TY - THES A1 - Sibilski, Claudia T1 - Identification and characterization of the novel mKSR1 phosphorylation site Tyr728 and its role in MAPK signaling T1 - Identifizierung und Charakterisierung der neuartigen mKSR1-Phosphorylierungsstelle Tyr728 und deren Rolle in der MAPK-Signalkaskade N2 - In mammals, KSR1 functions as an essential scaffold that coordinates the assembly of RAF/MEK/ERK complexes and regulates intracellular signal transduction upon extracellular stimulation. Aberrant activation of the equivalent MAPK signaling pathway has been implicated in multiple human cancers and some developmental disorders. The mechanism of KSR1 regulation is highly complex and involves several phosphorylation/dephosphorylation steps. In the present study, a number of novel in vivo phosphorylation sites were detected in mKSR1 by use of mass spectrometry analysis. Among others, Tyr728 was identified as a unique regulatory residue phosphorylated by LCK, a Src kinase family member. To understand how phosphorylation of Tyr728 may regulate the function of KSR1 in signal transduction and cellular processes, structural modeling and biochemical studies were integrated in this work. Computational modeling of the mKSR1(KD) protein structure revealed strong hydrogen bonding between phospho-Tyr728 and the residues surrounding Arg649. Remarkably, this pattern was altered when Tyr728 was non-phosphorylated or substituted. As confirmed by biochemical analysis, Arg649 may serve as a major anchor point for phospho-Tyr728 in order to stabilize internal structures of KSR1. In line with the protein modeling results, mutational studies revealed that substitution of Tyr728 by phenylalanine leads to a less compact interaction between KSR1 and MEK, a facilitated KSR1/B-RAF binding and an increased phosphorylation of MEK in complex with KSR1. From these findings it can be concluded that phospho-Tyr728 is involved in tightening the KSR1/MEK interaction interface and in regulating the phosphorylation of KSR1-bound MEK by either RAF or KSR1 kinases. Beside the Tyr728, Ser722 was identified as a novel regulatory phosphorylation site. Amino acid exchanges at the relevant position demonstrated that Ser722 regulates KSR1-bound MEK phosphorylation without affecting KSR1/MEK binding per se. Due to its localization, Ser722 might consequently control the catalytic activity of KSR1 by interfering with the access of substrate (possibly MEK) to the active site of KSR1 kinase. Together with Ser722, phosphorylated Tyr728 may further positively affect the kinase activity of KSR1 as a consequence of its vicinity to the activation and catalytic loop in the KSR1(KD). As revealed by structural modeling, phospho-Tyr728 builds a hydrogen bond with the highly conserved Lys685. Consequently, phospho-Tyr728 has a stabilizing effect on internal structures involved in the catalytic reaction and possibly enhances the phosphate transfer within the catalytic cleft in KSR1. Considering these facts, it seems very likely that the LCK-dependent phosphorylation of Tyr728 plays a crucial role in the regulation of KSR1 catalytic activity. Results of fractionation and morphology analyses revealed that KSR1 recruits LCK to cytoskeleton for its phosphorylation at Tyr728 suggesting that this residue may regulate cytoskeleton dynamics and, consequently, cell motility. Beside that, phosphorylation of Tyr728 is involved in the regulation of cell proliferation, as shown by a significantly reduced population doubling time of KSR1-Y728F cells compared to cells expressing wild type KSR1. Taken together, tyrosine phosphorylation in KSR1 uncovers a new link between Src family kinases and MAPK signaling. Tyr728, the novel regulatory phosphorylation site in murine KSR1, may coordinate the transition between the scaffolding and the catalytic function of KSR1 serving as a control point used to fine-tune cellular responses. N2 - KSR1 fungiert bei Säugetieren als zentrales Gerüstprotein, welches die Anordnung von RAF/MEK/ERK-Komplexen koordiniert und die intrazelluläre Signalweiterleitung nach extrazellulärer Stimulation reguliert. Eine abweichende Aktivierung des entsprechenden MAPK-Signalwegs wurde mit vielen humanen Krebsformen und einigen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht. Der Mechanismus der KSR1-Regulierung ist hochgradig komplex und involviert mehrfach Schritte der Phosphorylierung/Dephosphorylierung. In der vorliegenden Studie wurden etliche neue in-vivo-Phosphorylierungsstellen in mKSR1 mittels massenspektrometrischer Analyse entdeckt. Neben anderen wurde Tyr728 als besonderer regulatorischer Rest identifiziert, welcher durch LCK, einem Mitglied der Src-Kinase-Familie, phosphoryliert wird. Um zu verstehen wie die Phosphorylierung von Tyr728 die Funktion von KSR1 innerhalb der Signalweiterleitung und zellulärer Prozesse regulieren könnte, wurden strukturelle Modellierungen und biochemische Untersuchungen in diese Arbeit integriert. Die Computermodellierung der mKSR1(KD)-Proteinstruktur zeigte starke Wasserstoff- brückenbindungen zwischen Phospho-Tyr728 und den Resten in der Umgebung von Arg649 auf. Dieses Muster war auffällig verändert, wenn Tyr728 nicht phosphoryliert oder substituiert war. Wie anhand biochemischer Analyse untermauert wurde, könnte Arg649 für phospho-Tyr728 als Hauptankerpunkt dienen, um interne Strukturen in KSR1 zu stabilisieren. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Proteinmodellierung enthüllten die Mutationsstudien, dass die Substitution von Tyr728 mit Phenylalanin zu einer weniger kompakten Interaktion zwischen KSR1 und MEK, einer erleichterten KSR1/B-RAF-Bindung und einer ansteigenden Phosphorylierung von MEK im Komplex mit KSR1 führt. Anhand dieser Erkenntnisse kann man rückschließen, dass Phospho-Tyr728 in die Verstärkung der Interaktionen innerhalb der KSR1/MEK-Grenzfläche und in die Regulierung der Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK durch entweder RAF- oder KSR1-Kinasen involviert ist. Neben Tyr728 wurde Ser722 als eine neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle identifiziert. Aminosäureaustausche an der betreffenden Position demonstrierten, dass Ser722 die Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK reguliert ohne die KSR1/MEK-Bindung selbst zu beeinträchtigen. Bedingt durch seine Lokalisierung könnte Ser722 folglich die katalytische Aktivität von KSR1 kontrollieren, indem es den Zugang des Substrates (möglicherweise MEK) zur aktiven Seite der KSR1-Kinase behindert. Zusammen mit Ser722 könnte phosphoryliertes Tyr728 ferner die Kinaseaktivität von KSR1 positiv beeinflussen, infolge von dessen Nähe zur Aktivierungs- und katalytischen Schleife in der KSR1(KD). Wie mittels Strukturmodellierung offengelegt wurde, bildet Phospho-Tyr728 eine Wasserstoffbrücke mit dem hochgradig konservierten Lys685 aus. Folglich hat Phospho-Tyr728 einen stabilisierenden Effekt auf interne Strukturen, welche in die katalytische Reaktion involviert sind, und erleichtert möglicherweise den Phosphattransfer innerhalb der katalytischen Spalte in KSR1. In Anbetracht dieser Fakten scheint es sehr wahrscheinlich, dass die LCK-abhängige Phosphorylierung von Tyr728 eine äußerst wichtige Rolle in der Regulierung der katalytischen Aktivität von KSR1 spielt. Die Ergebnisse der Fraktionierungs- und Morphologieanalysen enthüllten, dass KSR1 für die Phosphorylierung an Tyr728 LCK zum Zytoskelett rekrutiert, was darauf hindeutet, dass dieser Rest die Dynamik des Zytoskeletts und folglich Zellmotilität regulieren könnte. Darüber hinaus ist die Phosphorylierung von Tyr728 in die Regulierung der Zellproliferation involviert, wie anhand einer bedeutend reduzierten Populationsverdopplungszeit von KSR1-Y728F-Zellen im Vergleich zu Zellen, welche wildtypisches KSR1 exprimieren, gezeigt wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Tyrosin-Phosphorylierung in KSR1 eine neue Verknüpfung zwischen Kinasen der Src-Familie und der MAPK-Signalwirkung enthüllt. Tyr728, die neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle in Maus-KSR1, könnte den Übergang zwischen der Gerüst- und der katalytischen Funktion von KSR1 koordinieren und damit als Kontrollpunkt dienen, um zelluläre Reaktionen fein abzustimmen. