TY - THES A1 - Zdzieblo, Daniela T1 - Das Polycomb group Protein PCGF6 ist ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung und kann in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen T1 - The Polycomb group protein PCGF6 is a new and essential factor for iPS reprogramming that can replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc N2 - Embryonale Stammzellen (ESCs) sind durch zwei charakteristische Eigenschaften definiert. Neben einer kontinuierlichen Selbsterneuerungskapazität weisen ESCs die Fähigkeit auf, in alle Zelltypen der drei Keimblätter differenzieren zu können. Diese Eigenschaften werden unter anderem durch ein Netzwerk wichtiger Pluripotenzfaktoren als auch durch epigenetische Mechanismen reguliert, welche die Transkription von Pluripotenz- und Differenzierungsgenen kontrollieren. In murinen ESCs sind an der Repression von Differenzierungsgenen auch Polycomb group (PcG) Proteine beteiligt. Diese Proteine bauen zwei Chromatin-modifizierende Komplexe auf, die als Polycomb repressive complex 1 bzw. 2 (PRC1 bzw. PRC2) bezeichnet werden. Nach dem klassischen Modell der Polycombfunktion, katalysieren PRC1 und PRC2 gemeinsam zwei charakteristische Histonmodifikationen, die zur Repression PRC-spezifischer Zielgene beitragen. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegen, dass der Proteinaufbau der PRC1 Komplexe stark variieren kann, wobei die Familie der Polycomb group RING finger (Pcgf) Proteine eine wichtige Rolle spielt. In diesem Zusammenhang definieren einzelne Pcgf Paraloge (Pcgf1 – 6) verschiedene PRC1 Varianten (PRC1.1 – 1.6), die Komplex-spezifische Bindestellen im Genom aufweisen. Diese Erkenntnisse lassen auf unterschiedliche Mechanismen der PRC1 Varianten und Pcgf Paralog-spezifische Funktionen schließen, die zum jetzigen Zeitpunkt nur wenig erforscht sind. Für manche Pcgf Paraloge sind wichtige Rollen in verschiedenen Stammzelltypen und während der iPS Reprogrammierung bekannt. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) und Pcgf4 (Bmi1) zeigen eine Funktion in verschiedenen adulten Stammzellen. Pcgf4 spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle in der murinen iPS Reprogrammierung. Für Pcgf6 (Mblr) wird eine Pluripotenz-assoziierte Funktion angenommen, denn Pcgf6 ist das einzige Pcgf Paralog, das eine erhöhte Expression in murinen ESCs aufweist, die jedoch im Verlauf der ESC-Differenzierung absinkt. Außerdem zeigen murine Pcgf6 KD ESCs eine verminderte Expression der Pluripotenzgene Oct4, Sox2 und Nanog, eine De-Repression mesodermaler und Testes-spezifischer Gene als auch eine erhöhte Tendenz zur hämatopoetischen Differenzierung. Wie genau Pcgf6 an der Regulation dieser Prozesse in murinen ESCs beteiligt ist, ist nicht bekannt. In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Funktion von Pcgf6 in der murinen iPS Reprogrammierung untersucht. Da bereits für Pcgf4 eine Rolle in der Reprogrammierung somatischer Zellen gezeigt wurde und Pcgf6 eine erhöhte Expression in ESCs aufweist, wurde auch für Pcgf6 eine Funktion in der iPS Reprogrammierung angenommen. Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pcgf6 während der iPS Reprogrammierung verstärkt exprimiert wird und in iPS Zellen eine ESC-ähnliche Expression aufweist. Darüber hinaus konnte Pcgf6 in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 in der iPS Reprogrammierung ersetzen. Zudem wurden für OPKM-induzierte iPS Zellen charakteristische Eigenschaften pluripotenter Zellen nachgewiesen. Außerdem konnte eine Rolle von Pcgf6 als Enhancer-Faktor für die iPS Reprogrammierung ausgeschlossen werden, da die Überexpression von Pcgf6 zusammen mit den OSKM Faktoren keine additiven Effekte auf die Reprogrammierungseffizienz erzielte. Im Gegensatz dazu führte der Knockdown (KD) von Pcgf6 in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) zu verminderten Effizienzen nach OSKM Reprogrammierung. Darüber hinaus handelte es sich bei der Mehrheit der AP+ Kolonien, die unter Pcgf6 KD Konditionen entstanden, um partiell-reprogrammierte iPS Zellen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit, dass Pcgf6 ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung ist, der in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen kann. N2 - Embryonic stem cells (ESCs) are characterized by their ability for continuous self-renewal maintaining the undifferentiated cell state and their capacity to generate all differentiated cell types of the three germ layers. Regulators of these characteristics include a protein interaction network of pluripotency-specific factors and epigenetic mechanisms that together control the transcription of pluripotency- and differentiation-associated genes. Among the interaction partners of the pluripotency-specific protein network in murine ESCs are Polycomb group (PcG) proteins. These proteins assemble in two complexes termed Polycomb group repressive complex 1 and 2 (PRC1 and PRC2). In the classical model, PRC1 and PRC2 act hierarchically together in catalyzing two characteristic histone modifications thereby contributing to the repression of PRC-specific target genes like differentiation-associated genes in ESCs. Recently, it has been shown that there are numerous PRC1 variants that differ in their protein composition. In this context, the family of Polycomb group RING finger (Pcgf) proteins (Pcgf1 – 6) defines distinct PRC1 variants (PRC1.1 – 1.6) that exhibit complex-specific genomic binding sites. Together, this indicates diverse mechanisms of PRC1 variants and Pcgf Paralog-specific functions that are not well understood. Pcgf Paralogs are known to play essential roles in various stem cell types and during iPS reprogramming. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) and Pcgf4 (Bmi1) function in diverse adult stem cells. Further, Pcgf4 plays a role in murine iPS Reprogramming. For Pcgf6 (Mblr), a pluripotency-associated function is assumed. Pcgf6 is the only Pcgf paralog with an elevated expression in murine ESCs and when ESCs differentiate Pcgf6 expression decreases. In addition, following Pcgf6 KD in ESCs the expression of Oct4, Sox2 and Nanog declines while mesodermal and testes-specific genes become de-repressed. Furthermore, Pcgf6 KD ESCs are more prone for hematopoietic lineage differentiation. The precise mechanisms by which Pcgf6 controls these processes in murine ESCs are not known. In this work, I investigated the function of Pcgf6 in murine iPS reprogramming. I assumed a role for Pcgf6 in iPS reprogramming because it is highly expressed in ESCs and it was recently shown that Pcgf4 plays a role in the reprogramming of somatic cells. The data of my work show that Pcgf6 expression is increased in iPS reprogramming and that Pcgf6 exhibits an ESC-like gene expression pattern in iPS cells. Furthermore, Pcgf6 was able to replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. In addition, OPKM-induced iPS cells showed pluripotency-specific characteristics. The overexpression of Pcgf6 together with the OSKM factors did not result in significantly increased reprogramming efficiencies indicating that Pcgf6 does not function as an enhancer-factor. However, Pcgf6 knockdown (KD) in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) resulted in decreased efficiencies after iPS reprogramming. Additionally, the majority of AP+ colonies formed after OSKM reprogramming of Pcgf6 KD MEFs represented partially reprogrammed iPS cells, as they did not exhibit ESC-like morphologies and reduced expression levels of Oct4, Sox2 and Nanog. Together, the data of my work show that Pcgf6 is a new and essential factor in iPS reprogramming that can specifically replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. KW - Stammzelle KW - iPS Reprogrammierung KW - Differenzierung KW - Repression KW - Reprogramming Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106870 ER - TY - THES A1 - von Waldthausen, Nicolas Johannes T1 - Objektiv meßbare Kriterien zur frühzeitigen Differenzierung zwischen Aspirationspneumonien und nosokomialen Pneumonien auf einer Chirurgischen Intensivstation - Eine Pilotstudie - T1 - Objective measurable criterions for an early difference beteen pneumonia bacause of aspiration and nosocomial pneumonia on a surgical intensive care unit - pilot project - N2 - Aspirationspneumonien und nosokomiale Pneumonien unterscheiden sich in den objektiv meßbaren Krierien nur sehr wenig. Sie gehen mit unterschiedlichen Keimspektren und Komorbiditäten einher. Zur genauen Differenzierung hinsichtlich exakterer Unterscheidung sind sehr hohe Fallzahlen von Nöten. N2 - Pneumonia because of aspiration and nosocomial pneumonia are in the most parts of early measurable differences very common. They have a different spectrum of pathogenes and comorbidity. You need a big number of cases to get an exacter difference. KW - Aspirationspneumonie KW - nosokomiale Pneumonie KW - Differenzierung KW - meßbare Kriterien KW - Aspiration KW - nosocomial pneumonia KW - difference KW - measurable criterion Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29620 ER - TY - THES A1 - Vinke, Wiebke T1 - Chondrogenes Differenzierungspotential von BMSCs unter Zugabe von Kartogenin bzw. der Peptidsequenzen KLER und WYRGRL in Pelletkulturen T1 - Potential for chondrogenic differentiation of BMSCs in pellet culture system with the addition of Kartogenin or the peptides KLER and WYRGRL N2 - Die in vitro Differenzierung von Knorpelgewebe unter Verwendung von mesenchymalen Stromazellen aus dem Knochenmark (BMSCs) als Zellquelle und Transforming growth factor ß (TGF-ß1) als Wachstumsfaktor ist bereits etabliert. In weiteren Studien haben sich neue möglich Differenzierungsfaktoren wie Kartogenin und Peptidsequenzen wie KLER und WYRGRL gezeigt. Ziel dieser Arbeit war es, den Effekt dieser drei Substanzen auf die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen in einer Pelletkultur in Anwesenheit von TGF-β zu evaluieren. Die Analyse erfolgte (immun)histologisch und biochemisch durch Bestimmung der knorpelspezifischen EZM-Moleküle wie Kollagen II und Glykosaminoglykane bzw. des GAG- und Gesamtkollagengehaltes. Insgesamt konnte nach dreiwöchiger Kultur für keinen der drei zugegebenen Faktoren ein eindeutig positiver Effekt auf die chondrogene Differenzierung von BMSCs nachgewiesen werden. Unter konstanter KGN- Zugabe zeigte sich eine intensivere Kollagen II-Färbung, sowie ein signifikant höherer Kollagen- und GAG-Gehalt an Tag 10, jedoch auch eine intensivere Kollagen X Färbung. Diesbezüglich sollten noch weitere Untersuchungen, insbesondere auf mögliche unerwünschte hypertrophe Effekte durchgeführt werden. N2 - Chondrogenic differentiation of bone marrow derived mesenchymal stroma cells (BMSCs) with transforming growth factor-ß (TGF-ß) is already established. Further studies have shown new possible differentiation factors such as Kartogenin or the peptids KLER and WYRGRL. The aim of this study was to assess the effect of these three factors on the chondrogenic differentiation potential of BMSCs in pellet culture system with the addition of TGF-ß. Cartilage specific matrix components such as collagen II and glycosaminoglycans (GAG) were detected with immuno histological and biochemical analysis. After three weeks, there was no clear positive effect. Only the continuous addition of Kartogenin led to a more intensive collagen II stain and a significantly higher collagen and GAG content after 10 days, however the collagen X stain was more intensiv aswell. Further scientific studies are required to validate these observations, specifically the possible adverse effect of chondrogenic hypertrophy. KW - Differenzierung KW - Potential KW - Differenzierungspotential KW - Kartogenin KW - WYRGRL KW - KLER Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-253958 ER - TY - THES A1 - Subota, Ines T1 - Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control T1 - Steuerungsmechanismen der Differenzierung in Trypanosomen: die Rolle von ALBA Proteinen in post-transkriptioneller mRNA Kontrolle N2 - Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly. N2 - Trypanosoma brucei ist ein digenetischer, eukaryotischer Parasit, der zwischen Säugetier und Tsetsefliege alterniert, in welchen er unterschiedliche Gewebe besiedelt. Er ist die Ursache für die Schlafkrankheit in Afrika südlich der Sahara. Der Lebenszyklus der Trypanosomen besteht aus mehr als neun Parasitenstadien, die eindeutig anhand ihrer Morphologie, ihres Metabolismus und der Positionierung ihrer DNA Organellen unterschieden werden können. Trypanosomen bleiben ausschließlich extrazellulär und kommen im Laufe ihres Infektionszyklus mit sich verändernden Umwelteinflüssen in Berührung, z. B. Temperaturschwankungen, Variation in vorhandenen Energiequellen, erhöhte Viskosität usw. In Übereinstimmung mit der anerkannten sensorischen Funktion die Cilien in Vielzellern ausüben, wurde für diese Rolle das strukturverwandte Flagellum in Trypanosomen vorgeschlagen. Die Erkennung wechselnder Umweltparameter ist der vermutliche Auslöser für Differenzierungsprozesse, die ein Entwicklungsstadium