TY  - THES
A1  - Topf, Christine
T1  - Design, Synthese und biologische Testung von KasA-Inhibitoren als potentielle Wirkstoffe gegen Mycobacterium tuberculosis
T1  - Design, synthesis and biological testing of KasA-inhibitors as potential drugs against mycobacterium tuberculosis
N2  - Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Tuberkulose, einer schwerwiegenden bakteriellen Infektionskrankheit, die am häufigsten die Lunge befällt. Die Entwicklung neuer Arzneistoffe gegen diese Erkrankung ist immens wichtig, da nach Angaben der WHO weltweit jährlich über 1 Million Menschen an den Folgen der Tuberkulose sterben, derzeit kein effizienter Impfstoff zur Verfügung steht und sich die Therapiemöglichkeiten auf wenige Arzneistoffe beschränken. Zudem steigt weltweit das Auftreten von arzneistoff- und totalresistenten Tuberkuloseformen. Tuberkulose wird vorwiegend durch das Mycobacterium tuberculosis erregt. Eine Besonderheit des M. tuberculosis stellt die mykobakterielle Zellwand dar, da diese durch einen hohen Anteil an Fettsäuren besonders wachsartig und dick ist. Die mykobakterielle Fettsäuresynthese unterscheidet sich signifikant von der Synthese eukaryotischer Fettsäuren. Daher besteht die Möglichkeit, Inhibitoren der mykobakteriellen Fettsäuresynthese als effektive und selektive neue Antituberkulotika zu entwickeln. Zielstruktur dieser Arbeit ist KasA (β-Ketoacylsynthase), ein Enzym der mykobakteriellen Fettsäuresynthese II, das die Kondensation zwischen der wachsenden Fettsäurekette und Malonyl-ACP katalysiert. Ein literaturbekannter KasA-Inhibitor ist Thiolactomycin, ein Thiolacton-Derivat mit einer schwachen inhibitorischen Aktivität (IC50: 242 µM; Kd 226 µM), für den eine KasA-Komplexstruktur verfügbar ist. Ziel der Arbeit war es, mittels computergestützten Wirkstoffdesigns neue Leitstrukturen für KasA-Inhibitoren zu entwickeln und davon abgeleitet Substanzbibliotheken kleiner Moleküle zu synthetisieren. Zur Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten sollte KasA exprimiert und ein Assay etabliert werden. Theoretische und experimentelle Affinitäten sollten anschließend analysiert und bewertet werden. Zur Identifizierung neuer potenzieller KasA-Inhibitoren wurde mit Hilfe des Thiolactomycin-Bindemodus ein Pharmakophor-Modell erstellt. In diesem wurden die essentielle Wasserstoffbrücke zwischen den Histidinen und dem Carbonyl-Sauerstoff des Thiolactonrings, zwei hydrophobe Bereiche und ein verbindendes Strukturelement definiert und das Volumen des Pharmakophors begrenzt. Das Screening der Datenbank erfolgte mit GOLD4.0 und GOLDscore. Zur Identifizierung der 16 aussichtsreichsten Verbindungen wurden Rescorings mit ChemScore und sfc_score290m durchgeführt, sowie verschiedene physikochemische Deskriptoren und der errechnete Bindungsmodus einbezogen. Ausgewählte Verbindungen des Screenings wurden synthetisiert. Weitere Variationen wurden durch Einführung von Substituenten und Bromierung und Nitrierung der Grundgerüste erhalten. Zur biologischen Testung dieser Verbindungen konnte KasA in M. smegmatis exprimiert werden. Die Reinigung des Proteins erfolgte mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie. Affinitätswerte an KasA konnten mit einem Fluoreszenzassays bestimmt werden, da in jedem KasA-Monomer vier Tryptophane zur intrinsischen Fluoreszenz beitragen. Die Bindung eines Inhibitors in die TLM-Bindetasche führte zum Quenching der Fluoreszenz von KasA und konnte unter Berücksichtigung von Verdünnungs- und inneren Filtereffekten zur Berechnung der Dissoziationskonstante Kd herangezogen werden. Die In-vitro-Untersuchungen der Inhibitoren von KasA zeigten im Vergleich zu TLM eine Verbesserung der Affinität bis zu einem Faktor von 11, die beste Verbindung war das Nitroisatin-Derivat 2l (22.1 µM). Einen Hinweis auf Hemmung des Wachstums von Mykobakterien war für die Verbindungen 2e (5-Nitro-1-phenethyl-2,3-indolindion) und 3a (5,7-Dibrom-1-(4-chlorbenzyl)indolin-2,3-dion) ersichtlich. Die übrigen Verbindungen