TY - THES A1 - Staib, Peter T1 - Analyse der Expression einer Virulenzgenfamilie von Candida albicans während der Infektion T1 - Analysis of the expression of a Candida albicans virulence gene family during infection N2 - Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können. N2 - The opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of many healthy people but can cause superficial infections as well as life-threatening deep organ mycoses in immunocompromised patients. Although the ability of C. albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, it is generally assumed that a number of virulence factors also contribute to the pathogenicity of C. albicans, thereby supporting colonization, distribution and multiplication of the fungal cells and allowing an adaption to various host niches. The production of secreted aspartic proteases (SAPs), encoded by a large family of homologous genes, plays an important role in C. albicans pathogenicity. It is likely that the individual proteases fullfill various functions during infection or are optimally adapted to different host niches. However, the contribution of single SAP genes to pathogenicity is not well understood. Because the host-induced activation of these virulence genes at a certain infection stage might give clues to their specific role in pathogenicity, an in vivo-expression technology (IVET) was developed in this work that allows the detection of gene activation in C. albicans during infection. The method is based on genetic recombination as a reporter of gene expression, resulting in the specific excision of a mycophenolic acid resistance marker from the genome by a site-specific recombinase after induction of the target gene. Because deletion of the marker represents an irreversible event that is inherited by the progeny of the corresponding cell, even a transient gene expression at a certain infection stage or in specific organs can be detected in single cells recovered from infected tissue by plating on appropriate indicator medium. The suitability of the reporter system for detecting a biologically meaningful gene activation in C. albicans was confirmed by analyzing expression of the SAP2 gene, which is induced in vitro during growth in a medium containing bovine serum albumin as the sole nitrogen source, but repressed in other commonly used laboratory media. IVET was then used to analyze the in vivo expression of six different SAP genes of C. albicans, SAP1-SAP6, in various animal models. It could be demonstrated that the individual protease genes are indeed differentially regulated, depending on the type of the infection, i.e. locally restricted mucosal infection or systemic infection, and the stage of an infection. Even the highly homologous SAP4-SAP6 genes, which from the results of in vitro experiments had been supposed to be hyphae-specific genes, were differentially regulated in vivo. SAP5 and SAP6, but not the other SAP genes, were significantly activated in a mouse model of oesophageal candidiasis when C. albicans hyphae invaded into the epithelium. A stage-specific expression of SAP genes was observed in a mouse model of Candida peritonitis. Soon after inoculation of C. albicans yeasts into the peritoneal cavity, before hyphae formation was observed, SAP5 but not SAP6 or any of the other SAP genes analyzed was activated in a significant part of the infecting cell population. Therefore, SAP5 seems to be important for tissue invasion during mucosal infection and also during the initial steps of a disseminated infection. By intravenous inoculation of C. albicans into mice, thereby bypassing the early infection stages, it was demonstrated that expression of SAP5 and SAP6, but also SAP4, continued into the later stages of a disseminated infection. In contrast, an induction of the SAP2 gene was observed predominantly in the late stages of a systemic infection, when the fungal cells had spread to deep organs. Hence, SAP2 presumably supports the multiplication of the fungal cells within the infected organs, perhaps by providing nutrient supply, rather than the invasion into host tissues. The in vivo regulation of SAP2 was shown to be influenced by certain repeat structures in the promotor region of this gene. In the C. albicans model strain CAI4 that was used in this study even the two SAP2 alleles, which differed in this repeat region, were differentially regulated during the course of a systemic infection, the SAP2-2 allele being induced at an earlier infection stage than the SAP2-1 allele. In contrast to the other SAP genes, expression of SAP1 and SAP3 could be detected in only few infecting cells, and a role in pathogenicity could not be attributed to these genes in the infection models used in this work. During the course of an infection C. albicans presumably employs many different virulence factors at the same time in order to achieve the best possible adaptation to the corresponding host niche. Yet, a question that has hardly been addressed but may enhance our understanding of the host-microbe interactions is whether different properties of the fungal cell are regulated in a coordinated fashion by specific host signals. At least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators CPH1 and EFG1, respectively, control hyphae formation in C. albicans. As dimorphic growth is important for infection and because expression of the genes SAP4-SAP6 is linked to the hyphal growth form in vitro, a possible dependence of hyphae-associated SAP gene expression on these regulators was analyzed by studying SAP5 expression in corresponding signal transduction mutants. SAP5 activation in vivo was reduced in cph1 as well as in efg1 single mutants. Therefore, both CPH1 and EFG1 contribute to SAP5 activation during infection. Since the cph1 mutant formed hyphae in infected tissue as efficiently as the wild-type strain, hyphae formation alone evidently was not sufficient for full SAP5 induction in vivo. On the other hand, induction of SAP5 in vivo did not depend on the hyphal growth form, because a reduced but still significant SAP5 expression was also detected in the efg1 mutant that grew only in the yeast form in the infected animals. In cells defective in both of the regulators an induction of SAP5 was hardly detectable. Therefore, these signalling pathways are important for the control of various cellular programs during infection and coordinate the expression of different virulence genes in C. albicans. The in vivo analysis of virulence gene expression of C. albicans provided insights into regulatory adaptation mechanisms of the pathogen in various host niches. The individual members of a virulence gene family of this fungus are differentially and stage-specifically regulated during infection and thus presumably contribute very specifically to pathogenesis. Moreover, various virulence traits can be regulated in a coordinated fashion during infection and in this way together support the adaptability of C. albicans to the host. Overall, these findings enhance our understanding of the pathogenicity of this important opportunistic fungal pathogen. KW - Candida albicans KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Pilzinfektionen KW - Virulenzmechanismen KW - Genregulation KW - Reportergene KW - In Vivo Expressionstechnologie KW - Proteasen KW - Candida albicans KW - fungal infections KW - virulence mechanisms KW - gene regulation KW - reporter genes KW - in vivo expression technology KW - Candida albicans Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179875 ER - TY - THES A1 - Spannaus, Ralf T1 - Regulation der foamyviralen Proteaseaktivität T1 - Regulation of the foamy viral Protease Activity N2 - Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation könnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschränktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2’ und P2 auf die Aminosäurereste Valin und Valin/Asparagin beschränkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschränkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollständige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivität-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollständige cDNA bilden können. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilität der wenigen Env-Trimere auf der Hüllmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molekül als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschränkten Env-Mobilität, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da für die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleinsäure benötigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Domänen für die Aktivierung der Protease benötigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivität resultierte, war die funktionelle RNaseH-Domäne essenziell für die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Domänen von anderen Retroviren resultierte in genomunabhängiger Proteaseaktivität in Zellen und genomabhängiger Proteaseaktivität in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden. N2 - Retroviral Pol and structural proteins are processed by the viral protease. Here, central mechanisms of the foamy viral protease regulation were investigated and characterized. For determination of the relative Pol and Env encapsidation a novel chromatographic purification method was developed. In comparison with human immunodeficiency viruses, foamy viruses encapsidate less Pol but significantly more Env. Foamy viruses might compensate these low Pol amount by limiting Gag and Pol processing to a single cleavage site. I sought to investigate, whether a limited cleavage site repertoire of foamy viral protease might be a consequence of this restriction. In cell culture positions P2’ and P2 within the cleavage sites are invariant and restricted to valine and valine/asparagine, supporting the conclusion that foamy viral protease cleavage at more specific sites than its human immunodeficiency viral counterpart. Secondly, I could show that complete foamy viral reverse transcription is dependent on Gag maturation, since viruses deficient in protease activity or with an inactive Gag cleavage site were incapable of producing cDNA beyond the first strong stop. Thus, low protease encapsidation is compensated by a delay of the reverse transcription until sufficient Gag maturation occurred. The human immunodeficiency viral Gag processing triggers the mobility of the few Env trimmers on the viral membrane. This Env clustering was shown to be essential for infectivity. Here, foamy viral Env was quantified and found that foamy viruses incorporate 28 times more Env per Gag molecule than the human immunodeficiency viruses. It seems to be likely that these higher Env amounts are required to compensate for the lack of Env mobility due to the restricted Gag processing at a single site at the carboxyl terminus. The dimerization and activation of the foamy viral protease depends on the binding of viral RNA and protein-protein interactions. Since the protease is active in the Pol and in the PRRT context the Pol domains essential for protease activity were mapped. While deletion of the integrase in context of recombinant viruses resulted in reduced protease activity further deletion of the RNase H domains abolished protease function. Substituting the RNase H domain with the RNase H of other retroviruses could restore protease activity even in the absence of viral RNA in cells , but not in viruses. Thus, the RNase H domains serve as protein-protein interaction domain or might dimerize the PRRT domains by binding to unspecific RNA. KW - Spumaviren KW - Proteasen KW - Regulation KW - Reverse Transkriptase KW - Enzymaktivierung KW - Protease KW - protease KW - Foamyviren KW - foamy viruses KW - Regulation KW - regulation KW - reverse Transkription KW - reverse transcription KW - Proteaseaktivität KW - protease activity Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113401 ER - TY - JOUR A1 - Shityakov, Sergey A1 - Dandekar, Thomas T1 - Lead expansion and virtual screening of Indinavir derivate HIV-1 protease inhibitors using pharmacophoric - shape similarity scoring function N2 - Indinavir (Crivaxan®) is a potent inhibitor of the HIV (human immunodeficiency virus) protease. This enzyme has an important role in viral replication and is considered to be very attractive target for new antiretroviral drugs. However, it becomes less effective due to highly resistant new viral strains of HIV, which have multiple mutations in their proteases. For this reason, we used a lead expansion method to create a new set of compounds with a new mode of action to protease binding site. 1300 compounds chemically diverse from the initial hit were generated and screened to determine their ability to interact with protease and establish their QSAR properties. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease binding ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is discussed in this report. KW - Proteasen KW - protease; Indinavir; lead expansion; docking; pharmacophore Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67824 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Rolf T1 - Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten T1 - Activation of caspases in AKR-2B mouse fibroblasts N2 - In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt. N2 - In the work presented here, the essential involvement of caspases in the cell death of AKR 2B-fibroblasts could be proved as well as their activities could be characterized. Confluent AKR 2B-fibroblasts, a good characterized and subcloned cell line, rapidly disintegrate after serum deprivation. Dying of the cells ceases after 6 hours with a survival of 50 per cent. These surviving cells remain uneffected for additional 48 hours which is dependent on neo-protein biosynthesis. During cell death AKR 2B-fibroblasts show morphological changes characteristically for apoptosis, even though typical features like oligonucleosomal DNA fragmentation is absent. Using different approaches the expression of mRNA of all known caspases, which are believed to be involved in apoptosis essentially, was successfully detected in AKR 2B-fibroblasts. Caspases-1, -2, -3, -6 and -9 were constitutively expressed as zymogens. With the exception of Caspase-9, the processing into their active subunits induced by serum removal could not be detected. At least their considerable importance during cell death of AKR cells could be proved by using specific caspase inhibitors and by determination of their specific activity. The characterization of that activity gave some hints for the identity of activated caspases. Beside constutive VEIDase and IETDase activities, a DEVDase reaches its maximum 3 hours after the onset of apoptosis. The present mixture of caspase activity is dominated by this DEVDase, which seems to be represented by just one enzyme, as shown by affinity labeling and 2D-SDS-PAGE. Determinations of KM- and Ki-values lead to the conclusion, that this enzyms has typical effector caspase characteristics, like caspase-3. Cleavage of lamins during cell death of the fibroblasts indicate that a caspase-6 became active. However, the known characteristics of caspase-6 are different of that found in AKR 2B cells, so that it may play just a minor role in the caspase mixture. Established repeated purification steps by chromatography, offers best conditions for protein sequencing and identification of the active caspase. The involvement of the receptor mediated pathway could be excluded by an overexpression of CrmA , a cowpox virus derived Caspase inhibitor; also there are no hints for an involvement of the mitochondria mediated pathway, except of caspase-9 cleavage. Pathways which lead to DEVDase activation are of major interests in present and future. Stimulation of signal pathways by PDGF-BB, TPA, Forskolin and 8Br-cAMP and others agents protect the fibroblasts from death. The stimulated pathways converge in one point up stream of effector-caspase activation. The identification of this point and its regulatory properties is a future goal, which will maybe lead to an understanding of processes responsible for surviving of 50 per cent of AKR 2B-Mausfibroblasten during serum removal. KW - Maus KW - Fibroblast KW - Apoptosis KW - Proteasen KW - AKR-2B Fibroblasten KW - Apoptose KW - Anisomycin KW - Caspase KW - Serumentzug KW - DEVDase KW - AKR-2B fibroblasts KW - apoptosis KW - anisomycin KW - caspase KW - serum deprivation KW - DEVDase Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950 ER - TY - THES A1 - Rupp, Ingrid T1 - Die Gametogenese des humanpathogenen Malariaerregers Plasmodium falciparum - eine Charakterisierung von daran beteiligten Proteasen sowie die Beschreibung und Funktionsanalyse von dabei auftretenden interzellulären Gametenfilamenten T1 - Gametogenesis of the human malaria pathogen Plasmodium falciparum - the characterization of involved proteases and a description and functional analysis of gamete intercellular filaments N2 - Malaria stellt mit einer Mortalität von über einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit für den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegenüber den verfügbaren Medikamenten erhöhen mehr denn je den Druck, neue Therapiemöglichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechmücke würde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers führen. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzuklären und neue Angriffspunkte für Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der männlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien benötigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivität von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-ähnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-ähnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen für den erfolgreichen Abschluss der männlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zusätzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 näher untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte für Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci für Rekombinationsereignisse zugänglich sind. Die Ergebnisse der übrigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 für Rekombinationsereignisse unzugänglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien für PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre mögliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubulären Zellausläufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausläufer der parasitären Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abständen von beulenartigen Auswölbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausläufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die Fähigkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adhärieren. Die Filamente waren bereits fünf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 % der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfläche verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechmücke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese für diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechmücke auftreten. Möglicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden. N2 - Malaria remains the deadliest among the tropical diseases with a death toll rate of more than one million people annually. Increasing resistance of the causative organism Plasmodium spec. against available drugs heightens the need for the development of new antimalarial drugs and a vaccine. The sexual reproduction phase of this pathogen has garnered increasing attention because of the potential to prevent the transmission of the parasite from human to mosquito by blocking fertilization and following essential processes in the vertebrate host. Therefore, the identification of molecular interactions during fertilization processes is essential to elucidate the sexual replication phase in order to develop new transmission blocking strategies. The genome of P. falciparum encodes for 92 putative proteases among them only few are partly characterized, although they are considered as excellent drug targets. The data herein defines the involvement of proteases belonging to various protease classes in the exflagellation of male gametes in P. falciparum. It was shown that this essential process of male gametogenesis can be blocked by use of different protease inhibitors. The data suggests an involvement of two or more serine proteases, falcipain-like cysteine proteases, non-thermolysin-like zinc metalloproteases and aspartic proteases in microgametocyte exflagellation. Furthermore, the described data defined the localization of the cysteine protease and falcipain-blocking inhibitor bADA. This inhibitor was shown to be localized in the cytosol of trophozoites, schizonts, gametocytes at all stages of maturity and macrogametes. Additionally, the present thesis achieved first evidence about six specifically selected and largely uncharacterized proteases calpain, DPAP2, GPI8, metacaspase 2, plasmepsin 6 and PfSub3. RT-PCR-Analyses were conducted to demonstrate the existence of transcript and consequently genetically active gene loci for mixed asexual parasites and for most of the gametocyte, gamete and zygote stages. The transformation of asexual parasites with metacaspase-2- and PfSub3-knockout-constructs led to the conclusion that these proteases are non-essential during the asexual replication cycle and their gene loci are accessible to homologous recombination. Additional transformation experiments indicated both that calpain is indispensable in the asexual replication cycle and that the gene locus for Plasmepsin 6 might be inaccessible for homologous recombination. The protein expression analysis for PfSub3 was carried out by using western blot and immunofluorescence assays. The analysis suggests that this serine protease is expressed in asexual parasites as well as in non-activated and activated gametocytes. Based on the data described herein, both the morphologic description of newly discovered filaments of gametes emerging during gametogenesis and the assignment of their putative function was possible. Using immunofluorescence analysis, scanning electron microscopy and live imaging analysis of gametes it was shown that these tubular filaments are about 200 nm in diameter and exhibit a length of up to 180 µm. Furthermore, it was demonstrated that they are close-ended, actin-associated and cytoplasm-containing cell extensions of the parasite’s plasma membrane with a branched or straight appearance. The surface of filaments was associated with bulge-like structures and appeared in scanning electron microscopy partly as a beaded structure. Additionally, it was demonstrated that the sexual stage surface proteins Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 and PfCCp4 are connected with these cell extensions, whereby the lack of single proteins did not result in a complete blockade of filament formation. The most typical feature of the filaments was described: to connect several macrogametes and even gametocytes within a cell cluster. It was defined that up to nine filaments emerged from the surface of macrogametes, which were able to adhere to non-infected erythrocytes as well as to parasite-infected erythrocytes. Analysis of their formation revealed that the filaments are formed within five minutes after gametocyte activation and are able to persist on the surface of gametes for a time period of up to 12 hours. During gametogenesis, 33 to more than 70 % of macrogametes exhibited the described filaments. It was possible to demonstrate the active retraction of a filament formed by a macrogamete as well as the generation of a filament in the mosquito midgut. Due to these findings a putative function was assigned. Thus, it can be suggested that the filaments likely form during gametogenesis in the mosquito midgut due to their adhesive properties in order to locate and collect other sexual stages. It might be possible that the filaments are used as a tool of vital gametes to enhance fertilization in the vertebrate host. KW - Plasmodium falciparum KW - Gametogenese KW - Proteasen KW - Serinprotease KW - Aspartatprotease KW - Metalloprotease KW - Proteaseinhibitor KW - Nanotubes KW - Zellfilamente KW - Malaria tropica KW - Malaria KW - Cysteinproteasen KW - serine protease KW - aspartic protease KW - metallo protease KW - protease inhibitor KW - nanotubes KW - cell