hervorbringen, welches am besten an die neue Umgebung angepasst ist. Dies wird durch eine Modifizierung der Genexpression erreicht, die in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Ebene erfolgt. Diese Arbeit zeigt, dass die RNA bindenden Proteine ALBA3 und ALBA4 an der Differenzierung von Trypanosomen in der Tsetsefliege beteiligt sind. Immunfluoreszenzanalyse und Lebendvideomikroskopie von Zellen, die eine an YFP gekoppelte Variante der Proteine enthalten, haben gezeigt, dass sich ALBA3/4 im Zytosol befinden und dass sie in jedem Parasitenstadium exprimiert sind, mit Ausnahme derer, die im Proventrikel der Tsetsefliege zu finden sind. Das Herunterregulieren der Proteine in vorangehenden Stadien, führt zu markanten Veränderungen, die mit denjenigen, die in Parasiten im Proventrikel zu finden sind, vergleichbar sind: z. B. Verlängerung der Zelle, Zellzyklusarrest und Lokalisierung des Zellkerns in eine posteriore Position. Im Gegenteil dazu findet die Umpositionierung des Zellkerns nicht statt, wenn ALBA3 während der Entwicklung des Parasiten in der Tsetsefliege überexprimiert wird. Ein vergleichbarer Effekt wird mit ALBA4 Überexpression nicht erreicht, welches die Entwicklung nicht negativ zu beeinflussen scheint. Wenn Trypanosomen Hungerstress ausgesetzt sind, reichern sich beide ALBA Proteine zusammen mit DHH1, einem anerkannten RNA bindenden Protein, in zytoplasmatischen Aggregaten an, die nur teilweise mit denjenigen kolokalisieren, die durch polyA+ RNA in diesen Bedingungen verursacht werden. Diese Arbeit zeigt, dass ALBA Proteine eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Trypanosomen spielen und legt nahe, dass sie an der entwicklungsbedingten Kontrolle eines Teils der mRNA Expression beteiligt sind. Der zweite Teil dieser Arbeit handelt von der Identifizierung neuer flagellarer Proteine, die eine sensorische Funktion haben könnten. Hierfür wurden mehrere Proteinkandidaten aus einer durchgeführten Proteomanalyse intakter Flagellen gewählt. Die vorliegende Arbeit bestätigt die flagellare Lokalisierung der Proteine mit großem Erfolg (85% der untersuchten Proteine) und zeigt, dass sie unterschiedliche Verteilungsmuster vorweisen. Zwei der Proteine werden während der Infektion des Parasiten in der Tsetsefliege untersucht, was aufdeckt, dass eines davon in den Stadien im Proventrikel herunterreguliert ist. Die Funktionsstudie eines neu identifizierten flagellaren Membranproteins weist seine schnelle Dynamik im Flagellum auf, führt jedoch zu keinem sichtbaren Phänotyp in Laborbedingungen. Diese Beobachtung passt zu der Annahme, dass Proteine mit sensorischer Funktion in stabilen Laborverhältnissen nicht essentiell sind aber eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Parasiten in natürlichen Bedingungen spielen. Zusammenfassend fügt diese Arbeit Teile zum Puzzle der Identifizierung molekularer Schalter, die in Trypanosomenstadien in der Tsetsefliege an der mRNA Kontrolle und der Erkennung der Umwelt beteiligt sind. KW - Trypanosoma brucei KW - Parasit KW - Entwicklung KW - Tsetsefliege KW - Trypanosomen KW - parasitärer Entwicklungszyklus KW - Differenzierung KW - Tsetse Fliege KW - ALBA Proteine KW - Kontrolle der Genexpression KW - trypanosomes KW - parasite cycle KW - differentiation KW - tsetse fly KW - ALBA proteins KW - gene expression control KW - flagellar sensing proteins KW - FLAMM KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85707 N1 - Durchführung der Experimente am Institut Pasteur, Arbeitsgruppe Trypanosome Cell Biology Unit, Paris, Frankreich ER - TY - THES A1 - Steinack, Carolin T1 - Untersuchungen zum Differenzierungspotential humaner Monozyten in vitro: Nachweis Insulin- und C-Peptid-positiver Zellen T1 - Investigation of in vitro modified human blood monocytes: Characterisation by immunohistochemistry and functional proof of their insulin N2 - Monozyten lassen sich in vitro nicht nur zu Makrophagen und Dendritischen Zellen differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen. Monozyten scheinen somit über pluripotente Eigenschaften zu verfügen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich kultivierte Monozyten tatsächlich in Insulin-exprimierende Zellen differenzieren lassen. Monozyten von gesunden Spendern im Alter zwischen 20 und 26 Jahren wurden untersucht. Die über eine Leukozytenapherese gewonnenen Mono- zyten wurden über Adhärenz angereichert und für sechs Tage in X-Medium mit den Cytokinen M-CSF und IL-3 und für weitere 15 Tage in Y-Medium mit den Cytokinen HGF und EGF inkubiert. Die Zellen wurden immunhistochemisch und funktionell untersucht. Frisch isolierte Blutmonozyten waren vor ihrer Kultivierung negativ für Insulin, C-Peptid und Glukagon. Am 4. Kulturtag wurden Insulin und C-Peptid in den kultivierten Monozyten nachgewiesen. Die Expression von Insulin war jedoch nicht stabil: während am Tag 11 der Anteil Insulin-positiver Zellen bei ca. 80% lag, waren am Tag 14 nur noch ca. 30% der kultivierten Zellen Insulin-positiv. Dies wurde ebenfalls für den Nachweis von C-Peptid beobachtet. Auch die Expression von Glukagon war nicht stabil. Diese Beobachtung wird darauf zurückgeführt, dass sich die Monozyten zu Makrophagen differenzierten und diese eindeutig kein Insulin produzieren. Da Zellen Insulin aufnehmen und speichern können, sollte in dieser Arbeit die Frage geklärt werden, ob immunhistochemisch zu unterscheiden ist, ob Zellen Insulin gebildet (de novo Insulin) oder unspezifisch aufgenommen haben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass zum eindeutigen Nachweis von de novo Insulin der Nachweis von C-Peptid unbedingt zu fordern ist. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente mit aufgereinigtem Insulin belegen, dass für aufgenommenes Insulin – im Gegensatz zu de novo Insulin – C-Peptid immun- histochemisch nicht nachzuweisen ist. Das aus in vitro kultivierten Monozyten isolierte Insulin war in diabetischen Mäusen biologisch aktiv, d.h. es senkte den Blutzuckerspiegel kurzfristig. Hierzu wurden geerntete Monozyten der Kulturtage 6-12 im Ultraschallbad aufgeschlossen und der zellfreie Überstand diabetischen Mäusen injiziert. Insgesamt senkten 11 der 31 (35,5%) in dieser Arbeit getesteten Überstände den Blutzuckerspiegel dieser Tiere um mehr als 15%. Bezogen auf die 18 Proben, die einen Effekt zeigten, sind dies sogar 61%. In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich gezeigt, dass in vitro modifizierte Monozyten Insulin exprimieren, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse senkt. N2 - Monocytes differentiate not only in macrophages and dendritic cells but also in a variety of non-phagocytic cells. Monocytes or a subpopulation of monocytes seem to exhibit pluripotent diversity. In the present study the potential of in vitro cultured monocytes to differentiate into insulin-expressing cells was analysed. Monocytes of healthy human donors between 20 and 26 years old were analysed. They were obtained by leukocyte aphaeresis, enriched by adherence and cultured six days in X-Medium containing MCS-F und IL-3 and a further 15 days in Y-Medium containing HGF and EGF. The cells were characterized by immunohistochemistry and functional assays. Freshly isolated blood monocytes were negative for insulin, C-peptide and glucagon. In contrast, cultured monocytes were positive for insulin and C-peptide, detectable after 4 days in culture. However, the insulin expression was unstable. On day 11 of culture the amount of insulin-positive cells reached a maximum of 80 percent positive, by day 14 of culture the amount of insulin-positive cells had decreased to 30 percent. Similar results were obtained for C-peptide and glucagon. It seems that monocytes lost the ability to express insulin during their differentiation into macrophages. It is well known, that cells are able to take up and accumulate exogenous insulin. One aim of this study was to differentiate by immunohistochemistry between de novo insulin and exogenous insulin taken up by the cells from the environment. We showed that the presence of C-peptide must be proven to clearly identify de novo insulin. Experiments with purified insulin demonstrated that cells that took up purified insulin were negative for C-peptide. Insulin isolated from in vitro cultured monocytes demonstrated biological activity and reduced blood glucose levels in diabetic mice. Eleven of 31 in vivo tested cell-free supernatants (35.5 percent) lowered blood glucose levels in diabetic mice by more than 15 percent. The results of the study show that in vitro modified monocytes are able to produce insulin that reduces blood glucose levels in diabetic mice. KW - Insulin KW - Insulinstoffwechsel KW - Monozyten KW - Differenzierung KW - C-Peptid KW - Monocytes KW - Differentiation KW - C-Peptid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55518 ER - TY - THES A1 - Singler, Philipp Anton T1 - Ein zytogenetisches Profil diffuser grosszelliger B-Zell Lymphome : Der Einfluss von Lokalisation und zellulärer Differenzierung T1 - Zytogenetic Subtyping of Diffuse Large B-Cell Lymphoma: Influence of Localisation and Cellular Differentiation N2 - Diffuse großzellige B-Zell Lymphome stellen weltweit die größte Gruppe maligner B-Zell Non-Hodgkin-Lymphome dar und umfassen eine biologisch, genetisch und klinisch heterogene Gruppe lymphoider Tumoren, die als Hauptmerkmal große transformierte B-Lymphozyten mit vesikulären Kernen und prominenten Nukleoli aufweisen. Nur ungefähr 40% der Patienten zeigen ein Ansprechen auf eine konventionelle Chemotherapie. Um von einer präziseren Prognose profitieren zu können, ist eine reproduzierbare Klassifizierung dieser „inhomogenen Entität“ nicht nur für die Betroffenen wünschenswert. Dadurch könnten Krankheitsverläufe genauer vorhergesagt und die Therapie optimiert werden. Während akute Leukämien häufig mit einer Translokation assoziiert sind, zeigt sich bei B-Zell-Lymphomen ein weitaus komplexeres Bild an zytogenetischen Aberrationen. Diese werden einerseits mit der Etablierung des malignen Phänotyps, andererseits mit der Tumorprogression und der klonalen Evolution eines Tumors in Verbindung gebracht. Obwohl die meisten Neoplasien rekurrente und Tumor-spezifische klonale chromosomale Aberrationen aufweisen, ist es noch nicht gelungen, durch Etablieren genetischer „Marker“ eine zuverlässige Aussage über Verlauf und Ansprechen und damit über die Prognose dieser Erkrankung zu machen. Solche Aussagen sind bis dato nur auf Basis allgemeiner klinischer Parameter wie dem Allgemeinzustand der Patienten und der Höhe der Lactat-Dehydrogenase (LDH) im Serum gesichert möglich, die neben anderen Parametern im „International Prognostic Index“ zusammengefasst sind. Zytogenetische, molekulargenetische und in den letzten Jahren auch Hochdurchsatz-Untersuchungen, wie z.B. die Mikroarray-Technologie, haben bereits zu einem besseren Verständnis dieser molekularen Unterschiede geführt. Die WHO-Klassifikation stellt im Hinblick auf die Definition ‚biologischer’ Tumorgruppen einen deutlichen Fortschritt dar. Diese neueren Untersuchungen zeigen auf der Basis des Genexpressionsprofils von diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen die mögliche Unterteilbarkeit dieser diagnostischen Kategorie anhand zweier unterschiedlicher Phänotypen: GC-DLBCL zeigen eine molekulare Signatur, die vergleichbar mit normalen Keimzentrumszellen ist. Die andere Gruppe (ABC-DLBCL bzw. non-GC-DLBCL) entsteht aus Zellen, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen haben. GC- und ABC-DLBCL-Patienten weisen bei einer Anthracyclin-haltigen Chemotherapie (z. B. CHOP) in retrospektiven klinischen Studien einen deutlichen Unterschied in der 5-Jahres-Überlebensrate auf (etwa 60% für GC-DLBCL und 35% für ABC-DLBCL). Somit scheint die Annahme, dass mindestens zwei Entitäten vorliegen, gerechtfertigt. In der vorliegenden Studie konnten das zytogenetische Aberrationsspektrum mittels eines Algorithmus anhand des Genexpressionsprofiles mit zwei verschiedenen Subgruppen – den GC-DLBCL und den non-GC-DLBCL - korreliert werden. Es entstand die bisher umfangreichste zytogenetische Charakterisierung dieser postulierten Phänotypen. Es konnte gezeigt werden, dass GC-DLBCL, die durch die Translokation t(14;18) charakterisiert sind, häufiger Zugewinne bei Chromosom 7 aufweisen, während non-GC-DLBCL mit dem Vorliegen einer Trisomie 3 und Zugewinnen bei 3p und 3q assoziiert sind. Zwei Modelle könnten eine Erklärung für die Assoziation genomischer Instabilitäten mit den unterschiedlichen Genexpressionsprofilen sein. Einerseits könnte eine gewisse Region für die Kodierung eines Schlüsselregulatorgenes verantwortlich sein, welches die Zellbiologie und damit die Genexpression verändert. Andererseits könnten die Subgruppen der DLBCL auf verschiedenem Wege entstehen und somit unterschiedliche Ereignisse für die verschiedenen Aberrationen verantwortlich sein. Es gilt nun, einerseits diese Mechanismen, die zu einer veränderten Genexpression beitragen, aufzudecken und andererseits ein diagnostisches Vorgehen zu etablieren, bei dem beispielsweise nach dem erfolgten