zeigten keine Aktivität, was dadurch bedingt sein kann, dass sie Substanzen nicht lipophil genug sind (clogP-Werte zwischen 1 und 3), um die mykobakterielle Zellwand zu durchdringen. Analog dem Docking im Rahmen des virtuellen Screenings wurde ein Docking mit GOLD4.0 und GOLDscore für die Substanzbibliothek durchgeführt. Verglichen mit den In-vitro-Affinitäten konnte eine gute Übereinstimmung in der Differenzierung der Substanzklassen gefunden werden. Da kleine Moleküle mit großer biologischer Aktivität zu bevorzugen sind, wurde die „ligand efficiency“, die inhibitorische Potenz unabhängig vom Molekulargewicht, für die Verbindungen berechnet. Für die Substanzbibliothek wurde eine gute Korrelation von „ligand efficiency“ und GOLDscore pro Schweratom erzielt (R2=0.65), beste Substanzgruppen waren monoalkylierte Uracil- und Isatin-Derivate. Der beste Wert wurde für das Isatin-Derivat 1a erzielt. Mit den erarbeiteten theoretischen und experimentellen Ergebnissen und den etablierten Methoden bietet diese Arbeit eine wichtige Grundlage, um erste „hits“ von KasA-Inhibitoren zu neuen Leitstrukturen für Wirkstoffe gegen Mycobakterium tuberculosis zu entwickeln.
N2  - This work focused on the development of new antibiotics against tuberculosis, a severe bacterial infection mainly affecting the lung. Currently, according to the WHO more than 1 million people annually die from tuberculosis. Furthermore, the therapy is limited to inefficient vaccines and a small number of antibiotics, and complicated by multi- or even totally resistant mycobacterial strains occurring worldwide. Thus, new active compounds against tuberculosis are urgently needed. Tuberculosis is mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which is characterized by a unique thick and waxy cell wall containing a high percentage of mycolic acids. Due to the fact that the biosynthesis of mycolic acids is not carried out in eukaryotes, it is a reasonable strategy to design inhibitors of the FAS II system as effective and selective antibiotics against mycobacteria. The enzyme of interest in our work is the β-keto-acyl ACP synthase (KasA), an elongating enzyme in the FAS II system of Mycobacterium tuberculosis which catalyses the condensation between the mycolic acid and malonyl-ACP. Recently, a crystal structure of KasA in complex with Thiolactomycin, a weak thiolactone-type inhibitor (IC50: 242 µM; Kd 226 µM), was solved. Aim of this work was to identify new potential lead structures for KasA-inhibitors by virtual screening. A library of small molecules was synthesized and tested for ability to inhibit KasA, therefore KasA was expressed. In silico and in vitro affinities were analyzed and compared. To identify new lead structures for potential KasA inhibitors, a pharmacophore model based on TLM was developed. This contained the essential H-bond between the carbonyl-oxygen of TLM with the histidines, two hydrophobic features and a linker feature between them. Additionally, volume constraints were applied to limit the size of molecules matching the pharmacophore model. Screening of a database of commercially available compounds was performed with GOLD4.0 and GOLDscore. 16 Promising structures were identified by implementation of rescorings with ChemScore and sfc_score290m, by calculation of physicochemical descriptors and by visual inspection of the predicted binding mode. Selected substances of the virtual screening were synthesized. Based on these substances the core fragments were varied by bromination and nitration. Via subsequent introduction of substituents a small library of compounds was created. For biological testings KasA was expressed in M. smegmatis. Purification of the protein was achieved by affinity and size exclusion chromatography. Dissociation constants were determined by a fluorescence assay: In each KasA monomer four tryptophanes cause intrinsic fluorescence, thus binding of inhibitors led to quenching of the fluorescence. Therefore, dissociation constants of ligands were calculated considering the dilution and inner filter effects. The in vitro studies of the KasA inhibitors showed, in comparison to TLM, a 11fold improvement of the affinity. The best inhibitor was the nitroisatine derivative 2l (22.1 µM). 