filaments Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47830 ER - TY - THES A1 - Lermann, Ulrich T1 - Molekulare Untersuchungen zur Regulation und Funktion der sekretierten Aspartatproteasen von Candida albicans T1 - Molecular investigations on regulation and function of secreted aspartic proteases of Candida albicans N2 - Die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps) des Hefepilzes Candida albicans gelten als wichtiger Virulenzfaktor dieses opportunistischen Krankheitserregers. Die zehn Sap-Isoenzyme werden von einer Genfamilie codiert, deren Vertreter (SAP1-SAP10) in der Vergangenheit bereits intensiv untersucht wurden. SAP-Expressionsanalysen und die Charakterisierung von sap-Deletionmutanten, die in einem auxotrophen Laborstamm hergestellt wurden, führten aber zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen, weshalb die Rolle der einzelnen Proteine bis heute nicht zweifelsfrei aufgeklärt ist. Eine differentielle Expression der SAP-Gene in unterschiedlichen Stadien einer Infektion wurde jedoch in vielen unabhängigen Studien gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Expression der Gene SAP1-SAP6 in einem etablierten in vitro-Modell einer Candida-Vaginitis untersucht, das auf der Infektion von rekonstituiertem humanem Epithel (RHE) basiert. Dazu wurden Reporterstämme verwendet, die bereits früher für Expressionsanalysen in verschiedenen in vivo-Infektionsmodellen in Mäusen eingesetzt worden waren. Dies erlaubte es einerseits unterschiedliche Nachweismethoden zur SAP-Genexpression in einem standardisierten Modell zu vergleichen und andererseits das Expressionsmuster der SAP-Gene in einem in vitro-Infektionsmodell mit den Ergebnissen von in vivo-Infektionsexperimenten zu korrelieren. Es zeigte sich in Übereinstimmung mit Ergebnissen früherer in vivo-Experimente in Mäusen, dass bei der Infektion des vaginalen Gewebes vor allem das SAP5-Gen induziert wurde. Allerdings weicht dieses Ergebnis deutlich von Ergebnissen anderer Studien ab, die mit Hilfe anderer Methoden ein ungleiches Muster der SAP-Expression detektierten. Um die Rolle der Gene SAP1-SAP6 bei der Infektion genauer zu untersuchen, wurden deshalb Mutanten hergestellt, in denen einzelne oder mehrere SAP-Gene mit Hilfe einer neuartigen Mutagenesestrategie erstmals aus dem Genom eines wildtypischen C. albicans-Stammes deletiert wurden. Überraschenderweise konnte sowohl in Einzelmutanten der Gene SAP1-SAP6 als auch in sap1 sap2 sap3- und sap4 sap5 sap6-Triplemutanten keine verminderte Fähigkeit zur Invasion und Schädigung von humanem Gewebe in RHE festgestellt werden. Eine in früheren Arbeiten beschriebene abgeschwächte Virulenz solcher Mutanten konnte auch in einem murinen Modell für eine disseminierende Infektion nicht beobachtet werden. Die Sekretion von Aspartatproteasen ermöglicht es C. albicans Proteine als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden. Unter diesen Bedingungen wird spezifisch die Expression des SAP2-Gens induziert; jedoch ist über die Mechanismen dieser Regulation noch wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Promotor-Deletionsanalysen des SAP2-Gens und des mit diesem co-regulierten Oligopeptidtransportergens OPT1 durchgeführt. Es zeigte sich, dass unterschiedliche Bereiche innerhalb der 3,5 kb großen regulatorischen Region von SAP2 gemeinsam eine Expression dieses Gens unter induzierenden Bedingungen ermöglichen. Für das OPT1-Gen konnte eine regulatorische Region eingegrenzt werden, die für die Expression dieses Gens essentiell ist. In den für die Expression von SAP2 und OPT1 wichtigen Regionen wurden ähnliche Sequenzen gefunden, die als Bindungsstellen für regulatorische Faktoren dienen könnten. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur Regulation und Bedeutung der sekretierten Aspartatproteasen von C. albicans erhalten. Um eine endgültige Bewertung der Rolle dieser Enzyme in der Virulenz des Erregers zu ermöglichen, sind jedoch noch weitere detaillierte Studien unter Verwendung verschiedenster Infektionsmodelle nötig. N2 - The secreted aspartic proteases (Saps) of the yeast Candida albicans are considered as an important virulence trait of this opportunistic pathogen. The ten Sap isoenzymes are encoded by a gene family, whose members (SAP1-SAP10) have been analysed intensively already in the past. However, the analysis of the expression pattern of the SAP genes and the characterisation of sap deletion mutants, which were generated from an auxotrophic laboratory strain, yielded partially contradictory results. Therefore, the role of the individual proteins is still not fully elucidated. A differential expression of the SAP genes in various stages of an infection has been demonstrated in many independent studies. In the present work the expression of the SAP1-SAP6 genes was analyzed in an established in vitro model of vaginal candidiasis that is based on the infection of reconstituted human epithelium (RHE). For this purpose, reporter strains were used which had already been utilized previously to study the SAP expression pattern in various in vivo infection models in mice. This allowed the comparison of different detection methods for SAP gene expression in a standardized model and also to correlate the SAP expression pattern in an in vitro infection model with the results of in vivo infection experiments. It was found that SAP5 was the predominantly expressed SAP gene during infection of the vaginal tissue, in agreement with the results of previous in vivo experiments in mice. However, this result contrasts with those of other studies that, using alternative methods, detected a different SAP expression pattern. To investigate the role of the SAP1-SAP6 genes during infection in more detail, a new set of mutants was generated, in which single or multiple SAP genes were deleted for the first time from the genome of a C. albicans wild-type strain with the help of a novel mutagenesis strategy. Surprisingly, neither single mutants lacking one the SAP1-SAP6 genes nor triple mutants lacking all of the SAP1-SAP3 or the SAP4-SAP6 genes exhibited a detectable defect in invasion and damage of reconstituted human epithelium. A previously reported attenuated virulence of sap mutants was also not observed in a murine model of disseminated candidiasis. The secretion of aspartic proteases enables C. albicans to utilize proteins as a sole source of nitrogen for growth. Under these conditions expression of the SAP2 gene is specifically induced, however, little is known about the mechanisms of this regulation. Therefore, promoter deletion analyses of the SAP2 gene and the co-regulated oligopeptide transporter gene OPT1 were performed in the present work. It was found that different regions within the approximately 3,5 kb large SAP2 promoter jointly allowed the expression of this gene under inducing conditions. For OPT1, a region could be delimited that is essential for the expression of this gene. The regions that were found to be important for SAP2 and OPT1 expression contain similar sequences, which may serve as binding sites for regulatory factors. This study provides new insights into the regulation and importance of the secreted aspartic proteases of C. albicans. For a definite evaluation of the role of these enzymes in the virulence of the pathogen, however, further detailed studies that employ a variety of different infection models are necessary. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Proteasen KW - Virulenzfaktor KW - Mykose KW - secreted aspartic proteases KW - candida albicans KW - virulence factor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29168 ER - TY - THES A1 - Kuß, Andreas T1 - Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus T1 - Investigations concerning the CD40 induced expression of A1 in murine B lymphocytes N2 - Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung. N2 - Engagement of the antigen receptor on murine immature B lymphocytes leads to growth arrest followed by apoptosis. Concomitant signalling through CD40 rescues the cells from apoptosis and sustains proliferation. It is shown here, that in primary murine B cells crosslinking of CD40 stimulates the expression of A1, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family. CD40 dependent stimulation of A1 was confirmed in WEHI 231 cells, an immature B cell lymphoma line. WEHI 231 cells were transduced with A1 and a chimeric selection marker comprising the enhanced yellow fluorescent protein and the zeocin resistance protein via recombinant replicationdefective retroviruses. Expression of A1 and marker proteins was coupled through an internal ribosomal entry site. A1 transduced WEHI 231 cells showed a significantly enhanced survival rate after engagement of the antigen receptor whereas constitutive expression of A1 did not abrogate c-myc downregulation and activity-loss of a NFkB-dependent luciferase reporter, both of which were induced by BCR-crosslinking. Expression of inducible cMyc-ER in A1 transduced cells did not restore proliferation in these populations. In contrast, upon induction cMyc-ER itself caused growth arrest and apoptosis of these cells despite the presence of A1. Studies of functional properties of A1 revealed that it was able to suppress BCR-induced degradation of the caspase substrate PARP as well as activation of Caspase 7. The generation of reactive oxigen species, a further consequence of BCR signalling, was also significantly reduced by A1. Taken together these result suggest that upstream of A1 the CD40 signal is divided into two major components, one of which is responsible for the upkeep of proliferation whereas the other secures cell survival. It seems that for the latter A1 is of major importance. KW - Apoptosis KW - B-Lymphozyt KW - Proteasen KW - CD40 KW - Bcl-2 KW - Unreife B-Zelle KW - Apoptose KW - Wachstumsstopp KW - Caspasen KW - CD40 KW - bcl-2 KW - Immature B cell KW - Apoptosis KW - Growth Arrest KW - Caspases Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669 ER - TY - THES A1 - Hegyi, Annette T1 - Charakterisierung der Substratspezifität coronaviraler 3C-like-Proteasen T1 - Characterization of the substrate specifity of coronaviral 3C-like proteases N2 - Coronaviren sind mit einer Genomgröße von 27-32 kb die größten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und führen zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie führt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schlüsselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmoleküle für die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst fünf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Domäne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivität gegenüber synthetischen Peptiden und konnten somit für die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repräsentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die über Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. Übereinstimmend konnte für die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine frühzeitige (möglicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge hätte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repräsentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen überaus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage für die Entwicklung eines für Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay für Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verfügbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und könnte in modifizierter Form auch für andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays für ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie für die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. Für das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufklärung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifität. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit für die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften führten, die gute Voraussetzungen für eine röntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen. N2 - With genome sizes between 27,000 and 31,000 nucleotides, coronaviruses are the largest RNA viruses known to date. They infect a broad range of vertebrates and cause considerable economic losses in animal breeding. Proteolytic processing of large polyprotein precursors generates the individual functional subunits of the replication complex and thus represents a central regulatory mechanism in the replication cycle of coronaviruses. In this process, the coronavirus 3C-like proteases play a key role and, for this reason, they represent ideal targets for the design of inhibitors to control coronavirus infections. To develop effective and selective enzyme inhibitors, a comprehensive biochemical and structural characterization of the 3C-like protease (3CLpro) is required. In this study, the substrate specificities of coronaviral 3C-like proteases were characterized in vitro. To this end, five different 3C-like proteases (from FIPV, TGEV, HCoV-229E, MHV und IBV) were recombinantly expressed as fusion proteins with the Escherichia coli maltose-binding protein. The complete coding region of the FIPV 3C-like protease was cloned and sequenced for the first time. Upon comparison of the deduced amino acid sequence with the replicase polyprotein sequences of other coronaviruses a close phylogenetic relationship between FIPV and TGEV was revealed. The MBP-3C-like protease fusion proteins were purified by affinity chromatography and the authentic 3C-like proteases were released from the fusion protein by factor Xa cleavage. All recombinant proteases were shown to be active in synthetic peptide-based trans-cleavage assays and, thus, they were suitable for further biochemical characterization. Competition experiments using the purified 3C-like proteases of HCoV, TGEV and MHV, respectively, and peptide substrates representing pp1a/pp1ab cleavage sites revealed a specific ranking of cleavage sites. This ranking proved to be conserved among coronaviruses. The data consistently showed that the sites which flank the 3C-like proteases are most effectively cleaved. It thus seems reasonable to conclude that the release of 3CLpro from the viral polyprotein may be an early, possibly cotranslational step in the pp1a/pp1ab processing pathway. If this hypothesis is correct, most 3CLpro-mediated cleavages would occur in trans. Interestingly, the peptide substrate containing the aminoterminal HCoV 3CLpro cleavage site was cleaved very efficiently by all the coronaviral 3C-like proteases tested in this study. Therefore, the sequence of this peptide was used to develop a universally applicable, sensitive fluorometric assay suitable for the characterization of coronavirus 3C-like proteases and the identification and evaluation of inhibitors. This peptide-based fluorogenic assay not only significantly extends the spectrum of analytical methods in the characterization of coronavirus 3C-like proteases but, in a modified form, could also be applied for other viral proteases. The initial characterization of this novel assay using class-specific protease inhibitors demonstrated its suitability for high-throughput screening (HTS) applications which are widely used in the pharmaceutical industry to identify inhibitory lead compounds from large compound libraries generated by combinatorial chemistry. Structural information is essential for the rational design of 3CLpro-specific inhibitors. In this respect, the elucidation of the structural basis for subrate recognition is of particular interest. In an attempt to identify coronaviral 3C-like proteases with favourable crystallization properties, protocols for the purification of the FIPV and TGEV 3C-like proteases were developed in this study. The established methods proved to be suitable to produce large amounts of highly purified enzymes with significantly improved crystallization properties and thus provide a good basis for structure analyses by X-ray crystallography. KW - Coronaviren KW - Proteasen KW - Substratspezifität KW - Coronavirale Hauptprotease KW - 3C-like-Protease KW - Substratspezifität KW - Coronaviral main protease KW - 3C-like protease KW - substrate specifity Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-271 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Nico T1 - Regulation of