Nachweis von Index-Aberrationen eine bestimmte molekulare Signatur überprüft wird. Es ist anzunehmen, dass molekulare Analysen in absehbarer Zeit vermehrt Einzug in den klinischen Alltag halten und therapeutische Entscheidungen mit beeinflussen werden. In Zukunft wird anhand der Expression von Schlüsselgenen die Zuordnung eines Falles in diagnostische Untergruppen erfolgen. Außerdem könnte durch Peptidblockade dieser Schlüsselgene eine zusätzliche Therapieoption bestehen – eine Vermutung, die weitere Studien erforderlich macht. N2 - Diffuse large B-Cell Lymphoma consist of a biologically, genetically and clinically heterogenetic entity of lymphopid tumors which common feature are blastic transformed B-Lymphoytes with vesicular nuclei and prominent nucleoli. Only 40% of the patients show a remission after an anthrcyclin-containing chemotherapy regimen. To benefit from a precise diagnosis, a reproducible classification is mandatory. While leukemia often is assiciated with a single genetic alteration such as a translocation, B-Cell lymphoma show a complex pattern of zytogenetic aberrations. So far there has been no success in estabishing a genetic "marker" which allows a prognosis. Newer studies based on microarray technology show two different phenotypes though: GC-DLBCL consist of cells originating in the germinal centre while ABC-DLBL (or non-GC-DLBL) have already undergone the germinal centre reaction and show a significantly worse 5-year-overall survival. The former are associated with the t(14;18) translocation while the latter show more often trisomy 3 and gains of chromosome 3q and 3p. These results could help subtyping of genetically distinct DLBL and reveal genes playing a key role in tumorigenesis. KW - B-Zell-Lymphom KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - Cytogenetik KW - Lokalisation KW - Differenzierung KW - Lymphsystem KW - B-Lymphozyt-Tumor KW - Microarray KW - Keimzentrum KW - DLBL KW - DLBCL KW - NHL KW - nodal KW - extranodal KW - WHO-Klassifikation KW - diffuse large B-Cell lymphoma KW - DLBL KW - DLBCL KW - NHL KW - lymphoma Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24113 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Marc T1 - Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen T1 - The role of mitogenic and stress-induced MAPK pathways in the regulation of growth and differentiation of keratinocytes N2 - Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält. N2 - Abnormal proliferation and differentiation processes play an important role in the pathogenesis of various skin diseases. The intracellular signaling mechanisms governing the balance between growth and differentiation of keratinocytes are still largely unknown. In this thesis the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades in keratinocyte growth and differentiation was analysed. Induction of keratinocyte differentiation by elevation of extracellular calcium levels resulted in a rapid and transient activation of the Raf/MEK/Erk (MAPK) pathway but did not increase activity of the stress-activated Jnk or p38 MAPKs. Calcium-induced Erk activation differed in kinetics from mitogenic Erk activation by epidermal growth factor (EGF) and and could be modulated by alterations of intracellular calcium levels. While EGF-induced Erk activation was mediated by the small GTPase Ras, calcium-induced Erk activity occurred independently of active Ras. This suggests that proliferative and differentiation-inducing stimuli use alternative mechanisms to activate the Raf/MEK/Erk pathway. Despite the transient nature of Erk activation, calcium-induced expression of the cell cycle inhibitor protein p21 and the differentiation marker involucrin were sensitive to MEK inhibition which implies a role for the Raf/MEK/Erk pathway in early stages of keratinocyte differentiation. The two calcium binding S100 proteins additionally studied here, MRP8 and MRP14, seem to represent important convergent points between calcium and MAPK signaling. In vitro both proteins are expressed in a differentiation-dependent manner in keratinocytes. Elevation of intracellular calcium levels as well as activation of stress-activated MAPKs resulted in translocation of MRP8/MRP14 complexes to the cytoskeleton. When expression of MRP8 and MRP14 was analysed in serial paraffin- or kryo-sections of healthy or diseased skin, signals in normal skin were largely restricted to differentiating cells of the hair follicle, however, additionally a strong induction of MRP8/14 expression was observed in differentiating epidermal layers of hyperproliferative or tumorigenic skin. In this thesis important novel signaling interactions were identified which provide new basic insights into the molecular mechanisms involved in the regulation of skin homeostasis which is essential for the maintenance of the multiple functions of the epidermis. KW - Keratinozyt KW - Zelldifferenzierung KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Keratinozyten KW - Differenzierung KW - Calcium KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - S100-Protein KW - Raf/MEK/ERK KW - Keratinocyte KW - differentiation KW - calcium KW - MAPK KW - signal transduction KW - S100 protein KW - Raf/MEK/ERK Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013 ER - TY - THES A1 - Raaijmakers, Nadja T1 - Osteoporoseprophylaxe mit pflanzlichen Wirkstoffen T1 - Osteoporosis prevention with plant ingredients N2 - Osteoporose ist einer der häufigsten Knochenerkrankungen im fortschreitenden Alter und zählt, aufgrund der damit verbundenen hohen direkten und indirekten Behandlungskosten, zu einer der zehn wichtigsten volkswirtschaftlichen Krankheiten. Die Behandlung der Osteoporose ist langjährig und umfasst eine medikamentöse Therapie auf der Basis einer „knochengesunden“ Lebensweise hinsichtlich Ernährung und Bewegung. Im Rahmen von Untersuchungen zur Linderung von postmenopausalen Beschwerden, zeigte ein Extrakt der Pflanze Cimicifuga racemosa Potential zu osteoprotektiver Wirksamkeit und rückte somit in den Fokus für eine mögliche Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Osteoporose. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, in enger Zusammenarbeit mit der Bionorica SE, welche für die Aufreinigung und Fraktionierung des Pflanzenextraktes zuständig war, und mit der Arbeitsgruppe um Prof. Wuttke, welche parallele Rattenstudien durchführte, Methoden anzuwenden, mit denen osteoprotektive Wirksamkeiten nachgewiesen und auf einzelne Fraktionen des Extraktes limitiert werden können. ... N2 - Osteoporosis is one of the most common bone diseases in advancing age and is, due to the associated high direct and indirect costs of treatment, one of the ten most important economic diseases. The treatment of osteoporosis lasts for many years and covers a drug therapy based on a "bone-healthy" lifestyle regarding diet and exercise. As part of investigations for the relief of postmenopausal symptoms Cimicifuga racemosa showed potential to osteoprotective effectiveness and thus the focus places special emphasis to the potential application in the treatment and prevention of osteoporosis. The aim of the present study was therefore, in close cooperation with the Bionorica SE, which was responsible for the purification and fractionation of the plant extract and the research group of Professor Wuttke, which conduct parallel rat studies, to investigate methods which demonstrate osteoprotective efficacies and may be limited to individual fractions of the extract. ... KW - Osteoporose KW - Prävention KW - Traubensilberkerze KW - humane mesenchymale Stammzellen KW - Differenzierung KW - osteoprosis KW - prevention KW - black cohosh KW - human mesenchymal stem cells KW - differentiation KW - Arzneimittelforschung KW - Phytopharmakon Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83341 ER - TY - THES A1 - Lukaszyk, Daniel T1 - Vergleich der Kollagenentwicklung und Differenzierungsfähigkeit humaner Stammzellen des Fettgewebes unter dem Einfluss des Prolyl-4- Hydroxylase-Inhibitors EDHB im 2D und 3D Modell T1 - Comparison of collagen development and differentiation ability of human adipose-derived stem cells under the influence of prolyl-4-hydroxylase inhibitor EDHB in a 2D and 3D Model N2 - Das Tissue Engineering von Fettgewebe befasst sich mit der Herstellung von biologisch äquivalenten Gewebekonstrukten mit dem Ziel, diese in der Regenerativen Medizin zur Deckung von Weichteildefekten einzusetzen. Für die Ausreifung, Funktion und das Überleben von Adipozyten wurde die Bedeutung der Extrazellulärmatrix (EZM) zunehmend deutlich.18-20 Untersuchungen zur EZM und ihrer Einflussnahme auf die Adipogenese wurden bislang hauptsächlich an konventionellen zweidimensionalen Zellkulturen unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow-derived MSC), Präadipozyten der Mauszelllinie 3T3-L1 und intramuskulären Präadipozyten aus Rindern (bovine intramuscular preadipocytes, BIP) vorgenommen.23,56,69,76,115 Ziel dieser Arbeit war es Erkenntnisse über den Einfluss der EZM auf die adipogene Differenzierungsfähigkeit unter Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes (human adipose-derived stem cells, hASC) zu gewinnen. Um in vitro eine natürlichere Mikroumgebung der Zellen zu generieren, wurde neben einer 2D Kultur vergleichend ein 3D Modell bestehend aus multizellulären Sphäroiden verwendet.84,85 Zudem war die Bestimmung eines stabilen Housekeeping-Gens notwendig, um valide Ergebnisse in qPCR-Analysen von Genexpressionsstudien zu gewährleisten. Die Auswertung statistischer Parameter (Standardabweichung und Interquartilsbereich) sowie die Ergebnisse dreier zur Stabilitätsprüfung eingesetzten Softwares identifizierten EF1α als robustestes HKG. Der Zusammenhang zwischen der EZM-Entwicklung und der Adipogenese wurde durch Hemmung der Kollagenentwicklung unter Verwendung von Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat (EDHB) untersucht. Bei Betrachtung der Triglyceridsynthese mittels Histologie und quantitativer Analyse (Triglyceridassay) konnte in beiden Kultursystemen eine konzentrationsabhängige Hemmung der Adipogenese festgestellt werden. Im Unterschied zur 2D Kultur konnte der Triglyceridgehalt im 3D Modell annähernd auf das Niveau der nicht-induzierten Kontrolle gesenkt werden und damit ein tendenziell stärkerer negativer Effekt im 3D Modell demonstriert werden. In Untersuchungen zur Genexpression wurde die Expressionsrate der späten adipogenen Marker aP2 und C/EBPα maximal durch Zugabe von 0,05 mM EDHB gesenkt, wobei der Effekt in 3D erneut stärker ausgeprägt war. Bei Betrachtung der Kollagenentwicklung zeigte sich immunhistochemisch zunächst eine Adipogenese-assoziierte Entwicklung der Kollagene I, IV und VI im 2D und 3D Modell. Durch die Zugabe von EDHB ließ sich die Kollagenbildung gleichermaßen in 2D und 3D konzentrationsabhängig inhibieren. Damit konnte ein Rückgang der Synthese von drei für die Adipozyten relevanten Kollagenen zusammen mit der Störung der adipogenen Differenzierung nachgewiesen werden. Auf mRNA-Ebene hingegen war eine unterschiedliche Expression von Kollagen I und IV nachweisbar. Für Kollagen I wurde eine Abnahme der Expression bei Differenzierung der Zellen beobachtet, während die Expressionsrate von Kollagen IV erst mit Beginn der Adipogenese gesteigert wurde. Die Genexpression der untersuchten Kollagene wurde durch EDHB nicht negativ beeinflusst. Insgesamt weisen die Ergebnisse auf einen engen Zusammenhang der Kollagensynthese mit der Adipogenese hin. Inwieweit eine durch Zell-Matrix-Interaktionen ausgelöste Signaltransduktion und regulatorische Mechanismen in den Präadipozyten die Adipogenese beeinflussen, bleibt jedoch Gegenstand zukünftiger Forschung. N2 - Adipose tissue engineering focuses on the generation of biologically equivalent tissue constructs that can be used in regenerative medicine to cover tissue defects. The relevance of the extracellular matrix (ECM) in adipocyte maturation, function, and survival has become increasingly apparent.18-20 Studies on the ECM and its influence on adipogenesis have so far mainly been performed on conventional two-dimensional cell cultures using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (bone marrow-derived MSC), mouse cell line 3T3-L1 preadipocytes, and bovine intramuscular preadipocytes (BIP).23,56,69,76,115 The goal of the study was to gain insights into the role of the ECM on adipogenic differentiation capacity using human adipose-derived stem cells (hASC). To generate a more natural cell microenvironment in vitro, a 3D model consisting of multicellular spheroids was used in comparison to a 2D culture.84,85 Moreover, to ensure valid results in gene expression studies obtained by qPCR analyses, determination of a stable housekeeping gene was necessary. The evaluation of statistical parameters (standard deviation and interquartile range) and the results achieved by three softwares known for stability testing identified EF1α as the most robust HKG. The relationship between ECM development and adipogenesis was investigated by inhibition of collagen development