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Regulation KW - tyrosine phosphorylation KW - KSR1 KW - LCK KW - MAPK KW - phosphorylation KW - signaling Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114672 ER - TY - THES A1 - Premachandran Nair, Anoop Chandran T1 - Identification and functional characterization of TGF-β inducible, immunosuppressive miRNAs in human CD8+ T cells T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von TGF-β induzierbaren, immunsuppressiven miRNAs in humanen CD8+ T Zellen N2 - While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis. Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling. N2 - Obwohl bekannt war, dass TGF- die miRNA Expression in zahlreichen Zelltypen moduliert, waren TGF- abhängige Veränderung des miRNA Profils in CD8+ T Zellen noch nicht untersucht worden. Da TGF-β die Effektorfunktionen von CD8+ T Zellen aber in vielfältiger Weise inhibiert, fragten wir uns, ob die transkriptionellen Effekte, die TGF-β bekanntermaßen auf Immuneffektormoleküle ausübt, noch durch die Induktion immunregulatorischer miRNAs ergänzt werden. Daher nutzten wir miRNA Arrays, Genomsequenzierungstechniken und Echtzeit-PCR um miRNAs zu identifizieren, welche in humane CD8+ T Zellen von TGF- moduliert werden. Die Beobachtung, dass die TGF--abhängige Herunterregulation der NKG2D Oberflächenexpression in Natürlichen Killerzellen und CD8+ T Zellen nicht mit einer entsprechenden Verringerung der mRNA Menge einhergeht, ließ zudem vermuten, dass dieser Signalweg über miRNAs reguliert werden könnte. Nach verschiedenen miRNA Reporterassays musste diese Hpothese jedoch verworfen werden. Stattdessen zeigte sich, dass TGF- die Transkription von DAP10 inhibiert was wiederum die Oberflächenexpression von NKG2D limitieren sollte. Trotz viel versprechender initialer Experimente scheiterte der letzgültige Beweis dieser Hypothese aber an der ungenügenden Transfizierbarkeit von primären NK Zellen sowie von NK Zelllinien. Daher konzentrierten wir uns im Weiteren auf die durch TGF- induzierten Veränderungen im miRNom von CD8+ T Zellen und konnten mit drei verschiedenen Techniken die Induktion des miR-23a Clusters (mit den einzelnen miRNAs miR-23a, miR-27a und miR-24) bestätigen. Auf der Suche nach potentiellen immunregulatorisch relevanten Zielgenen dieser miRNAs konnten wir erstmals eine Regulation von IFN- durch miR-27a und miR-24 nachweisen. Zu diesem Zweck generierte miRNA Reporterkonstrukte zeigten zudem, dass LAMP1 durch miR-23a reguliert wird. Nach Modulation des miR-23a Clusters durch die entsprechenden miRNA Antagomir und Surrogat-Konstrukte konnten wir auch in CD8+ T Zellen signifikante Veränderungen der IFN-γ Expression nachweisen und somit die funktionelle Relevanz unserer Befunde bestätigen. Die Effekte auf die Expression von CD107a/LAMP1 waren hingegen nur minimal. Trotzdem führte die Überexpression des miR-23a Clusters zu einer Verringerung der zytotoxischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T Zellen. Zusammen genommen belegen diese funktionellen Untersuchungen, dass das miRNA-23a Cluster, welches durch TGF-β induziert wird, zur Hemung der Effektorfunktionen in CD8+ T Zellen beiträgt, und zwar sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von TGF-β. KW - Transforming Growth Factor beta KW - Antigen CD8 KW - miRNS KW - Interferon KW - Immunsystem KW - miR-23a cluster KW - T cell cytotoxicity KW - Regulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109741 ER - TY - THES A1 - Stübs, Dorothee T1 - Identifizierung und Regulation von kälteinduzierbaren Faktoren aus B. bronchiseptica T1 - Identification and regulation of cold induced factors in B. bronchiseptica N2 - Kälteschockproteine werden in Bakterien, gleichermaßen wie die gut charakterisierten Hitzeschockproteine, bei hohen Temperaturschwankungen stark induziert und ermöglichen der Zelle durch unterschiedliche Funktionen ein Wachstum in der Kälte. In dieser Promotionsarbeit wurde begonnen, die Kälteschock-Antwort von Bakterien des Genus Bordetella zu charakterisieren. Sowohl B. bronchiseptica als auch B. pertussis codieren für fünf Kälteschockproteine, die als CspA, CspB, CspC, CspD und CspE bezeichnet werden. Die fünf Proteine weisen eine signifikante Homologie zum Haupt-Kälteschockprotein CspA aus E. coli auf. Während in den Modellorganismen E. coli und B. subtilis mindestens vier (E. coli) bzw. alle drei (B. subtilis) csp-Gene deletiert sein müssen, um einen Wachstumsdefizit zu erkennen, genügt im Falle von B. bronchiseptica eine einzige Insertionsmutation im Gen cspB, um einen temperaturunabhängigen Wachstumsdefekt zu beobachten. Nach einem Kälteschock werden in B. bronchiseptica drei der fünf csp-Gene, cspA, cspB und cspC, deutlich induziert. Betrachtet man das Expressionsmuster der fünf csp-Gene unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Zugabe von translationshemmenden Antibiotika, Hitzeschock oder osmotischer Stress, so lässt sich ein komplexes Expressionsmuster aufzeichnen. Außerdem besitzen die drei kälteinduzierbaren Gene cspA, cspB und cspC mehrere Transkriptionsstartpunkte, deren Transkriptmengen unter den verschiedenen Schockbedingungen stark variieren. Es stellte sich heraus, dass eine Überexpression von CspB aus B. bronchiseptica für die E. coli – Zelle toxisch ist, daher wurde das CspB-Protein als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Um eine potentielle Funktion von CspB in der Zelle zu untersuchen, wurden Filterbindeassays mit CspB::GST durchgeführt. Es wurde eine hochaffine, aber unspezifische Bindung an ssDNA festgestellt, was auf eine mögliche Funktion von CspB als Chaperon hindeutet. Nach Synthese eines CspB-spezifischen Antikörpers wurde die Kälteinduktion von CspB auch auf Proteinebene nachgewiesen. Durch 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Charakterisierung konnten 17 weitere kälteinduzierbare Proteine aus B. bronchiseptica identifiziert werden. Darunter waren u. a. ein Chaperon mit Ähnlichkeit zu GroES, ein Translationsinhibitor BB2940 und das CspB. Diese kälteinduzierbaren Proteine ähneln den CIPs aus E. coli. Weiterhin konnten noch das UspA und mehrere am Metabolismus beteiligte Proteine als CIPs aus B. bronchiseptica identifiziert werden, was signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kälteadaptation zwischen den beiden Organismen aufzeigt. Betrachtet man