptosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23989 ER - TY - THES A1 - Wannhoff, Andreas T1 - Identifizierung von Biomarkern der Belastung von Mundschleimhautzellen mit Schwermetallen und polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen T1 - Identification of biomarkers for exposure of human oral mucosa to heavy metals or polycyclic aromatic hydrocarbons N2 - Menschliche Mundschleimheut wurde ex-vivo gegenüber Schwermetallen (Blei) oder polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (Benzopyren) für Zeiten von 5Min. bis 360Min exponiert. Immunhistochemisch wurdne im Anschluss Marker für Apoptose, oxitaven und nitrogenen Stress untersucht. Hierbei zeigten sich jeweils charakteristische Veränderungen für aktive Caspase-3, 3-Nitrotyrosine und 8-epi-PGF2alpha. Proben von Rauchern wurden mit Nichtraucherproben verglichen und zeigten verminderte Werte für oxidativen und nitrogenen Stress. N2 - In this study samples of human oral mucosa were ex-vivo exposed to lead or benzopyrene to further investigate the influence of heavy metals and polycyclic aromatic hydrocarbons on apoptosis and generation of oxidative and nitrosative stress in human oral mucosa. Immunhistochemical staining was done for active-caspase-3, 8-epi-PGF2a and 3-nitrotyrosine as biomarkers for apoptosis as well as oxidative and nitrosative stress. Samples obtained from smokers where furthermore compared to non-smokers' samples. Activation of apoptosis and generation of oxidative and nitrosative stress already occured in oral mucosa cells after short-term, one-time exposure to lead or benzopyrene and is not limited to chronic exposure. In smokers' samples there seems to be a reduced generation of reactive oxygen or nitrogen species after exposure to benzopyrene. KW - Mundschleimhaut KW - Benzopyren KW - Polycyclische Aromaten KW - Blei KW - Schwermetall KW - Apoptosis KW - Oxidativer Stress KW - human oral mucosa KW - lead KW - benzopyrene KW - apoptosis KW - oxidative stress Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73302 ER - TY - THES A1 - Wang, Dapeng T1 - The mechanism of glucocorticoid induced murine thymocyte and peripheral T cell apoptosis T1 - Der Mechanismus der Apoptose von Glukocorticoid-induzierten murinen Thymozyten und peripherischen T-Zellen N2 - Glucocordicoide sind kleine lipophile Verbindungen, die viele biologische Effekte verursachen, wenn sie an den intrazellulären Glukokortikoidrezeptor (GR) binden. Dieser wandert wiederum in den Nucleus, um dort direkt oder indirekt die Transkription der Gene zu regulieren. Glukokortikoide sind der Grundstein in der Behandlung für eine Anzahl von hämatologischen bösartigen Erkrankungen, wie Leukämie, Lymphome und Myelome. In der Literatur wird beschrieben, dass Glukokortikoide über die Vermittlung von Apoptose wirken.die Wirkung. Trotz der enormen Fortschritte im Verständnis des regulierten Zelltodes, ist der genaue Mechanismus, den Glukokortikoide bei der Apoptose vermitteln, unbekannt. Die Daten, die bis jetzt erzielt wurden, deuten stark darauf hin, dass Gentransaktivierung durch den GR für den Beginn der durch Glukokortikoide verursachten Thymozytenapoptose verantwortlich ist. Außerdem wurde gezeigt, dass das multikatalytische Proteasom, einige Mitglieder der BCL2-Familie, Änderungen im Kalziumfluss sowie Caspasen eine wichtige Rolle in der Durchführungsphase des durch Glukokortikoide vermittelten Zelltodes spielen Jedoch ist die genaue Reihenfolge dieses Prozesses bisher nicht bekannt. Ein Hauptschwierigkeit der gegenwärtigen Diskussion entsteht aus der Tatsache, dass unterschiedliche Zellarten, wie Thymozyten, reife T-Zellen und Lymphomzellen verglichen werden, ohne ihre unterschiedlichen Eigenschaften und Genexpressionsprofile zu beachten. Obwohl angenommen wird, dass Glukokortikoide Apoptose über einen konservierten Mechanismus, wird dies nicht durch irgendwelche Daten unterstützt. In anderen Worten, es ist möglich, dass Apoptose in Thymozyten, reifen T-Zellen und Lymphomzellen über unterschiedliche Signalwege vermittelt wid. Wir fragten uns daher, ob ein einzelner durch Glukokoritkoide eingeleiteter Signaltransduktionsweg dafür verantwortlich ist, dass Apoptose in allen T-Lamphozytenarten eingeleitet wird, oder ob noch andere Signalwege existieren. Daher verglichen wir die Rolle des Proteasomes, verschiedener Caspasen, des lysosomalen Kompartements und anderer Faktoren in der durch Glukokortikoide induzierten Apoptose in Mausthymozyten und pepripheren T-Zellen sowie T-ALL Lymphomzellen. Unsere Entdeckungen zeigen, dass die Anfangsphase der durch Glukokortikoide induzierten Apoptose unabhängig von der Differenzierungsstadien der Zelle ist. Apoptose wird sowohl in Thymozyten als auch in reifen T-Zellen durch den GR vermittelt und ist von der Gentranskription abhängig. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die Durchführungsphase erheblich in ihren Anforderungen für eine Anzahl von Signaltransduktionskomponenten zwischen Thymozyten und peripheren T-Zellen. Während in Thymozyten das Proteasom, die Caspasen 3, 8 und 9 sowie Cathepsin B eine wichtige Rolle in durch Glukokortikoide induzierten Zelltod spielen, sind diese Faktoren für die Induktion des Zell-Todes in peripheren T- Zellen entbehrlich. Im Gegensatz dazu scheinen Änderungen in der Expression und intrazellulären Lokalisation von Mitgliedern der Bcl-2 Familie nicht zum durch Glukokortikoide induzierten Zellltod beitzutragen, egal um welchen Zelltyp es sich handelt. Wir haben beobachtet, dass eine Behandlung von Thymozyten mit Glukokortikoiden zu einer Aktivierung der lysosomalen Protease Cathepsin B führt. Dies ist ein essentieller Schritt zur Einleitung von Apoptose durch Glukortikoide und zeigt zum ersten Mal, dass der lysosomale Amplifikationsloop in diesen Prozess involviert ist. Die Analyse des durch Glukokortikoide induzierten Zelltodes in verschiedenen T-ALL Zelllinien deutet darauf hin, dass die durch Glukokortikoide induzierten Signalwege in Thymozyten und allen Lymphonzelllinien aber nicht in peripheren T Zellen übereinstimmen. Da die hoch-dosierte Glukokortikoidbehandlung eine wichtige Rolle in der Behandlung von hematologischen bösartigen Erkrankungen spielt, können unsere Beobachtungen eine Grundlage für eine neue Anti-Krebs-Stragie bilden, die darauf ausgelegt ist, spezifisch Tumorzellen zu eliminieren aber reife T-Zellen unberührt lassen. N2 - Glucocorticoids (GCs) are small lipophilic compounds that mediate a plethora of biological effects by binding to the intracellular glucocorticoid receptor (GR) which, in turn, translocates to the nucleus and directly or indirectly regulates gene transcription. GCs remain the cornerstone in the treatment for a number of hematological malignancies, including leukemia, lymphoma and myeloma. Extensive literature suggests that the efficacy of GCs stems from their ability to mediate apoptosis. Despite the enormous strides made in our understanding of regulated cell death, the exact mechanism by which GCs cause apoptosis is still unknown. The data obtained so far provide strong evidence that gene transactivation by the GR underlies the initiation phase of GC-induced thymocyte apoptosis. Furthermore, the multicatalytic proteasome, several members of the Bcl-2 family, changes in calcium flux as well as caspases have been identified as important players in the execution phase of GC-mediated cell death. However, the exact sequence of events in this process still remains elusive. A major problem of the current discussion arises from the fact that different cell types, such as thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells are compared without acknowledging their different characteristics and gene expression profiles. Although it is generally assumed that GCs induce apoptosis via a conserved mechanism, this is not supported by any data. In other words, it is possible that thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells may undergo cell death along different pathways. We therefore wondered whether a unique signal transduction pathway is engaged by GCs to initiate and execute cell death in all types of T lymphocytes or whether distinct pathways exist. Therefore, we compared the role of the proteasome, various caspases, the lysosomal compartment and other factors in GC-induced apoptosis of murine thymocytes and peripheral T cells as well as T-ALL lymphoma cells. Our findings show that the initiation phase of GC-induced apoptosis is similar irrespective of the differentiation state of the cell. Apoptosis in both thymocytes and peripheral T cells is mediated by the GR and depends on gene transcription. In contrast, the execution phase significantly differs between thymocyte and peripheral T cells