TY - THES A1 - Grotemeyer, Alexander T1 - Characterisation and application of new optogenetic tools in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Charakterisierung und Anwendung neuer optogenetischer Werkzeuge in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the ‘classical’ Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions. N2 - Seit dem Channelrhodopsine das erste Mal beschrieben und erfolgreich in lebende Tiere eingebracht wurden (Nagel et al., 2003 und 2005), kam es zu einem beträchtlichen Fortschritt in diesem interessanten Gebiet der Neurowissenschaften. In der nachfolgenden Zeit wurden viele verschiedene optogenetische Werkzeuge beschrieben und zur Bearbeitung neurowissenschaftlicher Fragestellungen angewandt. Des Weiteren haben neben dem „klassischen“ Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein im Wesentlichen Kation selektiver Kanal, auch modifizierte ChR2 Abkömmlinge, Anion selektive Kanäle und Licht sensitive metabotrope Proteine, die opotogenetische Werkzeugkiste erweitert. Dennoch greifen die meisten Wissenschaftler trotz der Vielfalt an optogenetischen Werkzeugen meist noch zu Channelrhodopsin-2, da seine Wirkungseigenschaften sehr gut erforscht sind. In der nachfolgenden Arbeit wird ein weiterentwickeltes Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), beschrieben. Aufgrund seiner vielfältigen Eigenschaften stellt es ein vielversprechendes Werkzeug dar, vor allem für zukünftige neurowissenschaftliche Forschungsarbeiten. Hierbei wurde ChR2XXM eingesetzt, um zu untersuchen welche Auswirkungen das Fehlen von Latrophilin im Chordotonal Organ von Drosophilalarven hat. Schließlich wurde noch die Funktionalität von GtACR an der neuromuskulären Endplatte der Drosophila überprüft. Für die umfassende Charakterisierung wurden elektrophysiologische und verhaltensbasierte Experimente an Larven durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass ChR2XXM aufgrund einer erhöhten Affinität zu dem Chromophore Retinal, im Vergleich zu ChR2 ein besseres zelluläres Expressionsmuster, eine bessere zeitliche Auflösung und eine erheblich höhere Lichtsensitiviät aufweist. Durch den Einsatz von ChR2XXM konnte, aufgrund der hohen Lichtsensitiviät, mit nur minimalen Nebeneffekten, wie z.B. mögliche Wärmeaktivierung des Chordotonalorgans, der Einfluss von Latrophilin (dCIRL) auf die Signaltransmission im Chordotonalorgan, aufgeklärt werden. Ferner führte eine optogenetische, in vivo, Aktivierung des Chordotonalorgans zu Verhaltensänderungen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass GtACR1 zwar effektiv motoneuronale Erregung inhibieren kann, dies aber von unerwarteten Nebeneffekten begleitet wird. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass weitere Forschung und Verbesserungen im Bereich der optogenetischen Werkzeuge sehr wertvoll und notwendig ist, um Wissenschaftlern zu erlauben das am besten geeignetste optogenetische Werkzeug für ihre wissenschaftlichen Fragestellungen auswählen zu können. KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - optogenetics KW - Drosophila melanogaster KW - Channelrhodopsin KW - Electrophysiology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178793 ER - TY - THES A1 - Yu-Strzelczyk, Jing T1 - Generation and Characterization of novel proteins for light-activated hyperpolarization of cell membranes T1 - Generierung und Charakterisierung neuartiger Proteine für Licht-aktivierte Hyperpolarisation von Zellmembranen N2 - The light-gated cation channel Channelrhodopsin-2 was discovered and characterized in 2003. Already in 2005/2006 five independent groups demonstrated that heterologous expression of Channelrhodopsin-2 is a highly useful and simply applicable method for depolarizing and thereby activating nerve cells. The application of Channelrhodopsin-2 revolutionized neuroscience research and the method was then called optogenetics. In recent years more and more light-sensitive proteins were successfully introduced as “optogenetic tools”, not only in neuroscience. Optogenetic tools for neuronal excitation are well developed with many different cation-conducting wildtype and mutated channelrhodopsins, whereas for inhibition of neurons in the beginning (2007) only hyperpolarizing ion pumps were available. The later discovered light-activated anion channels (anion channelrhodopsins) can be useful hyperpolarizers, but only at low cytoplasmic anion concentration. For this thesis, I optimized CsR, a proton-pumping rhodopsin