die Promotorbereiche aller identifizierten csp-Gene, so fällt eine für diese Gene typische sehr lange 5’UTR auf. Innerhalb dieser upstream Region findet man in vier der fünf csp-Gene einen 9 bp langen Consensus mit der Sequenz TCCTTGATT, der in nahezu gleichem Abstand vom postulierten Startcodon vorkommt. Diese identifizierte 9bp-box ist für eine effiziente Transkription in der Kälte jedoch nicht von Bedeutung. Auf posttranskriptioneller Ebene wird die lange 5’UTR für die Stabilisierung der cold-shock mRNA in der Kälte verantwortlich gemacht. Außerdem ist das Vorhandensein der kompletten 5’UTR essentiell für eine effiziente Translation bei niedriger Temperatur, wobei eine Mutation der 9bp-box einen geringen, aber signifikanten negativen Effekt auf die Translation ausübt. Sechs Gene, der neu identifizierten CIPs, beinhalten ebenfalls eine 9bp-box in ihrer upstream Region. Interessanterweise werden zwei der fünf csp-Gene, cspC und cspD, vom BvgAS Zweikomponentensystem, dem Haupttranskriptionsregulator der Virulenzgene im Genus Bordetella, reguliert. Die beiden Gene gehören zu den Bvg-negativ regulierten Genen, die in der Bvg-minus-Phase exprimiert werden. Weiterhin beeinflusst eine leichte Überexpression von CspB aus B. pertussis die Expression der Adenylatzyklase sowohl in B. pertussis, als auch in B. bronchiseptica negativ. Dieser für das CspB spezifische Effekt erinnert an das strukturell verwandte Tex-Protein (Fuchs et al, 1996; König et al, 2002). Beide Proteine beeinflussen die Expression der Virulenzfaktoren negativ, wobei für CspB gezeigt werden konnte, dass es einen direkten Einfluss auf die verminderte cyaA-Expression auf Transkriptionsebene besitzt. Dies zeigt eine Verbindung der Kälteschockantwort mit dem Virulenz-Regulon der Bordetellen, deren Rolle im Infektionszyklus bislang ungeklärt ist. N2 - Bacterial cold shock proteins (CSPs), like the well characterized heat shock proteins (HSPs) are highly induced in response to strong variation in temperature and cell growth at lower temperatures could be attributed to the different functions of CIPs. In this work we have studied the cold shock response of bacteria of the genus Bordetella. Both B. bronchiseptica and B. pertussis code for five CSPs (termed CspA to CspE) with significant amino acid homology to the major CspA of Escherichia coli. Mutations of a single csp gene (cspB) strongly affected the growth of B. bronchiseptica independent of temperature while a similar effect was observed in E. coli when four out of nine csp genes and in B. subtilis when all three csp genes were deleted. Transcription of cspA, cspB and cspC increased strongly after cold shock. The exposure to other stress conditions including translational inhibitors, heat shock and osmotic stress resulted in a complex pattern of changes in the transcription of the five cold shock genes. In the case of three csp genes (cspA, cspB, cspC), more than one specific transcript could be detected. To investigate the function of one of the cold shock proteins, CspB was purified as GSTfusion over a glutathion-sepharose column, because overexpression of pure CspB was shown to be toxic for the E. coli cell. Due to its high affinity but rather unspecific binding to ssDNA as tested by filter binding assays, it is possible that CspB functions as a chaperone. Induction of CspB was confirmed using a specific antibody and subsequently 17 other cold inducible proteins (CIPs) were identified by 2D-gelelectrophoresis and mass spectrometric characterization. Among these CIPs are some proteins which resemble the cold shock response of E. coli, like CspB, a chaperone with similarities to GroES and a translation inhibitor protein. Furthermore, interesting examples are the universal stress protein UspA and some proteins that are involved in the amino acid metabolism indicating signficant differences in the cold shock response of the two organism. The coding regions of all cold shock genes are preceeded by a long non-translated upstream region. Within this 5’UTR of four of the csp genes an identical sequence of 9 nucleotides with the consensus TCCTTGATT (9bp box) was identified which is located at similar positions with respect to their start codons. This identified 9bp-box was found to be irrelevant for transcription in the cold. Furthermore by in silico analysis a putative 54- binding site in the upstream region of cspB could be identified which has a regulatory function on cspB transcription. The long 5’ UTR itself seems to be important for transcript stabilization and efficient translation under cold shock conditions. Furthermore mutation or deletion of the 9bp box has a negative effect on translation. Six of the new identified CIPs are encoded by genes that contain the 9bp box in their 5’-UTR. Using bioinformatic tools (HMMR search) we identified 131 genes in the B. bronchiseptica RB50 genome that contain such a 9mer, but only 17 of the genes contain these consensus at appropriate position. Using this approach, infB, encoding for IF-2, could be identified as cold inducible. A connection between the occurence of the 9bp box and the cold induction could not be shown yet. Interestingly, two cold shock genes (cspC and cspD) were found to be under the negative control of the BvgAS system, the main transcriptional regulator of Bordetella virulence genes. Morover, a negative effect of a slight overexpression of CspB, but not of the other CSPs, on the transcription of the adenylate cyclase toxin CyaA in both B. pertussis and B. bronchiseptica was observed. Like the overexpression of previously described Tex protein (Fuchs et al, 1996; König et al, 2002), both proteins have a negative effect on the expression of the virulence factors. In this work, a direct influence of CspB on the cyaA transcription could be confirmed, suggesting a cross talk between the CSP mediated stress response stimulon and the Bordetella virulence regulon. KW - Bordetella bronchiseptica KW - Kälteschock-Proteine KW - Mikrobiologie KW - Bordetella KW - Regulation KW - Kälteschock KW - Bordetella KW - regulation KW - cold-shock Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12704 ER - TY - THES A1 - Jehle, Margot T1 - Interaktionen der Replikationsproteine der Maus T1 - Interactions of the replicationproteins from mouse N2 - Zusammenfassung Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozeß, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der ORC-Komplex an Replikationsorigins in chromosomaler DNA, wodurch die Assemblierung des präreplikativen Komplexes an den Origins ausgelöst wird. Anschließend lagern sich CDC6- und RLF-B/CDT1-Protein an den ORC an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase wird der Origin lizensiert, nachdem der letzte Initiationsfaktor CDC45 die Assemblierung des pre-RC vervollständigt hat. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Proteininteraktionen zwischen den verschiedenen Initiationsproteinen durch Two-Hybrid-Studien aufzuklären. Dazu wurden die cDNAs aller bisher in Mus musculus charakterisierten Initiationsproteine, wie ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, der "polo like kinase" CDC5/PLK, des DNA-Einzelstrang-bindenden Replikationsproteins RPA mit seinen Untereinheiten RPA14, RPA32, RPA70 und schließlich des heterodimeren Proteins Ku mit den Untereinheiten Ku80 und Ku70 jeweils in zwei verschiedene Hefevektoren inseriert. Zum einen handelt es sich dabei um den Ködervektor pEG202 und andererseits um den Beutevektor pJG4-5 des Two-Hybrid-Systems. Dabei wurden alle möglichen Köder-/Beute-Proteinkonstellationen auf eine Aktivierung des Reportergens LacZ hin untersucht und so zahlreiche Protein-Proteininteraktionen identifiziert. Einige der hier beschriebenen Wechselwirkungen waren auch in anderen Spezies identifiziert worden und konnten somit für Maus bestätigt werden. Im Rahmen dieser Two-Hybrid-Untersuchungen wurden allerdings auch erstmals neue Protein-Proteininteraktionen nachgewiesen, wie beispielsweise CDC5/PLK mit MCM2 oder Ku80 mit ORC1, -2, -4 und -5. Sowohl von CDC5/PLK- als auch von Ku80-Protein wurde vermutet, daß sie im Zusammenhang mit der Initiation der DNA-Replikation stehen könnten. Die Two-Hybrid-Interaktionen hier vermittelten neue Indizien, die diese Vermutung untermauern. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden fünf CDC7-Deletionsmutanten konstruiert, um die Interaktionsdomänen des CDC7-Proteins mit anderen Proteinen im Rahmen des Two-Hybrid-Systems bestimmen zu können. Die Mutanten wurden dazu jeweils in den pEG202- und den pJG4-5-Hefevektor inseriert. Die Hefe-Studien wurden nur mit denjenigen Proteinen durchgeführt, mit denen das CDC7-Wildtyp-Protein im ersten Teil der Arbeit positive Interaktionen eingegangen war. Auffallend bei den Untersuchungen mit den Deletionsmutanten war, daß sie in der Köderposition mehr Interaktionen eingingen als in der Beuteposition. Nur die C1-, C2- und N2-Mutante gingen noch Wechselwirkungen mit einigen Initiatorproteinen ein, während weder die C2- noch die N1-Mutante dazu in der Lage waren. Als Resultat dieser CDC7-Interaktionsdomänenkartierung stellte sich das Kinase-Insert II als ein für die Mehrheit der Protein-Proteininteraktionen des CDC7-Proteins zentrales Element heraus. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war es, paradigmatisch einzelne Protein-Proteininteraktionen, die in den Two-Hybrid-Studien aufgefunden worden waren, mittels einer zweiten Methode zu analysieren. Zusätzlich sollte die Zellzyklusabhängigkeit einzelner Interaktionen der an der Initiation der DNA-Replikation beteiligten Proteine untersucht werden. Dazu wurden Immunpräzipitationsversuche mit synchronisierten FM3A-Mauszellen durchgeführt. Die in Suspensionskultur kultivierten Mauszellen wurden mit Mevastatin in früher G1-, mit Mimosin in G1/S-, mit Hydroxyharnstoff in der S- und mit Nocodazol in der Mitose arretiert. Ausgangsbasis für die weiteren IP-Experimente waren aus den FM3A-Zellen präparierte Kernextrakte. Folgende Antikörper wurden zur Inkubation mit Kernextrakten verwendet: gegen ORC1-, ORC2-, ORC3-, ORC5-, ORC6-, CDC6-, MCM2-, MCM7- und DBF4 gerichtete Antikörper. Mit allen genannten Antikörpern konnten Immunpräzipitationen zwischen einzelnen ORC-Untereinheiten, CDC6- und ORC-Proteinen, einzelnen MCM-Untereinheiten und ORC2- bzw. CDC6-Protein und zwischen der regulatorischen Untereinheit der DDK-Kinase DBF4 und einigen ORC-Untereinheiten nachgewiesen werden. Ein großer Teil der IPs trat in zellzyklusunabhängiger Weise auf, während ein kleinerer Anteil Zellzyklusabhängigkeit zeigte, wie beispielsweise die CDC6-ORC2-Wechselwirkung, die nur von der frühen bis zur späten G1-Phase beobachtet werden konnte. Im vierten und letzten Abschnitt dieser Arbeit ging es um die Identifizierung eines Maus-EST-Klones für das CDT1-Gen. Das CDT1-Protein ist essentieller Bestandteil der Initiation der DNA-Replikation und sorgt gemeinsam mit dem CDC6-Protein für die Rekrutierung des MCM-Komplexes an den Origin, wodurch der präreplikative Komplex für die anstehende Initiation der DNA-Replikation lizensiert wird. Der vollständige Maus-EST-Klon wurde mittels einer Sonde durch radioaktive Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von 9 Tage alten Mausembryonen identifiziert und charakterisiert. Die vollständige Sequenz von MmCDT1 ergab einen offenen Leserahmen von 1673bp und kodiert für ein Protein mit 557 Aminosäuren und einer Molmasse von 61.5 kDa. N2 - Summary The initiation of DNA replication is a highly conserved process which is subdivided into three steps. The first step is the binding of the origin recognition complex to the replication origins in chromosomal DNA which triggers off the assembly of the prereplicative complex at the origins. Subsequently the CDC6 and the RLF-B/CDT1 proteins bind to ORC which are both responsible for the recruitment of the heterohexameric MCM complex to the prereplicative complex (pre-RC). The CDC7/DBF4 kinase licenses the origin after completion of the pre-RC by binding of the CDC45 protein. One task of this work was to dissolve the complex network of protein-protein interactions between the different initiator proteins with the method of the two-hybrid-system. Therefore the cDNAs encoding all described initiator proteins of Mus musculus, ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, the "polo like kinase" CDC5/PLK, the single-stranded replication protein RPA with its subunits RPA14, RPA32 and RPA70 as well as the heterodimeric Ku protein with the Ku70 and the Ku80 subunits were inserted into the two-hybrid vectors pEG202 and pJG4-5. All possible bait/prey protein combinations were tested for the activation of the LacZ reporter gene. Numerous protein-interactions were detected which have been described already in other species and were confirmed here for the mouse system. There were also new protein-protein interactions observed, for example the interaction between the CDC5/PLK protein and the MCM2 protein or between the Ku80 subunit and the ORC1, 2, 4 and 5 proteins. Both the CDC5/PLK and the Ku80 protein are thought to be involved in the initiation of DNA replication. The demonstrated protein interactions provide evidence for this hypothesis. In the second part of this work five deletion mutants of the CDC7 protein were constructed to determine the interaction domains relevant for protein interactions with other proteins in the two-hybrid system. The mutants were inserted into the vectors pEG202 and pJG4-5. Only those proteins were tested for interaction with the CDC7 deletion mutants which have already shown interactions with the wild-type CDC7 protein. Proteins in the bait position showed much more interactions as proteins in the prey position. Protein interactions were observed with the C1, C2 and the N2 mutants whereas the C3 and the N1 mutants were not able to interact with any of the initiator proteins. The kinase-insert II was shown to be a central element for the majority of the protein-protein interaction of the CDC7 protein, possibly being responsible for most of the CDC7 interactions. Further task was the analysis of some paradigmatically chosen protein-protein interactions obtained in the two-hybrid studies with the help of a second experimental method, i.e. the immunoprecipitation technique. Additionally the cell cycle dependence some of the interactions involved in the initiation of DNA replication was examined. Immunoprecipitation experiments were performed with synchronized mouse FM3A cells which were arrested in early G1 phase by mevastatin, at the G1/S transition by mimosine, in