2e (5-Nitro-1-phenethyl-2,3-indolindione) and 3a (5,7-Dibromo-1-(4-chlorbenzyl)indolin-2,3-dione) were able to inhibit the growth of mycobacteria. No other substances showed any antimycobacterial activity, which might be due to their low lipophilicity (clogP varies from 1 to 3), hence which hinders an efficient penetration through the highly lipophilic mycobacterial cell wall. In the future, the precise cause of this fact has to be determined to counteract with systematic structural modifications. The compound library was docked into KasA by using GOLD4.0 and GOLDscore with analogous settings as in the virtual screening. The analysis of the results showed an agreement between in vitro and in silico outcomes for the substance classes. As small molecules of high activity are preferred in drug development, ligand efficiencies of the inhibitors were calculated which describe inhibitory potency independent of molecular weight. A good correlation between ligand efficiency and GOLDscore per heavy atom was observed. Best ligand efficiencies were obtained by the classes of monoalkylated uracile- and isatine-derivatives, the best substance was the isatine-derivative 1a. Due to the established methods combined with computer-based and experimental results, this work provides an important foundation for the future development of first “hits” of KasA-inhibitors to new lead structures of new drugs against mycobacterium tuberculosis.
KW  - Tuberkelbakterium
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Ketoacyl-ACP-Synthase <beta>
KW  - Inhibitor
KW  - Virtuelles Screening
KW  - Fettsäuresynthese-II
KW  - KasA
KW  - Mykobakterien
KW  - virtual screening
KW  - fatty acid synthesis II
KW  - KasA
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77865
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lee, Wook
T1  - Computational study on the catalytic mechanism of mtKasA
T1  - Theoretische Untersuchungen des katalytischen Mechanismus von mtKasA
N2  - Das Enzym KasA spielt eine entscheidende Rolle in der Biosynthese von Mykolsäuren, den Bausteinen der Zellwände von Mycobacteriumtuberculosis. Dessen essentielle Notwendigkeit zeigt sich bei Abwesenheit von KasA in einer Zelllyse (Auflösung von Zellen) bei Mycobacteriumtuberculosis. Durch seine Bedeutung für Mycobacteriumtuberculosis, dem Erreger von Tuberkulose und damit der zweithäufigsten Todesursache durch Infektionskrankheiten, stellt KasA ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dar. Durch das Auftreten von extensiv resistenten Stämmen welche die meisten bekannten Antibiotika zur Bekämpfung von Tuberkulose inaktivieren wird es dringend notwendig neue Medikamente gegen Tuberkulose zu entwickeln. In Kapitel 3.1 wird der Protonierungszustand der katalytischen Reste im Ruhezustand untersucht. Für diese Untersuchungen wurden Free Energy Perturbation (FEP) Rechnungen und MD Simulationen verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass der zwitterionische Zustand am wahrscheinlichsten ist. Um diese Aussage mit weiteren handfesten Daten zu untermauern wurden Potential(hyper)flächen (PES) für den Protonentransfer zwischen neutralen und zwitterionischen Zustand mit Hilfe von QM/MM Methoden berechnet. Durch die starke Abhängigkeit der QM/MM Optimierung von der Ausgangsstruktur war es nicht möglich konsistente Ergebnisse für diese Berechnungen zu bekommen. Um dieses Problem zu umgehen wurde ein auf QM/MM basierendes Umbrella Sampling mit Semiempirischen Methoden (RM1) durchgeführt. Die sich daraus ergebende PMF Fläche zeigt das der zwitterionische Zustand stabiler ist als der neutrale Zustand. In Kapitel 3.2 wurde der Protonierungszustand der entsprechenden Reste im Acyl-Enzym Zustand untersucht. Im Unterschied zu anderen