from Coccomyxa subellipsoidea, which naturally shows a robust expression in Xenopus laevis oocytes and plant leaves. I improved the expression and therefore the photocurrent of CsR about two-fold by N-terminal modification to the improved version CsR2.0, without altering the proton pump function and the action spectrum. A light pulse hyperpolarised the mesophyll cells of CsR2.0-expressing transgenic tobacco plants (N. tabacum) by up to 20 mV from the resting membrane potential of -150 to -200 mV. The robust heterologous expression makes CsR2.0 a promising optogenetic tool for hyperpolarization in other organisms as well. A single R83H point-mutation converted CsR2.0 into a light-activated (passive) proton channel with a reversal potential close to the Nernst potential for intra-/extra-cellular H+ concentration. This light-gated proton channel is expected to become a further useful optogenetic tool, e.g. for analysis of pH-regulation in cells or the intercellular space. Ion pumps as optogenetic tools require high expression levels and high light intensity for efficient pump currents, whereas long-term illumination may cause unwanted heating effects. Although anion channelrhodopsins are effective hyperpolarizing tools in some cases, their effect on neuronal activity is dependent on the cytoplasmic chloride concentration which can vary among neurons. In nerve cells, increased conductance for potassium terminates the action potential and K+ conductance underlies the resting membrane potential in excitable cells. Therefore, several groups attempted to synthesize artificial light-gated potassium channels but 2 all of these published innovations showed serious drawbacks, ranging from poor expression over lacking reversibility to poor temporal precision. A highly potassium selective light-sensitive silencer of action potentials is needed. To achieve this, I engineered a light-activated potassium channel by the genetic fusion of a photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, and a cAMP-gated potassium channel, SthK. Illumination activates bPAC to produce cAMP and the elevated cAMP level opens SthK. The slow diffusion and degradation of cAMP makes this construct a very light-sensitive, long-lasting inhibitor. I have successfully developed four variants with EC50 to cAMP ranging from 7 over 10, 21, to 29 μM. Together with the original fusion construct (EC50 to cAMP is 3 μm), there are five different light- (or cAMP-) sensitive potassium channels for researchersto choose, depending on their cell type and light intensity needs. N2 - Der lichtgesteuerte Kationenkanal Channelrhodopsin-2 wurde 2003 entdeckt und charakterisiert. Bereits 2005/2006 zeigten fünf unabhängige Gruppen, dass die heterologe Expression von Channelrhodopsin-2 eine sehr nützliche und einfach anwendbare Methode zur Depolarisation und damit Aktivierung von Nervenzellen ist. Die Anwendung von Channelrhodopsin-2 revolutionierte die neurowissenschaftliche Forschung und die Methode wurde dann Optogenetik genannt. In den letzten Jahren wurden immer mehr lichtempfindliche Proteine als „optogenetische Werkzeuge“ eingeführt, und nicht nur in den Neurowissenschaften erfolgreich angewandt. Optogenetische Werkzeuge zur neuronalen Anregung sind mit vielen verschiedenen Kationen-leitenden Wildtyp- und mutierten Channelrhodopsinen gut entwickelt, während für die Hemmung von Neuronen zu Beginn (2007) nur hyperpolarisierende Ionenpumpen zur Verfügung standen. Die später entdeckten lichtaktivierten Anionenkanäle (Anionenkanalrhodopsine) können nützliche Hyperpolarisatoren sein, jedoch nur bei niedriger zytoplasmatischer Anionenkonzentration. Für diese Arbeit habe ich CsR optimiert, ein Protonen pumpendes Rhodopsin aus Coccomyxa subellipsoidea, das von Natur aus eine robuste Expression in Oozyten von Xenopus laevis und in Pflanzenblättern zeigt. Ich habe die Expression und damit den Photostrom von CsR etwa um das Zweifache durch N-terminale Modifikation verbessert, ohne die Protonenpump-Funktion und das Aktionsspektrum bei der verbesserten Version von CsR2.0 zu verändern. Ein Lichtpuls hyperpolarisierte die Mesophyllzellen von CsR2.0-exprimierenden transgenen Tabakpflanzen (N. tabacum) um bis zu 20 mV gegenüber dem Ruhe-Membranpotential von -150 bis -200 mV. Die robuste heterologe Expression macht CsR2.0 zu einem vielversprechenden optogenetischen Werkzeug für die Hyperpolarisation auch in anderen Organismen. Eine einzelne R83H-Punktmutation wandelte CsR2.0 um