S phase by hydroxyurea and in mitosis by nocodazol. Nuclear extracts made from the FM3A cells were used for the immunoprecipitations. The following antibodies were used for incubation with the nuclear extracts: antibodies raised against ORC1, ORC2, ORC3, ORC5, ORC6, CDC6, MCM2, MCM7 and DBF4, respectively. Immunoprecipitations were found among some of the ORC subunits, CDC6 and ORC proteins, some MCM subunits and ORC2 and CDC6 proteins, respectively, as well as among the regulatory subunit DBF4 of the DDK kinase and some of the ORC subunits could be demonstrated with all the above mentioned antibodies. Most of the immunoprecipitations were found to be cell cycle-independent, whereas only some of them were cell cycle-dependent. For example the CDC6-ORC2 interaction which was only observed from early G1 phase to the G1/S transition. The last part of this work was the identification of a mouse EST clone for the CDT1 gene. The CDT1 protein together with CDC6 is essential for loading MCM2-7 proteins into prereplicative complexes during replication licensing. Screening a cDNA library of 9 days old mouse embryos with a radioactive labeled probe resulted in the complete mouse EST clone of CDT1. The full length sequence of MmCDT1 revealed an open reading frame encoding a predicted protein of 557 amino acids with a molecular mass of 61.5 kDa. KW - Maus KW - Replikation KW - Regulation KW - Initiation der DNA Replikation KW - Initiationsproteine der Maus KW - Two-Hybrid-System KW - Protein-Protein-Interaktionen KW - Immunpräzipitationen KW - initiation of DNA-replication KW - initiation proteins of mouse KW - two-hybrid-system KW - protein-protein-interactions KW - immunprecipitations Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4068 ER - TY - THES A1 - Brand, Normen T1 - Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine T1 - Localization, regulation and interactions of murine DNA replication proteins N2 - Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert. N2 - Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - Interaktion KW - Regulation KW - DNA-Replikation KW - Zellzyklus-Kontrolle KW - präreplikativer Komplex KW - Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer KW - DNA replication KW - cell cycle control KW - pre-replicative complex KW - bioluminescence resonance energy transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057 ER - TY - THES A1 - Filatova, Alina T1 - Mechanism and Control of Nuclear-Cytoplasmic Translocation of the Transporter Regulator RS1 T1 - Mechanismus und Kontrolle der Translokation der Transporterregulator RS1 zwischen Kern und Zytoplasma N2 - Das RS1 Protein (Gen RSC1A1) beteiligt sich an der Regulation des Na+-D-Glukose-kotransporters SGLT1 und einiger anderer Transporter. In subkonfluenten LLC-PK1 Zellen hemmt RS1 die Freisetzung von SGLT1 aus dem trans-Golgi-Netzwerk und die Transkription von SGLT1. Während es sich in konfluenten Zellen hauptsächlich im Zytoplasma befindet, ist RS1 in subkonfluenten Zellen im Kern und im Zytoplasma lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismus und Regulation der konfluenzabhängigen Kernlokalisation von RS1 untersucht. Dabel konnte gezeigt werden, dass die von Konfluenz abhängige Kernlokalisation von RS1 durch den Zellzyklus reguliert wird. In RS1 aus Sus scrofa (pRS1) wurde eine Sequenz identifiziert („nuclear shuttling signal“, NS), die für die konfluenzabhängige Verteilung von RS1 verantwortlich ist und sowohl das Signal für die Kernlokalisation (NLS) als auch das Signal für den Export aus dem Kern (NES) beinhaltet. Die NLS und NES Signale von RS1 vermitteln die Translokation des Proteins in den Kern und aus dem Kern mit Hilfe von Importin β1 bzw. CRM1, wobei die Verteilung von RS1 zwischen Kern und Zytoplasma durch die Aktivität des Exportsystems bestimmt wird. Es wurde gezeigt, dass die benachbarte Proteinkinase C (PKC) Phosphorylierungsstelle an Serin 370 von pRS1 die NS-gesteuerte Kernlokalisierung kontrolliert und für die vom Zellzyklus abhängige Kernlokalisation notwendig ist. Aufgrund der Ergebnisse der ortsgerichteten Mutagenese, PKC-Aktivierungsexperimenten und Massenspektrometrie-Analyse des Phosphorylierungsmusters von RS1 wurde ein Modell vorgeschlagen, das die Regulation der Kernlokalisation des RS1 Proteins in LLC-PK1 Zellen beschreibt. Dem Modell zufolge wird RS1 in subkonfluenten Zellen stark in den Kern befördert, während der Export von RS1 aus dem Kern nicht stattfindet. Das führt zur Anreicherung von RS1 im Kern. Nach Konfluenz wird Serin 370 durch PKC phosphoryliert, was die Steigerung des RS1-Exports aus dem Kern begünstigt und die überwiegend zytoplasmatische Lokalisation des Proteins in konfluenten Zellen hervorruft. Die konfluenzabhängige Regulation der Lokalisation von RS1 kann die Expression von SGLT1 während der Regeneration von Enterozyten im Dünndarm und der Regeneration von Zellen der Nierentubuli nach hypoxämischem Stress kontrollieren. Außerdem deutet die Analyse der Genexpression in embryonalen Fibroblasten der RS-/- Mäuse deutet darauf hin, dass die transkriptionale Regulation durch RS1 im Zellzyklus und bei der Zellteilung eine wichtige Rolle spielen kann. Da die Lokalisation von RS1 zellzyklusabhängig ist, kann RS1 für die Regulation der Transporter in spezifischen Phasen des Zellzyklus wichtig sein. N2 - The RS1 protein (gene RSC1A1) participates in regulation of Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and some other solute carriers. In subconfluent LLC-PK1 cells, RS1 inhibits release of SGLT1 from the trans-Golgi network and transcription of SGLT1. In subconfluent cells, RS1 is localized in the nucleus and the cytoplasm whereas confluent cells contain predominantly cytoplasmic RS1. In the present study, the mechanism and regulation of confluence-dependent nuclear location of RS1 was investigated. Confluence dependent nuclear location of RS1 was shown to be regulated by the cell cycle. A nuclear shuttling signal (NS) in pRS1 was identified that ensures confluence-dependent distribution of pRS1 and comprises nuclear localization signal (NLS) and nuclear export signal (NES). The NLS and NES of RS1 mediate translocation into and out of the nucleus via importin ß1 and CRM1, respectively, and the nuclear/cytoplasmic distribution of the RS1 protein is determined by the nuclear export activity. The adjacent protein kinase C (PKC) phosphorylation site at serine 370 of pRS1 was shown to control nuclear localization driven by NS and is necessary for the differential localization of RS1 in quiescent versus proliferating cells. Basing on the data of site-directed mutagenesis, PKC activation experiments and mass spectrometry analysis of RS1 phosphorylation, the following model of the regulation of RS1 nuclear location in LLC-PK1 cells was proposed. In subconfluent cells, RS1 is actively imported into the nucleus whereas nuclear export of RS1 is not active leading to accumulation of RS1 in the nucleus. After confluence, phosphorylation of serine 370 of pRS1 by PKC takes place leading to enhancement of RS1 nuclear export and predominantly cytoplasmic distribution of the protein in the confluent cells. The confluence-dependent regulation of RS1 localization may control SGLT1 expression during regeneration of enterocytes in small intestine