katalytischen Resten ist der Protonierungszustand von His311 ist nicht eindeutig im Acyl-Enzym Zustand und es ergeben sich aus den verschiedenen Protonierungszuständen verschiedene Decarboxylierungsmechanismen. Um den wahrscheinlichsten Protonierungszustand bezüglich der freien Energie zu bestimmen wurden FEP Rechnungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass der pKa Wert an Nδ beträchtlich durch die Enzymumgebung verringert wird, während dies für Nε nicht der Fall ist. Zusätzlich dazu wurden die PMF Profile für den Protonentransfer zwischen Lys340 und Glu354 mit der QM/MM basierten Umbrella Sampling Methode berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass das Lys340/Glu354 Paar eher neutral als ionisch ist, wenn His311 an Nε protoniert ist. Ein relativ hoher ionischer Charakter des Lys340/Glu354 Paares, wenn His311 doppelt protoniert ist, gibt einen wertvollen Einblick in die Rolle welche das Lys340/Glu354 Paar beim verschieben des Protonierungszustandes von Nδ zu Nε im His311 nach dem Acyltransferschritt spielt. Die Ergebnisse zeigen, dass His311 neutral und an Nε protoniert ist. Ebenso ist das Lys340/Glu354 Paar neutral im Acyl-Enzym Zustand. Diese berechneten Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass die Decarboxylierung durch ein Oxyanion Loch erleichtert wird welches aus zwei katalytischen Histidin Resten besteht. In Kapitel 3.3 wurde der Protonierungszustand der katalytischen Reste im Ruhezustand erneut untersucht da eine aktuelle Benchmarkstudie zeigte, dass die verwendete Semiempirische Methode (RM1) in Kapitel 3.1 dazu tendiert die Stabilisation des zwitterionischen Zustandes zu überschätzen. Auch wurde in Kapitel 3.1 das Lys340/Glu354 Paar als rein ionisch angesehen, während sich in Kapitel 3.2 herausstellte, dass es sich um eine Mischung aus neutralen und ionischen Charakter handelt. Die neuen Untersuchungen beinhalten eine größere QM Region inklusive des Lys340/Glu354 Paares. Der dafür verwendete BLYP/6-31G** Ansatz ist ausreichend akkurat für die aktuelle Fragestellung, was durch Vergleichsrechnungen bewiesen wurde. Die neuen Ergebnisse der QM/MM MD und FEP Rechnungen deuten an, dass die katalytischen Reste im Ruhezustand höchst wahrscheinlich neutral vorliegen. Dies wiederum führt zu der Frage wie KasA aktiviert werden kann um die katalytische Reaktion zu initiieren. Auf der Basis der Ergebnisse der MD Simulationen und FEP Rechnungen für den His311Ala Mutanten in Kapitel 3.1 stellten wir die Hypothese auf, dass die offene Konformation von Phe404 die Aktivierung der katalytischen Reste durch die (Aus)bildung einer starken Wasserstoffbindung einleitet. Die QM/MM MD Simulation bestätigt dass diese Aktivierung der katalytischen Reste durch die offene Konformation des Phe404 bewerkstelligt werden kann. Das entsprechende auf Kraftfeld basierende PMF Profil zeigt auch, dass dieser Konformationswechsel energetisch realisierbar ist. Die Verteilung der hydrophilen und hydrophoben Reste in der Malonyl Bindungstasche in Verbindung mit unseren berechneten Ergebnissen geben einen Einblick in den detaillierten
N2  - KasA is a key enzyme which plays an essential part in the biosynthetic pathway of mycolic acids, the building block of cell wall in Mycobacterium tuberculosis. Its importance was demonstrated by the finding that the depletion of KasA leads to the cell lysis of Mycobacterium tuberculosis. Since Mycobacterium tuberculosis is a pathogen of tuberculosis, the second leading cause of death from an infectious disease worldwide, KasA has drawn attention as one of the attractive drug targets against tuberculosis. Due to the emergence of extensively drug-resistant strains which make most of the known antibiotics for treating tuberculosis ineffective, it became an urgent issue to develop new drugs against tuberculosis. In chapter 3.1, the protonation state of the catalytic residues in the resting state was mainly addressed. The FEP computation and MD simulations were employed for this investigation, and