virulence-associated traits of the human fungal pathogen Candida albicans by nitrogen availability T1 - Regulation Virulenz-assoziierter Faktoren im humanpathogenen Pilz Candida albicans durch Stickstoffverfügbarkeit N2 - Nitrogen-regulated pathogenesis describes the expression of virulence attributes as direct response to the quantity and quality of an available nitrogen source. As consequence of nitrogen availability, the opportunistic human fungal pathogen Candida albicans changes its morphology and secretes aspartic proteases [SAPs], both well characterized virulence attributes. C. albicans, contrarily to its normally non-pathogenic relative Saccharomyces cerevisiae, is able to utilize proteins, which are considered as abundant and important nitrogen source within the human host. To assimilate complex proteinaceous matter, extracellular proteolysis is followed by uptake of the degradation products through dedicated peptide transporters (di-/tripeptide transporters [PTRs] and oligopeptide transporters [OPTs]). The expression of both traits is transcriptionally controlled by Stp1 - the global regulator of protein utilization - in C. albicans. The aim of the present study was to elucidate the regulation of virulence attributes of the pathogenic fungus C. albicans by nitrogen availability in more detail. Within a genome wide binding profile of Stp1, during growth with proteins, more than 600 Stp1 target genes were identified, thereby confirming its role in the usage of proteins, but also other nitrogenous compounds as nitrogen source. Moreover, the revealed targets suggest an involvement of Stp1 in the general adaption to nutrient availability as well as in the environmental stress response. With the focus on protein utilization and nitrogen-regulated pathogenesis, the regulation of the major secreted aspartic protease Sap2 - additionally one of the prime examples of allelic heterogeneity in C. albicans - was investigated in detail. Thereby, the heterogezygous SAP2 promoter helped to identify an unintended genomic alteration as the true cause of a growth defect of a C. albicans mutant. Additionally, the promoter region, which was responsible for the differential activation of the SAP2 alleles, was delimited. Furthermore, general Sap2 induction was demonstrated to be mediated by distinct cis-acting elements that are required for a high or a low activity of SAP2 expression. For the utilization of proteins as nitrogen source it is also crucial to take up the peptides that are produced by extracellular proteolysis. Therefore, the function and importance of specific peptide transporters was investigated in C. albicans mutants, unable to use peptides as nitrogen source (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ septuple null mutants). The overexpression of individual transporters in these mutants revealed differential substrate specificities and expanded the specificity of the OPTs to dipeptides, a completely new facet of these transporters. The peptide-uptake deficient mutants were further used to elucidate, whether indeed proteins and peptides are an important in vivo nitrogen source for C. albicans. It was found that during competitive colonization of the mouse intestine these mutants exhibited wild-type fitness, indicating that neither proteins nor peptides are primary nitrogen sources required to efficiently support growth of C. albicans in the mouse gut. Adequate availability of the preferred nitrogen source ammonium represses the utilization of proteins and other alternative nitrogen sources, but also the expression of virulence attributes, like Sap secretion and nitrogen-starvation induced filamentation. In order to discriminate, whether ammonium availability is externally sensed or determined inside the cell by C. albicans, the response to exterior ammonium concentrations of ammonium-uptake deficient mutants (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ null mutants) was investigated. This study showed that presence of an otherwise suppressing ammonium concentration did not inhibit Sap2 proteases secretion and arginine-induced filamentation in these mutants. Conclusively, ammonium availability is primarily determined inside the cell in order to control the expression of virulence traits. In sum, the present work contributes to the current understanding of how C. albicans regulates expression of virulence-associated traits in response to the presence of available nitrogen sources - especially proteins and peptides - in order to adapt its lifestyle within a human host. N2 - Stickstoffregulierte Pathogenität bezeichnet die Kontrolle von Virulenz-assoziierten Eigenschaften als direkte Folge der verfügbaren Quantität und Qualität einer Stickstoffquelle. Im Zusammenhang mit der Stickstoffverfügbarkeit verändert der opportunistisch krankheitserregende Pilz Candida albicans seine Morphologie und sekretiert Aspartat-Proteasen [SAPs], beides gut charakterisierte Virulenzattribute. Im Gegensatz zu seinem normalerweise apathogenen Verwandten Saccharomyces cerevisiae ist C. albicans in der Lage Proteine zu verwerten, welche als sehr häufige und wichtige Stickstoffquelle im menschlichen Wirt angesehen werden. Zur Nutzung von Proteinen sekretiert C. albicans Aspartat-Proteasen für den außerzellulären Verdau der Proteine und exprimiert Peptidtransporter (Di- /Tripeptidtransporter [PTRs] und Oligopeptidtransporter [OPTs]) um die Abbauprodukte aufzunehmen. Beide Eigenschaften werden transkriptionell von Stp1 - dem globalen Regulator zur Verwertung von Proteinen - kontrolliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation von Virulenzattributen im pathogenen Pilz C. albicans durch die Verfügbarkeit von Stickstoff genauer zu untersuchen. Innerhalb einer genomweiten Bindestudie von Stp1 wurden mehr als 600 Stp1-Zielgene während des Wachstums mit Proteinen identifiziert. Dadurch bestätigte sich die Funktion von Stp1 in der Proteinverwertung und wurde zudem auch auf die allgemeine Verwertung von Stickstoffquellen erweitert. Des Weiteren deuten die aufgedeckten Zielgene an, dass Stp1 womöglich in der Adaption an die generelle Nährstoffverfügbarkeit sowie in der Antwort auf Stresssignale beteiligt ist. Mit dem Fokus auf die Proteinverwertung und stickstoffregulierter Pathogenität wurde die Regulation der wichtigsten sekretierten Protease Sap2 - welche außerdem ein Paradebeispiel für allelische Heterogenität ist - im Detail untersucht. Dabei half der heterogene SAP2-Promoter bei der Identifizierung einer unbeabsichtigten genomischen Veränderung als wahren Grund eines Wachstumsdefektes einer C. albicans Mutante. Zusätzlich wurde der Promotorbereich eingegrenzt, welcher für die unterschiedliche Aktivierung der beiden SAP2 Allele verantwortlich ist. Weiterhin wurden verschiedene cis-aktive Elemente identifiziert, die entweder für eine hohe oder eine niedrige SAP2 Expression benötigt werden. Die Aufnahme von Peptiden, die durch den außerzellulären Verdau entstehen, ist für die Verwertung von Proteinen ebenso wichtig. Deshalb wurde die Funktion und Bedeutung der spezifischen Peptidtransporter anhand von C. albicans Mutanten untersucht, welche Peptide nicht aufnehmen können (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ Septuplemutanten). Die Überexpression von individuellen Transportern in diesen Septuplemutanten offenbarte unterschiedliche Substratspezifitäten und erweiterte die Spezifität für die OPTs auf Dipeptide, eine komplett neue Facette dieser Transporter. Des Weiteren ermöglichten die Septuplemutanten eine Aufklärung, ob Proteine und Peptide tatsächlich eine wichtige In Vivo Stickstoffquelle für C. albicans sind. Dieses Arbeit zeigte, dass während der kompetitiven Kolonisierung des Mäusedarms die Septuplemutanten wildtypische Fitness aufwiesen. Dies deutet daraufhin, dass weder Proteine noch Peptide eine wichtige Stickstoffquelle für ein effizientes Wachstum in diesem In Vivo Model sind. Die ausreichende Verfügbarkeit der bevorzugten Stickstoffquelle Ammonium unterdrückt die Verwertung von Proteinen und anderen alternativen Stickstoffquellen. Aber auch die Expression von Virulenzattributen, wie die Proteasesekretion und die