in einen Licht-aktivierten (passiven) Protonenkanal mit einem Umkehrpotential nahe dem Nernst-Potential für intra-/extrazelluläre H+-Konzentration. Es wird erwartet, dass dieser Licht-gesteuerte Protonenkanal ein weiteres nützliches optogenetisches Werkzeug wird, z. zur Analyse der pH-Regulation in Zellen oder dem Interzellularraum. Ionenpumpen als optogenetische Werkzeuge erfordern hohe Expressionsraten und eine hohe Lichtintensität für effiziente Pumpströme, wobei eine Langzeitbeleuchtung unerwünschte Erwärmungseffekte verursachen kann. Obwohl Anionen-Channelrhodopsine in einigen Fällen wirksame hyperpolarisierende Werkzeuge sind, hängt ihre Wirkung auf die neuronale Aktivität von der zytoplasmatischen Chloridkonzentration ab, die zwischen den Neuronen variieren kann. In Nervenzellen beendet eine erhöhte Leitfähigkeit für Kalium das Aktionspotential und die K+-Leitfähigkeit liegt dem Ruhe-Membranpotential in erregbaren Zellen zugrunde. Daher versuchten mehrere Gruppen, künstliche lichtgesteuerte Kaliumkanäle zu synthetisieren, aber alle diese veröffentlichten Innovationen zeigten schwerwiegende Nachteile, die von schlechter Expression über fehlende Reversibilität bis hin zu geringer zeitlicher Präzision reichten. Ein hoch Kalium-selektiver Licht-empfindlicher Inhibitor der Aktionspotentiale ist von hohem Wert für die Neurowissenschaft. Um dies zu erreichen, habe ich einen Licht-aktivierten Kaliumkanal durch genetische Fusion einer photoaktivierten Adenylylcyclase, bPAC, und eines cAMP-gesteuerten Kaliumkanals, SthK, konstruiert. Beleuchtung aktiviert bPAC zur Produktion von cAMP und der erhöhte cAMP-Spiegel öffnet SthK. Die langsame Diffusion und Degradation von cAMP macht dieses Konstrukt zu einem sehr Licht-empfindlichen, lang anhaltenden Inhibitor. Ich habe darüber hinaus erfolgreich vier Varianten mit EC50 für cAMP im Bereich von 7 über 10, 21 bis 29 µM entwickelt. Zusammen mit dem ursprünglichen Fusionskonstrukt (EC50 zu cAMP beträgt 3 μM) gibt es damit nun fünf verschiedene lichtempfindliche Kaliumkanäle, die je nach Zelltyp und Lichtintensitätsbedarf für optogenetische Experimente ausgewählt werden können. KW - neuronal silencing KW - optogenetics KW - hyperpolarization KW - Proteine Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266752 ER - TY - THES A1 - Kurz, Hendrikje T1 - Regulation of ion conductance and cAMP/cGMP concentration in megakaryocytes by light T1 - Regulation der Ionenleitfähigkeit und cAMP/cGMP Konzentration in Megakaryozyten durch Licht N2 - Platelets play an essential role in haemostasis. Through granule secretion of second wave mediators and aggregation, they secure vascular integrity. Due to incorrect activation, platelet aggregation and subsequent thrombus formation can cause blood vessel occlusion, leading to ischemia. Patients with defects in platelet production have a low platelet count (thrombocytopenia), which can cause an increased bleeding risk. In vitro platelet generation is still in its development phase. So far, no convincing results have been obtained. For this reason, the health care system still depends on blood donors. Platelets are produced by bone marrow megakaryocytes (MKs), which extend long cytoplasmic protrusions, designated proplatelets, into sinusoidal blood vessels. Due to shear forces, platelets are then released into the bloodstream. The molecular mechanisms underlying platelet production are still not fully understood. However, a more detailed insight of this biological process is necessary to improve the in vitro generation of platelets and to optimise treatment regimens of patients. Optogenetics is defined as “light-modulation of cellular activity or of animal behaviour by gene transfer of photo-sensitive proteins”. Optogenetics has had a big impact on neuroscience over the last decade. The use of channelrhodopsin 2 (ChR2), a light-sensitive cation channel, made it possible to stimulate neurons precisely and minimally invasive for the first time. Recent developments in the field of optogenetics intend to address a broader scope of cellular and molecular biology. The aim of this thesis is to establish optogenetics in the field of MK research in order to precisely control and manipulate MK differentiation. An existing “optogenetic toolbox“ was used, which made it possible to light-modulate the cellular concentration of specific signalling molecules and ion conductance in MKs. Expression of the bacterial photoactivated adenylyl cyclase (bPAC) resulted