and during regeneration of renal tubular cells after hypoxemic stress. Moreover, the gene expression profiling of mouse embryonic fibroblasts with RS1-/- genotype suggests that transcriptional regulation by RS1 might be important for the cell cycle and cell division. Since RS1 localization depends on the cell cycle, RS1 might play a role in the regulation of the solute carriers during specific phases of the cell cycle. KW - RS1 KW - NES KW - NLS KW - Kern KW - Regulation KW - SGLT1 KW - Zellzyklus KW - Glukose KW - RS1 KW - NES KW - NLS KW - nucleus KW - transporter regulator KW - SGLT1 KW - glucose KW - nuclear export signal KW - nuclear localization signal KW - cell cycle KW - glucose Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38512 ER - TY - THES A1 - Schäffler, Katrin M. T1 - Regulation der eukaryotischen Translation durch RNA-bindende Faktoren: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des La-verwandten Proteins 4B (LARP4B) T1 - Regulation of the eukaryotic translation by RNA-binding factors: structural and functional characterization of the La-related protein 4B (LARP4B) N2 - In Zellen liegen RNAs in Form von Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) vor, wobei das Zusammenwirken von RNA und Proteinen die Funktionen der einzelnen RNPs definiert. RNA-bindenden Proteinen kommt demnach eine zentrale Bedeutung beim Verständnis des RNA-Metabolismus zu. Zu dieser Proteingruppe zählen auch die La-verwandten Proteine (engl. La-related proteins, LARPs), welche eine evolutionär konservierte Familie von Faktoren bilden und durch eine putative RNA-bindende Domäne, dem La Modul, charakterisiert sind. Bereits für zwei Vertreter dieser Proteinklasse (LARP3 und LARP7) konnte eine über das La Modul vermittelte spezifische Interaktion mit uridylreichen RNA-Sequenzen gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Vertreter der LARP-Familie, das sogenannte LARP4B, sowohl biochemisch als auch strukturell zu untersuchen und es somit einem zellulären Prozess zuzuordnen. Zellbiologische Studien zeigten zunächst, dass LARP4B unter normalen Wachstumsbedingungen eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufweist. Unter Stressbedingungen akkumuliert LARP4B hingegen in diskreten subzellulären Domänen, den sogenannten Stress Granules (SGs). Obwohl SGs bislang noch wenig funktionell untersucht sind, wird davon ausgegangen, dass sie der reversiblen Speicherung von mRNA-gebundenen Translationsfaktoren dienen. Durch affinitätschromatographische Strategien ließen sich spezifische Interaktionspartner von LARP4B identifizieren. Als direkte Bindungspartner wurden das zytoplasmatische Poly (A) bindende Protein 1 (PABPC1) und der Rezeptor für aktivierte C Kinase 1 (RACK1) gefunden. Darüber hinaus zeigten Sedimentationsanalysen, dass LARP4B nahezu quantitativ mit Ribosomen und Polyribosomen assoziiert vorliegt. Diese Studie identifizierte daher LARP4B als ein Protein, das mit Schlüsselfaktoren der eukaryotischen Translation wechselwirkt. In Übereinstimmung mit diesen Befunden reduziert ein RNAi-induzierter Mangel des Proteins die Translationsrate drastisch, während die Überexpression von LARP4B in vivo zu einer Stimulation der Proteinbiosynthese führt. Da dieser stimulatorische Einfluss bei einer Vielzahl unterschiedlicher mRNA-Spezies detektiert werden konnte, kann LARP4B als genereller, positiver Translationsfaktor angesehen werden. Interessanterweise wurden in Studien, die zeitgleich für das verwandte LARP1 durchgeführt wurden, vergleichbare zelluläre Interaktionen wie für LARP4B beschrieben. Um zu klären, ob beide LARPs Orthologe darstellen und funktionelle Redundanz zeigen, wurde in der vorgelegten Arbeit ein Vergleich von LARP4B mit LARP1 durchgeführt. Unabhängige in vivo Studien und Sedimentationsanalysen zeigten deutlich, dass beide Proteine im mRNA-Metabolismus agieren, jedoch in diesem unterschiedliche Phasen der eukaryotischen Proteinbiosynthese beeinflussen. N2 - The cooperation of RNA with different classes of proteins in so called ribonucleoprotein complexes (RNPs) is essential for the function of these RNPs. Therefore, RNA-binding proteins play a crucial role to understand the complex mechanisms of RNA-metabolism. One family of such proteins comprise the La-related proteins (LARPs). These evolutionary conserved factors are characterized by a putative RNA-binding domain, named the La module. For two of these factors (LARP3 and LARP7) a specific interaction with RNA containing uridine-rich sequence elements mediated via their La module could be described. The present work describes the biochemical and structural characterization of LARP4B, a thus far uncharacterized member of the LARP family. Immunofluorescence analyses identified LARP4B as a cytosolic protein that accumulates upon arsenite treatment in cellular stress granules (SGs). While still not sufficiently determined, these domains are believed to serve as storage pools for stalled, mRNA-bound translation initiation complexes formed upon polyribosome disassembly. Biochemical experiments further uncovered an interaction of LARP4B with the Poly(A) binding protein cytosolic 1 (PABPC1) and the receptor for activated C Kinase 1 (RACK1). Moreover, under physiological conditions, LARP4B co-sediments almost quantitatively with polysomes in cellular extracts, suggesting a role in translation. In agreement with this notion, knockdown of LARP4B by RNA-interference impaired translation of cellular mRNAs whereas over-expression stimulated protein synthesis. As this stimulatory effect could be detected for a wide range of different mRNA-species, LARP4B hence represents a general stimulator of translation. Interestingly, parallel studies uncovered comparable cellular interactions for another LARP family member (LARP1). To test whether LARP4B and LARP1 represent orthologs possessing redundant function, these two factors have been compared in this work using several independent in vivo and in vitro studies. These data clearly showed that both proteins positively influence RNA-metabolism but influence different phases of protein biosynthesis. KW - Translation KW - Eukaryoten KW - Ribonucleoproteine KW - Regulation KW - LARP4B KW - La Protein KW - PABPC1 KW - RACK1 KW - translation KW - LARP4B KW - La protein KW - PABPC1 KW - RACK1 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69809 ER - TY - THES A1 - Spannaus, Ralf T1 - Regulation der foamyviralen Proteaseaktivität T1 - Regulation of the foamy viral Protease Activity N2 - Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation könnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschränktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2’ und P2 auf die Aminosäurereste Valin und Valin/Asparagin beschränkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschränkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollständige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivität-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollständige cDNA bilden können. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilität der wenigen Env-Trimere auf der Hüllmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molekül als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschränkten Env-Mobilität, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da für die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleinsäure benötigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Domänen für die Aktivierung der Protease benötigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivität resultierte, war die funktionelle RNaseH-Domäne essenziell für die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Domänen von anderen Retroviren resultierte in genomunabhängiger Proteaseaktivität in Zellen und genomabhängiger Proteaseaktivität in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden. N2 - Retroviral Pol and structural proteins are processed by the viral protease. Here, central mechanisms of the foamy viral protease regulation were investigated and characterized. For determination of the relative Pol and Env encapsidation a novel chromatographic purification method was developed. In comparison with human immunodeficiency viruses, foamy viruses encapsidate less Pol but significantly more Env. Foamy viruses might compensate these low Pol amount by limiting Gag and Pol processing to a single cleavage site. I sought to investigate, whether a limited cleavage site repertoire of foamy viral protease might be a consequence of this restriction. In cell culture positions P2’ and P2 within the cleavage sites are invariant and restricted to valine and valine/asparagine, supporting the conclusion that foamy viral protease cleavage at more specific sites than its human immunodeficiency viral counterpart. Secondly, I could show that complete foamy viral reverse transcription is dependent on Gag maturation, since viruses deficient in protease activity or with an inactive Gag cleavage site were incapable of producing cDNA beyond the first strong stop. Thus, low protease encapsidation is compensated by a delay of the reverse transcription until sufficient Gag maturation occurred. The human immunodeficiency viral Gag processing triggers the mobility of the few Env trimmers on the viral membrane. This Env clustering was shown to be essential for infectivity. Here, foamy viral Env was quantified and found that foamy viruses incorporate 28 times more Env per Gag molecule than the human immunodeficiency viruses. It seems to be likely that these higher Env amounts are required to compensate for the lack of Env mobility due to the restricted Gag processing at a single site at the carboxyl terminus. The dimerization and activation of the foamy viral protease depends on the binding of viral RNA and protein-protein interactions. Since the protease is active in the Pol and in the PRRT context the Pol domains essential for protease activity were mapped. While deletion of the integrase in context of recombinant viruses resulted in reduced protease activity further deletion of the RNase H domains abolished protease function. Substituting the RNase H domain with the RNase H of other retroviruses could restore protease activity even in the absence of viral RNA in cells , but not in viruses. Thus, the RNase H domains serve as protein-protein interaction domain or might dimerize the PRRT domains by binding to unspecific RNA. KW - Spumaviren KW - Proteasen KW - Regulation KW - Reverse Transkriptase KW - Enzymaktivierung KW - Protease KW - protease KW - Foamyviren KW - foamy viruses KW - Regulation KW - regulation KW - reverse Transkription KW - reverse transcription KW - Proteaseaktivität KW - protease activity Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113401 ER - TY - THES A1 - Stingl, Nadja T1 - Regulation der Jasmonatbiosynthese durch Lipasen in Arabidopsis thaliana T1 - Regulation of the biosynthesis of jasmonates by lipases in Arabidopsis thaliana N2 - Lipasen regulieren die Biosynthese von Jasmonaten, die eine elementare Signalfunktion bei der Entwicklung von Pflanzen und der Abwehr von Pathogenen haben. Entsprechend dem klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ dienen die aus Galaktolipiden freigesetzten Fettsäuren α-18:3 und 16:3 als Substrate der Jasmonsäure (JA)-Synthese. In den letzen zehn Jahren wurden jedoch die Intermediate der JA-Biosynthese 12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA, ausgehend von α-18:3) und Dinor-12-Oxo-Phytodiensäure (dnOPDA, ausgehend von 16:3) verestert in Galaktolipiden der Art Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Die Biosynthese und die mögiche Speicherfunktion dieser komplexen, als Arabidopside bezeichneten, Lipide war jedoch noch unklar. In der Literatur wird ein alternativer Syntheseweg postuliert, in dem analog zum klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ die Biosynthese von veresterter OPDA/dnOPDA ausgehend von veresterter α-18:3/16:3 vollständig in Galaktolipiden der Pastidenmembran stattfindet. Nach Freisetzung von OPDA/dnOPDA durch eine Lipase könnten OPDA/dnOPDA dann als Intermediate in die JA-Biosynthese einfliessen. Sowohl im klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ als auch im postulierten alternativen Syntheseweg ist die Aktivität von Lipasen von essentieller Bedeutung für die JA-Biosynthese. Für zwei plastidäre sn1-spezifische Acyl-Hydrolasen, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) und DONGLE (DGL), wurde eine zentrale Funktion innerhalb der Jasmonat-Biosynthese in Blättern von A. thaliana beschrieben. Dem zufolge ist DGL für die basalen und die frühen wundinduzierten JA-Gehalte und DAD1 für die Aufrechterhaltung der erhöhten JA-Konzentrationen in der späteren Verwundungsantwort verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wiesen drei unabhängige DGL-RNAi-Linien sowie DAD1-Knock-out-Mutanten sowohl unter basalen Bedingungen als auch zu frühen Zeitpunkten nach Verwundung sowie nach Infektion mit dem Bakterienstamm P. syringae DC3000 (avrRPM1) mit dem Wildtyp vergleichbare Konzentrationen an OPDA/JA auf. Dies steht im klaren Widerspruch zu den publizierten Daten. Die Beteiligung von DAD1 an der OPDA/JA-Biosynthese zu späten Zeitpunkten nach Verwundung konnte jedoch bestätigt werden. Ferner konnte eine dramatische Über-Akkumulation von Arabidopsiden in DAD1-defizienten Mutanten nach Verwundung nachgewiesen werden, was auf eine Beteiligung von DAD1 bei der Freisetzung von membrangebundener OPDA/dnOPDA hinweist. Die Analyse der Einzelmutanten 16 weiterer plastidärer Lipasen unter basalen Bedingungen, nach Verwundung und nach Infektion mit P. syringae DC3000 (avrRPM1) zeigte, dass keine der analysierten Mutanten eine essentielle Rolle in der JA-Biosynthese spielt. Jedoch wiesen Mutanten der sn1-spezifischen Lipasen AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) signifikant niedrigere Konzentrationen an dnOPDA, OPDA und JA nach Verwundung auf, was eine indirekte Beteiligung an der JA-Biosynthese vermuten lässt. Blattgewebe einer Quadrupel-Mutanten, welche defizient in vier DAD1-ähnlichen Lipasen (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) ist, wies nach Verwundung mit der AtPLA1-Iγ1-Mutante vergleichbar niedrige Gehalte an dnOPDA, OPDA sowie JA auf. Da stets in sn2-Position vorliegende 16:3/dnOPDA ebenfalls Substrat der JA-Biosynthese sein kann, müssen zusätzlich zu DAD1 und AtPLA1-Iγ1 noch weitere nicht identifizierte sn1- und sn2-spezifische Acyl-Hydrolasen an der JA-Biosynthese nach Verwundung und Pathogeninfektion beteiligt sein. Dies bedeutet, dass entgegen