using ethyl-3,4-dihydroxybenzoate (EDHB). Histological staining of lipids and quantitative analysis (triglyceride assay) revealed a concentration-dependent inhibition of adipogenesis in both culture systems. In contrast to the 2D culture, the triglyceride content in the 3D model could be reduced approximately to the level of the non-induced control, demonstrating an overall stronger inhibitory effect in the 3D model. In gene expression studies, the expression levels of the late adipogenic markers aP2 and C/EBPα were maximally decreased by addition of 0.05 mM EDHB, whereby the effect was again more pronounced in 3D. Regarding the collagen development, an adipogenesis-associated development of collagen I, IV, and VI was seen by immunohistochemical analysis in the 2D and 3D models. Addition of EDHB equally inhibited collagen formation in 2D and 3D in a concentration-dependent manner. This demonstrated a decrease in the synthesis of three collagens relevant to adipocytes along with the disruption of adipogenic differentiation. In contrast, a different expression pattern of collagen I and IV was detectable at the mRNA level. For collagen I, a decrease in expression was observed upon differentiation of the cells, whereas the expression level of collagen IV was increased only with the onset of adipogenesis. Both expression patterns were not affected by EDHB. Overall, the results indicate a close relationship of collagen synthesis with adipogenesis. However, the extent to which signal transduction triggered by cell-matrix interactions and regulatory mechanisms in preadipocytes influence adipogenesis remains the subject of future research. KW - Tissue engineering KW - Kollagen KW - Extrazellulärraum KW - Fettgewebe KW - Differenzierung KW - Extrazllulärmatrix KW - Prolyl-4-hydroxylase-Inhibitor KW - EDHB KW - Ethyl-3,4-dihydroxybenzoate Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240912 ER - TY - THES A1 - Li, Naixin T1 - Dorso-ventral Differentiation and Specification of the Mesencephalon in Early Chick Embryos T1 - Die dorsoventrale Differenzierung und Spezifikation des frühen embryonalen Hühnermittelhirn N2 - The chick midbrain is subdivided into functionally distinct ventral and dorsal domains, tegmentum and optic tectum. In the mature tectum, neurons are organized in layers, while they form discrete nuclei in the tegmentum. An interesting characteristic of the embryonic brain is the development of a large optic tectum, of which the growth becomes obvious at embryonic day 3 (E3). Dorsoventral (DV) specification of the early midbrain should thus play a crucial role for the organization of the neuronal circuitry in optic tectum and tegmentum. In the first part of my thesis, I investigated regional commitment and establishment of cellular differences along the midbrain DV axis. I examined the commitment of gene expression patterns in isolated ventral and dorsal tissue in vivo and in vitro, and studied their cell mixing properties. Explant cultures, and grafting of dorsal midbrain into a ventral environment or vice versa, revealed a gradual increase in the autonomy of region-specific gene regulation between, which was accompanied by a gradual increase in differential adhesive properties from E2 to E3, once the DV axis polarity was fixed. These events happened at a time-point when the majority of midbrain cells are not yet differentiated. Long-term transplantation (6 - 9 days) using quail cells from ventral midbrain as grafts showed the same result. Hence, the results suggest that progressive specification of the midbrain DV axis is accompanied by progressively reduced cell mixing between dorsal and ventral precursors, leading to a partial regionalization of midbrain tissue into autonomous units of precursor cell populations. In the second part I investigated the genes that might be involved in regulating the growth of the tectum. In particular, I focused on the role of Pax7 transcription factor, a paired domain protein. The results suggested that Pax7 was involved in regulating the medial-lateral extension of the tectum. Over expression of Pax7 in dorsal midbrain led to an enlarged tectum accompanied by a raise in cell division, while Pax7 knockdown by shrank caused a reduction in tectum. The overall pattern of neuronal differentiation was not disturbed by an up or down regulation of Pax7. Pax7 also positively regulated Pax3, another pair-ruled gene expressed dorsally. These results suggest that Pax7 very likely together with Pax3 could facilitate or maintain neural cell proliferation in the midbrain at early stages and that a regulation of the size in that region does not influence the neuronal patterning of the developmental field. I further checked the expression and function of a GFPase Rab 23, that was suggested to be involved in the DV patterning in mouse neural tube as a negative regulator of Shh signaling. Overexpression of Rab23 indicated that it facilitated the expression of Pax7 and Pax3 in the neural tube and suppressed ventral genes like Nkx6.1 cell autonomously, however, it did not disturb neuronal patterning. Interestingly, a thorough expression study of Rab 23 during chick early development revealed that Rab23 is already expressed very early and asymmetrically during gastrulation, suggesting a possible role of Rab23 on the left-right determination of Hensen’s node. In combination with the result that Rab23 is expressed in the notochord early in development, I assume that both Rab23 and Shh exist in all neural progenitor cells initially, and when their expression patterns separate gradually the neural cells adopt a ventral or dorsal fate according to their location along the dorsoventral axis. The avian embryo is a classic system used widely to investigate questions of vertebrate development. The easy and cheap accessibility of the embryo for in ovo or ex ovo experiments all around the year make it an ideal animal model to work with. The only recently developed method of over expressing genes in specific cells or regions in the chick embryo by electroporation enabled me to study different ways of gene suppression using this way of gene transfection. Thus, I compared the effect of long-hairpin and short hairpin dsRNA in different vectors and antisense morpholino oligonucleotides. The results revealed that all hairpin dsRNA constructs did reduce gene and protein expression often accompanied by morphological changes. Most efficiently were shRNAi constructs cloned into a siRNA-specific vector – pSilencer 1.0-U6. Gene silencing was