in a significant increase in cAMP concentration after 5 minutes of illumination. Similarly, intracellular cGMP concentrations in MKs expressing photoactivated guanylyl cyclase (BeCyclop) were elevated. Furthermore, proplatelet formation of MKs expressing the light-sensitive ion channels ChR2 and anion channelrhodopsin (ACR) was altered in a light-dependent manner. These results show that MK physiology can be modified by optogenetic approaches. This might help shed new light on the underlying mechanisms of thrombopoiesis. N2 - Thrombozyten sind für die primäre Hämostase verantwortlich und unterstützen die Blutgerinnung. Durch ihre Aggregation und die Synthese bzw. Freisetzung von in Granula gespeicherten second wave Mediatoren, sichern sie die Integrität der Blutgefäße. Werden Thrombozyten fälschlicherweise aktiviert, kann es zu einem Gefäßverschluss durch Thrombusbildung mit daraus resultierender Ischämie kommen. Patienten mit einer defekten Thrombozytopoese weisen eine reduzierte Thrombozytenzahl (Thrombozytopenie) auf, die mit einer erhöhten Blutungsneigung assoziiert ist. Bisher gibt es keine überzeugenden Ansätze, die eine Thrombozytenproduktion in vitro ermöglichen. Aus diesem Grund ist das Gesundheitswesen, in der Versorgung der bedürftigen Patienten mit Thrombozytenkonzentraten, auf Blutspender angewiesen. Thrombozyten werden im Knochenmark von ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs) produziert. Diese bilden lange zytoplasmatische Fortsätze aus, die Proplättchen genannt werden. Durch die Scherkräfte des Blutstroms in den sinuosoidalen Blutgefäßen, schnüren sich Thrombozyten von den Proplättchen ab. Bisher sind die molekularen Prozesse der Thrombozytenproduktion noch weitgehend unverstanden. Ein besseres Verständnis des Vorgangs ist die Voraussetzung für eine Weiterentwicklung der in vitro Thrombozytengenerierung und einer optimierten Patientenbehandlung. Unter Optogenetik versteht man die Übertragung lichtempfindlicher Proteine in zuvor nicht lichtempfindliche Zellen. Dadurch wird eine nicht-invasive Beeinflussung von Zellvorgängen oder des Verhaltens von Tieren durch Licht ermöglicht. Das Feld der Optogenetik, besonders der lichtempfindliche Kanal Channelrhodopsin 2 (ChR2), hatte einen großen Einfluss auf die neuronale Forschung. Durch ihn war es möglich, Neuronen gezielt nicht-invasiv zu aktivieren und Kreisläufe zu untersuchen. Mittlerweile wurde das Spektrum auf eine Vielzahl von Forschungsgebieten und Zelltypen ausgeweitet. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Methoden der Optogenetik in MKs zu etablieren. Dadurch soll ein Weg gefunden werden, die Megakaryozytenreifung gezielt zu kontrollieren bzw. zu manipulieren. Die bereits vorhandene „optogenetische Toolbox“ wurde verwendet, um die intrazellulären Konzentrationen bestimmter Signalmoleküle und Ionen in MKs zu verändern. Durch die Expression der bakteriellen fotoaktivierbaren Adenylatzyklase (bPAC), wurde die cAMP Konzentration nach 5 min Lichtgabe signifikant erhöht. Ebenfalls ist es durch die Expression der fotoaktivierbaren Guanylatzyklase (BeCyclop) gelungen, die intrazelluläre cGMP Konzentration in MKs durch Belichtung zu erhöhen. Darüber hinaus konnte der Vorgang der Proplättchenformierung in MKs, welche die lichtempfindlichen Ionenkanäle ChR2 und Anion Channelrhodopsin (ACR) exprimierten, durch Licht beeinflusst werden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Beeinflussung der Megakaryozytenphysiologie durch Optogenetik möglich ist. Die Erkenntnisse können dazu beitragen, die Vorgänge der Thrombozytopoese in Zukunft besser zu verstehen. KW - optogenetics KW - megakaryocytes KW - Optogenetik KW - Megakaryozyt KW - proplatelets KW - second messenger Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216947 ER - TY - THES A1 - Zhou, Yang T1 - The Exploitation of Opsin-based Optogenetic Tools for Application in Higher Plants T1 - Die Nutzung von optogenetischen Werkzeugen auf Opsin-Basis für die Anwendung in höheren Pflanzen N2 - The discovery, heterologous expression, and characterization of channelrhodopsin-2 (ChR2) – a light-sensitive cation channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii – led to the success of optogenetics as a powerful technology, first in neuroscience. ChR2 was employed to induce action potentials by blue light in genetically modified nerve cells. In optogenetics, exogenous photoreceptors are expressed in cells to manipulate cellular activity. These photoreceptors were