in its requirement for a number of signal transduction components. Whilst in thymocytes, the proteasome, caspases 3, 8 and 9 as well as cathepsin B play an important role in GC-induced apoptosis, these factors are dispensable for the induction of cell death in peripheral T cells. In contrast, changes in the expression and intracellular location of Bcl-2 family members do not appear to contribute to GC-induced apoptosis in either cell type. Importantly, our observation that GC treatment of thymocytes leads to an activation of the lysosomal protease cathepsin B and that this is an essential step in the induction of cell death by GCs, is the first indication that a lysosomal amplification loop is involved in this process. Analysis of GC-induced apoptosis in several T-ALL cell lines further indicates that the signaling pathway induced by GCs in thymocytes but not in peripheral T cells is shared by all lymphoma cell-types analyzed. Given the therapeutic importance of high-dose GC-therapy for the treatment of hematological malignancies, this finding could potentially form a basis for new anti-cancer strategies in the future, which specifically target tumor cells whilst leaving peripheral T cells of patients untouched. KW - T-Lymphozyt KW - Apoptosis KW - Glucocorticosteroide KW - Glukocorticioid KW - Mechanismus KW - Apoptose KW - Thymozyten KW - T-zellen KW - glucocorticoid KW - mechanism KW - apoptosis KW - thymocyte KW - T cell Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17317 ER - TY - JOUR A1 - Walter, T. A1 - Collenburg, L. A1 - Japtok, L. A1 - Kleuser, B. A1 - Schneider-Schaulies, S. A1 - Müller, N. A1 - Becam, J. A1 - Schubert-Unkmeir, A. A1 - Kong, J. N. A1 - Bieberich, E. A1 - Seibel, J. T1 - Incorporation and visualization of azido-functionalized N-oleoyl serinol in Jurkat cells, mouse brain astrocytes, 3T3 fibroblasts and human brain microvascular endothelial cells JF - Chemical Communications N2 - The synthesis and biological evaluation of azido-N-oleoyl serinol is reported. It mimicks biofunctional lipid ceramides and has shown to be capable of click reactions for cell membrane imaging in Jurkat and human brain microvascular endothelial cells. KW - Ceramide KW - Apoptosis KW - Golgi KW - N-oleoyl serinol KW - Jurkat cells Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191263 VL - 52 IS - 55 ER - TY - THES A1 - Vukicevic, Vladimir T1 - Mechanisms of apoptosis modulation and their contribution to genomic instability in tumor cells T1 - Mechanismen von Apostose Modulation und ihr Beitrag zur genomischen Instabilität N2 - The concept of programmed cell death has been increasingly considered from various aspects since early 1970’s. Primarily, knowledge of apoptosis referred to morphological changes in which chromatin is condensed and increasingly fragmented, revealed as small structure in the nucleus. The membrane shrinks and the cell becomes dense as can be seen by flow cytometry. Interestingly, similar modes of cell deletion were observed in nematodes indicating that apoptosis is a highly conserved machinery. Three Caeonorhabditis elegans gene products are found to have high homology with mammalian apoptotic genes: CED-9 inhibits apoptosis and is related to bcl-2; CED-3 and CED-4 promote apoptosis and are related to caspase 9 and APAF-1. Apoptosis is not accidental death, but a highly controlled and medically important molecular process. More general terms such as ‘physiological’ or ‘regulated’ cell death cover different morphologies and sequences. Programmed suicide of cells that were subjected to toxic exogenous and endogenous stimuli plays a key role in understanding cancer development and its treatment. Apoptosis involves sequences of events that may overlap and play contradictory or antagonistic roles in cell death. Generally, the ability to trigger apoptotic processes in cancer cells would benefit an organism by keeping homeostasis intact. Programmed cell death is a regularly present mechanism, for instance, in lymphocyte recruitment in the thymus where immature lymphocytes may recognize host antigens. Therefore, such lymphocytes become apoptotic and are removed by macrophages. Removal prevents possible autoimmune diseases. Unlike apoptosis, necrosis is a passive process of cell death recognizable by membrane morphological changes and accompanied by leakage of intracellular