the results showed that the zwitterionic state is most probable. To underpin this conclusion with more solid data, The PESs for the proton transfer between the neutral and zwitterionic state were computed in the context of QM/MM. However, due to the strong dependency of the QM/MM optimization on the initial structure, it was not possible to obtain consistent results from these computations. To circumvent this problem, QM/MM based umbrella sampling was carried out with a semi-empirical method (RM1), and the resulting PMF surface indicated that the zwitterionic state is more stable than the neutral state. In chapter 3.2, the protonation state of significant residues in the acyl-enzyme state was investigated. Unlike other catalytic residues, the protonation state of His311 is ambiguous in the acyl-enzyme state, and different decarboxylation mechanisms can be derived depending on the protonation state of His311 in the acyl-enzyme state. Therefore, FEP computations were carried out to find most probable protonation state of His311 in terms of free energy, and the results showed that the pKa value at Nδ is considerably lowered by the enzyme environment while that of Nε is not. Additionally, the PMF profiles for the proton transfer between Lys340 and Glu354 were computed using QM/MM based umbrellas sampling method, and the results showed that the property of the Lys340/Glu354 pair is neutral rather than ionic when His311 is protonated at Nε. Moreover, a relatively larger ionic character of the Lys340/Glu354 pair when His311 is doubly protonated provides a valuable insight into how the Lys340/Glu354 pair plays a role in shifting the protonated state from Nδ to Nε in His311 after the acyl-transfer step. Overall, the results demonstrated that His311 is neutral and protonated at Nε, and the Lys340/Glu354 pair is also neutral in the acyl-enzyme state. Those computational results lead to the conclusion that the decarboxylation reaction is facilitated by an oxyanion hole which is comprised of two catalytic histidines. In chapter 3.3, the protonation state of catalytic residues in the resting state was revisited because a recent benchmark study showed that the employed semi-empirical method (RM1) in chapter 3.1 tends to overestimate the stabilization of the zwitterionic state. Furthermore, the Lys340/Glu354 pair was considered as purely ionic in chapter 3.1, while it actually has a mixed neutral and ionic character as demonstrated in chapter 3.2. The new investigations employed a larger QM region including the Lys340/Glu354 pair with the BLYP/6-31G** approach, which was proven to be accurate enough for the present purpose by benchmark computations. The new results from the QM/MM MD and FEP computations indicated the catalytic residues to be neutral most probably in the resting state, and this in turn brought up the question how KasA can be activated to initiate the catalytic reaction. On the basis of the results from the MD simulations and FEP computations for the His311Ala mutant in chapter 3.1, we hypothesized that the open conformation of Phe404 would trigger the activation of the catalytic residues by the formation of a strong hydrogen bond. The QM/MM MD simulation proved that the activation of the catalytic residues can indeed be accomplished by the open conformation of Phe404 we suggested, and the corresponding force field based PMF profile also indicated that this conformational change is energetically feasible. The distribution of hydrophilic and hydrophobic residues in the malonyl binding pocket in conjunction with our computational results further provided a valuable insight into the detailed process how the catalytic residues is activated upon the substrate entering.
KW  - Tuberkelbakterium
KW  - KasA
KW  - katalytischer Mechanismus
KW  - QM/MM
KW  - Molekular Dynamik
KW  - KasA
KW  - catalytic mechanism
KW  - QM/MM
KW  - Molecular dynamics
KW  - Enzymkatalyse
KW  - Enzym
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83989
ER  -