already well observed 36 hours after transfection. In comparison antisense morpholino oligonucleotides did not show such big gene reduction as the shRNA in pSilencer. Taken together, this methodical research proposes that the shRNA in the pSilencer vector was a good and effective tool to reduce gene and protein expression locally. N2 - Das Mittelhirn des Huhns wird in funktionel unterschiedliche, ventrale und dorsale Regionen eingeteilt, nämlich das Tegmentum ventral und das optisches Tectum dorsal. Im vollentwickelten Tectum bilden Nervenzellen Schichten, während das Tegmentum aus unterschiedlichen Nuclei besteht. Ein charakteristisches Merkmal des embryonalen Gehirns ist die Entwicklung eines großen optischen Techtums, die am dritten embryonalen Tag (E3) sehr deutlich zu beobachten ist. Diese unterschiedliche funktionelle und morphologische Entwicklung des Mittelhirns deutet daraufhin, das die dorsoventrale Spezifikation des frühen Mittelhirns für der Organisation neuronaler Netzwerke im optischen Tectum und Tegmentum eine kritische Rolle spielt. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die regionale Bestimmung und Bildung zellulärer Unterschiede entlang der DV Achse des Mittelhirns untersucht. Dafür bestimmte ich den Zeitpunkt, an dem spezifische ventrale und dorsale Genexpressionsmuster festgelegt werden in isoliertem ventralen und dorsalen Gewebe in vivo and in vitro. Desweiteren untersuchte ich die Entwicklung unterschiedlicher adhäsiver Eigenschaften von ventralen und dorsalen Zellen in vitro. Explantatkulturen und Transplantationen von dorsalem Mittelhirn in eine ventrale Umgebung oder vice versa liessen eine schrittweise Zunahme der Autonomie der region-spezifischen Genregulation erkennen. Dies wurde von einer schrittweisen Zunahme des differentialen Adhäsionsverhaltens von ventralen und dorsalen Mittelhirnzellen von E2 zu E3 begleitet, der Zeitspanne, in der die Polarität der DV Achse festgelegt wurde. Diese Entwicklungsprozesse fanden u einem Zeitpunkt statt, an dem die meisten Zellen des Mittelhirns noch nicht differenziert hatten. Transplantationen,. von ventralen Mittelhirnzellen der Wachtel ins dorsale Hühnertecctum, die erst nach mehreren Tagen (6 - 9 Tage) untersucht wurden, zeigten das gleiche Ergebnis. Diese Ergebnisse lassen schliessen, dass eine partielle Regionalisierung des Mittelhirns in autonome Einheiten von Vorläuferzellen der dorsoventralen Achse stattfindet. Dies erlaubt den Zellen eine Positionsidentität zu bewahren – unhabhängig von der wachsenden Distanz zu Signalzentren. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich Gene, die das Wachstum und die spezifische Entwicklung des Tectums regulieren könnten. Die Arbeit konzentrierte sich speziell auf die Rolle von Pax7, ein Mitglied der sogenannten ‚pair-ruled’ Familie von Transkriptionsfaktoren, und auf die Rolle von Rab23, einer GTPase, die den Shh-Signalweg im dorsalen Neuralrohr inhibiert. Dieser Versuch zeigte, dass Pax7 an der Regulation der medio-lateral Ausdehnung des Tectums beteiligt ist. Überexpression von Pax7 im dorsalen Mittelhirn führte zu einer Vergrößerung des Tectums, die von einer Zunahme der Zellteilung begleitet wurde, während Knockdown von Pax7 eine Größereduktion des Tectums verursachte. Das neuronale Differenzierungsmuster im generellen wurde nicht von der Überexpression oder Repression von Pax7 gestört. Pax7 induzierte ausserdem Pax3, ein Mitglied derselben Familie, das ebenfalls dorsal exprimiert wird und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Pax7, sehr wahrscheinlich zusammen mit Pax3, die neural Zellproliferation im Mittelhirn in frühen Entwicklungsstadien fördert oder auf einem konstanten Level hält und dass die Muster der neuronalen Entwicklung nicht durch der Regulation der Größe dieser Region beeinflusst wird. Außerdem förderte Rab 23, das sehr wahrscheinlich ein negativer Regulator von Shh ist, die Expression von Pax7 und Pax3 im ventralen Mittelhirn und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Die Überexpression von Rab 23 beeinflusste auch nicht das neuronale Differenzierungsmusterung. Interessanterweise zeigte eine genaue Analyse der Expression von Rab 23 während der frühen Entwicklungsstadien des Huhns, dass Rab 23 bereits sehr früh und asymmetrisch während der Gastrulation exprimiert wurde. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von Rab 23 für die links-rechts Determination des Hensen´s node an. Betrachtet man diese Ergebnisse zusammen, dann könnte man zu fogender Schlussfolgerung kommen, nämlich, dass sowohl Rab 23 als auch Shh früh in allen neural Progenitorzellen existieren, und dass die neuralen Zellen jeweils nach ihrer Lage entlang der dorsoventral Achse ein ventrales oder dorsales Schicksal annehmen, wenn das sich die Expressionsmuster von Rab 23 und Shh allmänlich trennen. Der Vogelembryo ist ein klassisches und häufig benutztes System, um die Entwicklung der Vertebraten zu untersuchen. Die einfache und preiswerte Zugänglichkeit des Embryos für in ovo oder ex ovo Experiment das ganze Jahr über machen ihn zu einem idealen Tiermodell. Die in den letzten Jahren entwickelte Methode der Elektroporation eines Embryos zum Gentransfer in die Zellen, ermöglichte es mir unterschiedliche Weisen der Genunterdrückung in embryonalem Gewebe zu testen und zu vergleichen.Ich verglich in dieser Untersuchung die Wirkung von langen und kurzen Haarnadel-RNAs (hairpin RNA) in verschieden Vektoren mit der Wirkung von Antisense-morpholino-Oligonucleotiden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Haarnadel-dsRNA-Konstruktionen die Gen- und Proteinexpression reduzierten, wobei es häufig zu einer morphologischen Veränderung kam. Die kurze shRNAi-Konstruktionen, die in einen siRNA-spezifischen Vektor – pSilencer 1.0-U6 - geklont wurden war, zeigte sich dabei am effizientesten.. Die Herunterregulierung der Gene wurde bereits 36 Stunden nach der Transfektion beobachtet. Im Gegensatz dazu, zeigten die Antisense-Morpholino-Oligonucleotiden keine solche starke Reduktion wie das shRNA in pSilencer. Zusammenfassend zeigt diese methodische Untersuchung, dass die shRNA im pSilencer-Vektor ein gutes und effektives Werkzeug ist, um Gen- und Proteinexpression örtlich zu reduzieren. KW - Differenzierung KW - Embryo KW - Genexpression KW - Mittelhirn KW - Spezifikation KW - Dorso-ventral Patterning KW - Mesencephalon KW - Morpholino KW - Neuronal Proliferation KW - Pax3 KW - Pax7 KW - Rab23 KW - Shh KW - siRNA KW - Transplantation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32950 ER -