material into intercellular space that may cause inflammation in the organism. Signals that may initiate apoptosis are generally classified into two groups: signals that launch extrinsic apoptotic pathways starting with aggregation of death receptors and intrinsic apoptotic pathways starting with disruption of intracellular homeostasis such as the release of mitochondrial factors or DNA degradation. Early in the process, apoptotic signals may lead to a broad range of signaling mechanisms such as DNA repair and assessment of DNA damage (check points). Thus, failure in any of these steps can cause a defective apoptotic response that plays a decisive role in both tumorigenesis and drug resistance in tumor treatment. More distinctly, the capability of cancer cells to go into apoptosis prevents further neoplastic changes. Generally, the purpose of this study is to investigate the balance between formation of genomic damage and induction of apoptosis under genotoxic stress. After genotoxic insult there are different possibilities for the fate of a cell (Figure 1). The genomic integrity is analyzed at cellular checkpoints, usually leading to a delay in cell cycle progression if DNA was damaged. Mutations in genes such as p53 and p21 change the cellular response to genotoxic stress and may alter the balance between apoptosis and genomic damage. However, p53 is usually mutated or not expressed in 70% of human tumors. Alterations in p53 states that reflect distinct apoptotic response upon induction of DNA damage were examined. In this study, three cell lines with distinct p53 states were used: TK6 harboring wild-type p53, WTK1 with mutated p53 and NH32 with knocked out p53. In the present work we applied different approaches to investigate the correlation between DNA damage and apoptotic responsiveness in cancer cell lines with different p53 states or in hormone responsive cell lines with over expressed bcl-2 gene. We were focused on effects caused by temporary down regulation of the p53 and Bcl-2 activity in human lymphoblastoid cell lines. In addition, we investigated the impact of estradiol-induced proliferation on apoptosis and DNA damage in stably transfected cells with bcl-2gene. N2 - Apoptotische Ereignisse als Reaktion auf exogen induzierten gentoxischen Schaden erhält die Homeostase von Organismen durch die Entfernung betroffener Zellen. Fehler in der apoptotischen Reaktion spielen sowohl für die Tumorentstehung als auch für die Chemotherapie-Resistenz eine wichtige Rolle. Der Zweck dieser Studie war es, die Balance von Genom-Schaden, gemessen durch Mikrokern-Bildung, und der Induktion von Apoptose als Reaktion auf gentoxischen Stress zu untersuchen. Mikrokerne erscheinen als Folge unterschiedlicher Chromosomenaberrationen. Der Mikrokern-Test hat schnell an Akzeptanz gewonnen und wird inzwischen als Routine-Test für Gentoxizitätsprüfung eingesetzt. Die Hypothese war, dass die Mikrokern-Bildung umgekehrt mit dem Auftreten von Apoptose korreliert ist. In drei humanen Zelllinien mit wildtyp p53, mutiertem p53 und knock-out p53 konnten durch Behandlung mit dem gentoxischen Topoisomerase-II-Hemmer Etoposid Apoptosen induziert werden. Die dabei beobachtete Erhöhung der Mikrokern-Häufigkeit war in Zellen mit mutiertem p53 stärker ausgeprägt als in Zellen mit wildtyp p53 oder knock-out p53. Drei Vorgehensweisen wurden angewandt, um die molekularen Mechanismen zu verändern, welche die Wechselbeziehung zwischen apoptotischen Ereignissen und induziertem DNA-Schaden bestimmen. Im ersten Ansatz wurde die Apoptose vorübergehend durch Pifithrin (PFT-α), einen p53-Blocker, verhindert. So wurde der Einfluss verschiedener p53-Zustände (Wildtyp, mutiert und knock-out) auf DNA-Reparatur, den Zellzyklus und Apoptose untersucht. Der zweite Ansatz bestand aus einer vorübergehenden Transfektion mit bcl-2 Antisense Oligonukleotiden zur Reduktion der Bcl-2-Expression. Der dritte Weg war eine stabile Transfektion des bcl-2-Gens in eine estrogenrezeptorhaltigen Zelllinie. Dies ermöglichte den Einfluss von β-Estradiol-induzierter Zellproliferation zu untersuchen. KW - Apoptosis KW - DNS-Schädigung KW - Kleinkern KW - Tumorzelle KW - Apoptose KW - DNA Schaden KW - Micronucleus KW - p53 KW - Bcl-2 KW - Apoptosis KW - DNA damage KW - Micronuclei KW - p53 KW - Bcl-2 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10605 ER -