in the beginning mainly microbial opsins. During nearly two decades, many microbial opsins and their mutants were explored for their application in neuroscience. Until now, however, the application of optogenetics to plant studies is limited to very few reports. Several optogenetic strategies for plant research were demonstrated, in which most attempts are based on non-opsin optogenetic tools. Opsins need retinal (vitamin A) as a cofactor to generate the functional protein, the rhodopsin. As most animals have eyes that contain animal rhodopsins, they also have the enzyme - a 15, 15'-Dioxygenase - for retinal production from food-supplied provitamin A (beta-carotene). However, higher plants lack a similar enzyme, making it difficult to express functional rhodopsins successfully in plants. But plant chloroplasts contain plenty of beta-carotene. I introduced a gene, coding for a 15, 15'-Dioxygenase with a chloroplast target peptide, to tobacco plants. This enzyme converts a molecule of β-carotene into two of all-trans-retinal. After expressing this enzyme in plants, the concentration of all-trans-retinal was increased greatly. The increased retinal concentration led to increased expression of several microbial opsins, tested in model higher plants. Unfortunately, most opsins were observed intracellularly and not in the plasma membrane. To improve their localization in the plasma membrane, some reported signal peptides were fused to the N- or C-terminal end of opsins. Finally, I helped to identify three microbial opsins -- GtACR1 (a light-gated anion channel), ChR2 (a light-gated cation channel), PPR (a light-gated proton pump) which express and work well in the plasma membrane of plants. The transgene plants were grown under red light to prevent activation of the expressed opsins. Upon illumination with blue or green light, the activation of these opsins then induced the expected change of the membrane potential, dramatically changing the phenotype of plants with activated rhodopsins. This study is the first which shows the potential of microbial opsins for optogenetic research in higher plants, using the ubq10 promoter for ubiquitous expression. I expect this to be just the beginning, as many different opsins and tissue-specific promoters for selective expression now can be tested for their usefulness. It is further to be expected that the here established method will help investigators to exploit more optogenetic tools and explore the secrets, kept in the plant kingdom. N2 - Die Entdeckung, heterologe Expression und Charakterisierung von Channelrhodopsin-2 (ChR2) - einem lichtempfindlichen Kationenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii vorkommt - führte zum Erfolg der Optogenetik als leistungsfähige Technologie, zunächst in den Neurowissenschaften. ChR2 wurde eingesetzt, um in genetisch veränderten Nervenzellen durch blaues Licht Aktionspotentiale zu induzieren. Bei der Optogenetik werden exogene Photorezeptoren in Zellen exprimiert, um die zelluläre Aktivität zu manipulieren. Diese Photorezeptoren waren anfangs hauptsächlich mikrobielle Opsine. Im Laufe von fast zwei Jahrzehnten wurden viele mikrobielle Opsine und ihre Mutanten für ihre Anwendung in den Neurowissenschaften erforscht. Bis jetzt ist die Anwendung der Optogenetik in der Pflanzenforschung jedoch auf sehr wenige Arbeiten beschränkt. Es wurden mehrere optogenetische Strategien für die Pflanzenforschung aufgezeigt, wobei die meisten Versuche auf optogenetischen Werkzeugen, die nicht Opsine sind, beruhen. Opsine benötigen Retinal (Vitamin A) als Kofaktor, um das funktionelle Protein, das Rhodopsin, zu generieren. Da die meisten Tiere Augen haben, die tierische Rhodopsine enthalten, verfügen sie auch über das Enzym - eine 15, 15'-Dioxygenase - zur Retinalproduktion aus mit der Nahrung zugeführtem Provitamin A (Beta-Carotin). Höheren Pflanzen fehlt jedoch ein ähnliches Enzym, was es schwierig macht, funktionale Rhodopsine erfolgreich in Pflanzen zu exprimieren. Aber die Chloroplasten der Pflanzen enthalten reichlich Beta-Carotin. Ich führte ein Gen, das für eine 15, 15'-Dioxygenase mit einem Chloroplasten-Zielpeptid kodiert, in Tabakpflanzen ein. Dieses Enzym wandelt ein Molekül β-Carotin in zwei Moleküle all-trans-Retinal um. Nach Expression dieses Enzyms in Pflanzen wurde die Konzentration von all-trans-Retinal stark erhöht. ... KW - optogenetics KW - opsins KW - higher plants Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236960 ER -