stickstoffmangel-induzierte Filamentierung, wird durch Ammonium inhibiert. Um zu unterscheiden, ob C. albicans die Ammoniumverfügbarkeit außerzellulär oder in der Zelle bestimmt, wurde das Verhalten auf außerzelluläre Ammoniumkonzentrationen in Mutanten untersucht, welche Ammonium nicht aufnehmen können (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ Mutanten). Diese Arbeit zeigte, dass in diesen Mutanten eine ansonsten inhibierende Ammoniumkonzentration nicht in der Lage war, die Sekretion der Sap2-Protease oder die Arginin-induzierte Hyphenbildung zu unterdrücken. Folglich wird, um die Expression von Virulenzattributen zu regulieren, die Ammoniumverfügbarkeit vorrangig in der Zelle bestimmt. Zusammenfassend erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis zur Regulation der Expression von Virulenzattributen durch die Verfügbarkeit von Stickstoffquellen - insbesondere Proteine und Peptide - die eine Anpassung von C. albicans an ein Leben im menschlichen Wirt ermöglichen. KW - Candida albicans KW - Regulation KW - Stickstoff KW - Virulenz KW - Proteasen KW - Nitrogen KW - SAP2 KW - STP1 KW - peptide KW - transport KW - ammonium KW - protease KW - Proteine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83076 ER - TY - THES A1 - Dodt, Katharina Anna T1 - Monitoring enzyme activity by using mass-encoded peptides and multiplexed detection T1 - Überwachung von Enzymaktivität durch die Benutzung von massencodierten Peptiden und multiplexer Detektion N2 - Cell culture models are helpful tools to study inflammatory diseases, like rheumatoid arthritis (RA), osteoarthritis (OA), arteriosclerosis or asthma, which are linked to increased matrix metalloproteinase (MMP) activity. Such cell culture models often focus on the secretion of cytokines and growth factors or the direct effects of disease on tissue destruction. Even though the crucial role of MMPs in inflammatory diseases is known, the results of MMP studies are contradictious and the use of MMPs as biomarkers is inconsistent. MMPs play an important role in disease pathology, as they are involved in elastin degradation in the walls of alveoli in chronic obstructive pulmonary disease (COPD), tumor angiogenesis and metastasis and in cartilage and bone degradation in arthropathies. In RA and OA MMPs are secreted by osteocytes, synoviocytes, and by infiltrating immune cells in response to the increased concentration of inflammatory mediators, like growth factors and cytokines. MMPs are zinc and calcium-dependent proteinases and play an important role in physiological and pathological extracellular matrix (ECM) turn over. Their substrate specificity gives them the ability to degrade all major ECM components, like aggrecan, elastin, gelatin, fibronectin and all types of collagen even the triple helix of collagen monomers. The ECM consists of two large three-dimensional cross-linked macromolecule classes: one are fibrous proteins, like collagen and elastin fibers that are responsible for ECM’s structure, tensile strength, resiliency, reversible extensibility, and deformability and the second class is comprised of proteoglycans composed of glycosaminoglycan (GAG) chains covalently attached to protein cores that are multifunctionally involved in signaling pathways and cell interactions. ECM is present within all tissues and organs and changes in ECM structure contribute to pathogenesis, e.g. wounded and fibrotic tissue, COPD or tumours. This thesis primarily focuses on the development of a diagnostic peptide system, that enables to gain information on MMP activity from ECM by deploying the isobaric mass encoding strategy. The core element of the developed system is an isotopically labelled peptide sequence (mass tag), that is released in response to elevated levels of MMPs and allows multiplexed detection in tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The mass reporters possess a modular structure with different functionalities. C-terminal either a transglutaminase (TG) recognition sequence or a high molecular weight polyethylene glycol (PEG) moiety was attached to immobilize the mass reporters covalently or physically at the injection site. The following matrix metalloproteinase substrate sequence (MSS) is incorporated in two different versions with different sensitivity to MMPs. The MSS were applied in pairs for relative quantification consisting of the cleavable version synthesized with natural L-amino acids and the non-cleavable D-amino acid variant. The mass tag was synthesized with isotopically labelled amino acids and is separated from the MSS by a UV light-sensitive molecule. N-terminal the mass tag is followed by a tobacco etch virus protease (TEV) sensitive sequence, that is responsible to separate the mass tag from the affinity tag, which was either the Strep-tag II sequence or biotin and were added for purification purposes. Chapter 1 presents a step-by-step protocol on how to design a mass tag family allowing for multiplexed analysis by LC-MS/MS. The multiplexing is achieved by developing an isobar mass tag family with four family members, which are chromatographically indistinguishable, but due to the mass encoding principles they fragment in distinct y-type ions with a mass difference of 1 or 2 Da each in MS2. Furthermore, it is explained how to covalently attach the mass reporter peptides onto ECM by the activated calcium-catalyzed blood coagulation transglutaminase factor XIII (FXIIIa). The lysine of mass reporter’s TG sequence (D-domain of insulin-like growth factor-I (IGF-I)) and a glutamine in fibronectin are covalently crosslinked by FXIIIa and build an isopeptide bond. Elevated levels of MMP release the mass reporters from ECM by recognizing the inter-positioned MSS. The designed mass reporters were able to monitor enzyme activity in an in vitro setting with cell-derived ECM, which was shown in Chapter 2. The modular structured mass reporters were investigated in a proof of concept study. First, the different modules were characterized in terms of their MMP responsiveness and their sensitivity to TEV protease and UV light. Then the FXIIIa-mediated coupling reaction was detailed and the successful coupling on ECM was visualized by an immunosorbent assay or confocal laser scanning microscopy. Finally, the immobilized mass reporters on ECM were incubated with MMP-9 to investigate their multiplexing ability of MMP activity. The cleaved mass reporter fragments were purified in three steps and mass tags were analyzed as mix of all four in LC-MS/MS. Chapter 3 describes the change from an immobilizing system as seen in chapter 1 and 2 to a soluble enzyme activity monitoring system that was applied in an osteoarthritic mouse model. Instead of the immobilizing TG sequence the C-terminal MMS was extended with two amino acids where one holds an azide moiety to perform a strain-promoted azide-alkyne cycloaddition to a high molecular weight dibenzocyclooctyne-polyethylene glycol (DBCO-PEG), which was chosen to retain the mass reporters at the injection site. Furthermore, the N-terminal affinity tag was extended with a 2.5 kDa PEG chain to increase the half-life of the mass reporter peptides after MMP release. The systems biocompatibility was proved but its enzyme monitoring ability in an in vivo setting could not be analyzed as samples degraded during shipping resulting from the Chinese customs blocking transport to Germany. In summary the diagnostic peptide system was developed in two variants. The immobilized version one from chapter 1 and 2 was designed to be covalently attached to ECM by the transglutaminase-mediated cross-linking reaction. In an in vitro setting the functionality of the mass reporter system for the detection of MMP activity was successfully verified. The second variant comprises of a soluble mass reporter system that was tested in an OA mouse model and showed biocompatibility. With these two designed systems this thesis provides a flexible platform based on multiplexed analysis with mass-encoded peptides to characterize cell culture models regarding their MMP activity, to deploy cell-derived ECM as endogenous depot scaffold and to develop a mass