der in der Literatur vertretenen Meinung, nicht eine sondern mehrere Lipasen in redundanter Weise die Biosynthese von Jasmonaten regulieren. Zur Aufklärung der Biosynthese und möglichen Speicherfunktion der ausschließlich in Arabidopsis vorkommenden Arabidopside wurden A. thaliana Keimlinge mit D5-Linolensäure-Ethylester inkubiert, um eine D5-Markierung der komplexen Lipide zu erzielen. Durch einen anschließenden Stressstimulus mittels Zugabe von Silbernitrat wurde die Jasmonat-Synthese induziert. Die vergleichende Analyse der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide MGDG, DGDG, PC sowie der freien OPDA und JA vor und nach Zugabe des Silbernitrats zeigte, eine hohe Übereinstimmung der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B (MGDG-OPDA-OPDA) und Arabidopsid G (OPDA-MGDG-OPDA-OPDA) vor der Silbernitratbehandlung mit denjenigen der durch Silbernitratbehandlung neu gebildeten OPDA/JA. Dagegen wird die hochmarkierte freie Linolensäure nicht direkt zu freier OPDA umgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G direkte Vorstufen von freier OPDA sein können. Damit übereinstimmend konnte gezeigt werden, dass nach Silbernitratstress die Spiege der Vorstufe 18:3-18:3-MGDG abnehmen und zeitgleich die entsprechenden unmittelbaren Metabolite 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G akkumulieren. N2 - Lipases regulate the biosynthesis of jasmonates. Jasmonates have an essential role in the development and defense of plants. According to the classical „Vick-Zimmerman-Pathway“ α-18:3/16:3 released by hydrolases out of galactolipids serve as substrate for the biosynthesis of jasmonic acid. In the last ten years also the metabolites of the biosynthesis of jasmonic acid OPDA (derived from α-18:3) and dnOPDA (derived from 16:3) were found to be esterified in galactolipids of arabidopsis. The synthesis and function of these complex lipids, named arabidopsides, is yet not known. An alternative Pathway is postulated in the literature. According to this the synthesis of dnOPDA/OPDA takes place in galactolipids. Free dnOPDA/OPDA released by hydrolases may then serve as substrates for the biosynthesis of jasmonic acid. In the classical „Vick-Zimmerman-Pathway“ as well as in the alternative Pathway the activity of lipases have an essential impact on the biosynthesis of jasmonates. Two plastidic acyl-hydrolases with sn1-substrate specificity, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) and DONGLE (DGL), were published to have a essential role in the biosynthesis of jasmonates in leaves of Arabidopsis thaliana. DGL should be responsible for the formation of jasmonic acid under basal conditions and at early timepoints after wounding, DAD1 should maintain the elevated concentrations of jasmonic acid at later timepoints after wounding. In this work the involvement of DAD1 in the biosynthesis of OPDA/JA at later timepoints after wounding was confirmed. However, no differences could be detected in three independent DGL-RNAi-lines and DAD1-knock-out-mutants in comparison to the wild type under basal conditions and at early timepoints after wounding which is contradictory to the published data. In addition, in these mutants wild type oxylipin levels were found after infection with an avirulent bacterial strain of Pseudomonas syringae. Furthermore DAD1-deficient mutants displayed dramatic accumulation of arabidopsides at later timepoints after wounding. Therefore it is suspected that DAD1 is responsible for the release of OPDA esterified in galactolipids. The analysis of single mutants of 16 additional lipases localised in plastids showed no strong differences in comparison to the wildtype under basal conditions, after wounding as well as after infection with P. syringae. Hence, none of the tested lipases plays an essential role in the biosynthesis of jasmonates. However mutants of the sn1-specific acyl-hydrolase AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) showed significant lower concentrations of dnOPDA, OPDA and JA after wounding in comparison to the wildtype. This indicates an involvement of AtPLA1-Iγ1 in the biosynthesis of jasmontes. A quadruple mutant defective in four DAD1-like lipases (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) displayed jasmonate levels similar to the mutant line of AtPLA1-Iγ1 after wounding. The lipids 16:3/dnOPDA are always esterified in sn2 position of glycerolipids. Furthermore 16:3/dnOPDA may also serve as substrates for the biosynthesis of jasmonic acid. The results suggest that, in addition to DAD1 and AtPLA1-Iγ1, still unidentified enzymes with sn1- and sn2-hydrolase activity are involved in wound- and pathogen-induced jasmonate formation, indicating functional redundancy within the lipase family. To clarify the biosynthesis and storage function of arabidopsides, seedlings of A.thaliana were incubated with D5-linolenic acid ethyl ester to produce labelling of complex membrane lipids. Subsequent application of silver nitrate induced the biosynthesis of jasmonates. The analysis of the complex lipids MGDG, DGDG, PC as well as OPDA/JA before and after treatment with silver nitrate showed a high consistency of labelling of the complex lipids 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, arabidopside B (OPDA-OPDA-MGDG) as well as arabidopside G (OPDA-OPDA-MGDG-OPDA) before application of silver nitrate with labelling of the newly synthesised OPDA/JA induced by treatment with silver nitrate. The results suggest, that MGDG-18:3-18:3, 18:3-OPDA-MGDG, arabidopsid B and arabidopsid G are precursors or metabolites of free OPDA, which is a precursor of JA. Furthermore, simultaneous decrease of 18:3-18:3-MGDG and concomitant increase of arabidopsid B and arabidopsid G after application of silver nitrate could be shown. This suggests synthesis of OPDA/dnOPDA in-situ via the alternative pathway. KW - Lipasen KW - Jasmonate KW - Stoffwechselweg KW - Regulation KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonatbiosynthese KW - Arabidopsis thaliana KW - Arabidopside KW - Lipases KW - Jasmonates KW - Biosynthesis of Jasmonates KW - Arabidopsis thaliana KW - Arabidopsides Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56393 ER - TY - THES A1 - Brockmann, Jörg T1 - Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptorkinasen T1 - Regularion of G-protein coupled receptorkinases N2 - GRK2 wird an Serin29 durch PKC phosphoryliert. Die Phosphorylierung verhindert die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin. Die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin wird durch den N-Terminus der GRK2 vermittelt und ist auf eine gestörte Aktivierbarkeit der GRK2 durch G-Protein beta/gamma-Untereinheiten zurückzuführen. N2 - GRK2 is phosphorylated by PKC at serin29. The phosphorylation prevents GRK2 inhibition by calmodulin. Inhibition of GRK2 by calmodulin is mediated by the N-terminus of the kinase and is due to a disturbed activation of GRK2 by G-protein beta/gamma subunits. KW - Rezeptor-Kinasen KW - G-Proteine KW - Calmodulin KW - Proteinkinase C KW - Phosphorylierung KW - GRK2 KW - Calmodulin KW - PKC KW - Regulation KW - Phosphorylierung KW - GRK2 KW - calmodulin KW - PKC KW - regulation KW - phosphorylation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15320 ER -