tag family that enables simultaneous detection of at least four mass tags. N2 - Zellkulturmodelle sind hilfreiche Werkzeuge, um entzündliche Krankheiten, wie rheumatoide Arthritis (RA), Osteoarthritis (OA), Arteriosklerose und Asthma, die mit einer erhöhten Aktivität von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) verbunden sind, zu untersuchen. Viele Zellkulturmodelle fokussieren sich hauptsächlich auf die Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren oder die direkten Effekte der Entzündung auf die Gewebezerstörung. Obwohl die zentrale Rolle der MMPs in entzündlichen Erkrankungen bekannt ist, wird die Untersuchung von MMPs in diesen Zellkulturmodellen vernachlässigt. MMPs spielen eine wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung, da sie am Abbau von Elastin in den Wänden der Alveolen bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), an der Gefäßneubildung und Metastasenbildung von Tumoren und an Knorpelabbau und Knochenzerstörung in Gelenkerkrankungen beteiligt sind. In RA und OA werden MMPs von Osteozyten, Synoviozyten und infiltrierenden Immunzellen als Antwort auf erhöhte Konzentrationen an entzündlichen Mediatoren, wie Wachstumsfaktoren und Zytokinen, sekretiert. MMPs sind Zink- und Calcium-abhängige Proteinasen, die eine wichtige Rolle beim physiologischen und pathologischen Turnover der extrazellulären Matrix (EZM) spielen. Ihre Substratspezifität verleiht ihnen die Fähigkeit alle Hauptkomponenten der EZM, wie Aggrecan, Elastin, Gelatin, Fibronectin und alle Typen des Kollagens, sogar die dreifach-Helix der Kollagenmonomere, abzubauen. Die EZM besteht aus zwei großen, drei-dimensional vernetzten Makromolekülklassen: zu der ersten Klasse zählen die faserigen Proteine, wie Kollagen- und Elastinfasern, die für die Struktur der EZM, ihre Zugfestigkeit, Elastizität, reversible Dehnbar- und Verformbarkeit verantwortlich sind und zur zweiten Klasse gehören die Proteoglykane, die aus Glykosaminoglykanketten (GAG), die kovalent an Kernproteine gebunden sind, bestehen und zusammen multifunktional in Signalwege und Zellinteraktionen involviert sind. Jedes Gewebe und Organ ist mit EZM ausgekleidet und Änderungen in der EZM Struktur können zur Krankheitsentstehung beitragen, z.B. bei verletztem und fibrotischem Gewebe, COPD oder Tumoren. Diese Promotion fokussiert sich primär auf die Entwicklung eines diagnostischen Peptidsystem, das es ermöglicht durch die Anwendung der isobaren massencodierten Strategie Informationen über MMP Aktivität der EZM zu gewinnen. Eine isotopenmarkierte Peptidsequenz stellt dabei das Kernelement des entwickelten Systems dar, welche als Antwort auf erhöhte MMP Level von der EZM freigegeben wird und eine gebündelte Detektion per Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) erlaubt. Die Massenreporter besitzen einen modularen Aufbau mit unterschiedlichen Funktionalitäten. Am C-terminalen Ende wurde entweder eine Transglutaminase (TG) Erkennungssequenz oder eine hochmolekulare Polyethylenglykol (PEG) Einheit angehängt, um die Massenreporter kovalent oder physikalische am Applikationsort zu immobilisieren. Die darauffolgende eingeschobene Matrixmetalloproteinase Substratsequenz (MSS) wurde in zwei verschiedenen Versionen mit unterschiedlicher MMP Sensitivität angewendet. Die MSSs werden für die relative Quantifizierung jeweils in Paaren verwendet, wobei die spaltbare Variante mit natürlichen L-Aminosäuren synthetisiert wird und die nicht-spaltbare Sequenz mit D-Aminosäuren. Der Mass tag wird mit isotopenmarkierten Aminosäuren versehen und ist von dem MSS durch ein lichtsensitives Molekül getrennt. N-terminal des Mass tags folgt die TEV Protease-sensitive Peptidsequenz, die zur Abspaltung des Affinitäts-tags vom Mass tag eingebaut wurde. Zur Aufreinigung dient ein Affinitätstag, der entweder aus der Strep-tag II Sequenz oder Biotin besteht. In Kapitel 1 werden Schritt-für-Schritt Protokolle präsentiert, für die Gestaltung und Entwicklung einer Gruppe von isotopenmarkierten Peptiden, die eine simultane Analyse per LC-MS/MS zulassen. Die gleichzeitige Detektion wird dadurch erreicht, dass jedes Gruppenmitglied in der Summe die gleiche Molekülmasse besitzt, aber aufgrund der angewandten isobaren Isotopenmarkierungen fragmentieren diese in MS2 in spezifische y-Typ Ionen, die einen Massenunterschied von 1 oder 2 Da besitzen. Zudem wurde erklärt, wie die Massenreporter Peptide durch den aktivierten, Calcium-abhängigen Blutkoagulationsfaktor XIII (FXIIIa) kovalent an die EZM gebunden werden. Bei der enzymatischen Reaktion wird durch das Quervernetzen des Lysins der TG Aminosäuresequenz (der D-Domäne von IGF-I) der Massenreporter mit dem Glutamin der Aminosäureerkennungssequenz in Fibronectin eine Isopeptidbindung gebildet. Die Freisetzung der Massenreporter von der EZM erfolgt aufgrund des erhöhten MMP Level und geschieht durch die Spaltung der dazwischenliegenden MSS. Die entwickelten Massenreporter waren in der Lage die Enzymaktivität in einer aus Fibroblasten stammenden in vitro Umgebung aus EZM zu beobachten, was in Kapitel 2 dargestellt wird. Die modulare Struktur der Massenreporter wurde in einer Machbarkeitsstudie untersucht. Zuerst wurden die verschiedenen Module bezüglich ihrer Ansprechempfindlichkeit auf MMP und ihrer Sensitivität gegenüber der TEV Protease und UV-Licht charakterisiert. Dann wurden die vier Peptide FXIIIa-vermittelt an die EZM gekoppelt und die erfolgreiche Kopplung an EZM wurde mit Hilfe eines immunologischen Verfahrens oder konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert. Abschließend wurden die auf der EZM immobilisierten Massenreporter mit MMP-9 inkubiert, um deren Fähigkeit der gleichzeitigen Detektion von MMP Aktivität zu untersuchen. Die abgespalteten Massenreporterfragmente wurden in drei Schritten aufgereinigt und die vier isotopenmarkierten Tags wurden als Mix mittels LC-MS/MS analysiert. Kapitel 3 beschreibt die Änderung der aus Kapitel 1 und 2 bekannten immobilisierten System zu einem löslichen System, das die Enzymaktivität in Körperflüssigkeiten bestimmen soll und in einem Mausmodell für Osteoarthritis getestet wurde. Anstelle der immobilisierenden TG Sequenz wurde der C Terminus der MSS um zwei Aminosäuren erweitert. Eine Aminosäure trägt eine Azidgruppe um eine Azid-Alkin Cycloaddition mit einem hochmolekularen PEG durchzuführen, die ausgewählt wurde, um die Massenreporter an der Injektionsstelle zurückzuhalten. Des Weiteren wurde der Affinitäts-tag mit einer 2.5 kDa PEG-Kette erweitert, um die Halbwertszeit des von MMPs freigesetzten Massenreporterpeptides zu erhöhen. Die Biokompatibilität des Systems wurde erwiesen, allerdings war es nicht möglich die MMP Aktivität in einem in vivo Model zu zeigen, da eine Analyse der Proben aufgrund von Versand- und Zollproblemen und damit verbundenen Instabilitäten nicht möglich war. Zusammenfassend wurde ein diagnostische Peptidsystem bestehend aus zwei Varianten entwickelt. Die zu immobilisierende Version aus Kapitel 1 und 2 wurde so konzipiert, dass die Peptide durch die Transglutaminase vermittelte Quervernetzungsreaktion kovalent an EZM gebunden werden. In einem in vitro Model wurde die Funktionalität des Massenreporter Systems hinsichtlich der Detektion von MMP Aktivität erfolgreich bestätigt. Die zweite Variante, bestehend aus einem löslichen Massenreporter System, wurde in einem Osteoarthritis Mausmodel getestet und zeigte Biokompatibilität. Mit diesen zwei entworfenen Systemen stellt diese Dissertation eine flexible Plattform zur Verfügung, die basierend auf der multiplexen Detektion von isotopenmarkierten Peptiden, für die Charakterisierung von Zellkulturmodellen bezüglich deren MMP Aktivität genutzt wird, die zelluläre EZM als endogenes Depot anwendet und die durch die Entwicklung einer Familie aus isotopenmarkierten Tags eine simultane Detektion von mindestens vier Tags erlaubt. KW - Extrazelluläre Matrix KW - Tandem-Massenspektrometrie KW - Proteasen KW - Markierte Verbindungen KW - isotopically labelled peptides KW - tandem mass spectrometry KW - matrix metalloproteinase KW - extracellular matrix KW - transglutaminase Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229377 ER -