TY - THES A1 - Proppert, Sven Martin T1 - Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging T1 - Design, Implementierung und Charakterisierung eines Mikroskops für dreidimensionale zwei Farben superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung N2 - This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. N2 - In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt. KW - Dimension 3 KW - aberration KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - single molecule microscopy KW - 3D KW - super-resolution KW - Mikroskopie KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Aberration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905 ER - TY - THES A1 - Köhler, Sascha T1 - Entwicklung hochaufgelöster NMR-Methoden zur morphologischen und funktionellen Charakterisierung des Herzmuskels T1 - Development of high resolution NMR techniques for morphological and functional characterization of heart muscle N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, neue Messverfahren zu entwickeln, die eine umfassende Charakterisierung des Herzmuskels ermöglichen. Sowohl die Morphologie als auch die Funktion und der Gefäßstatus wurden am intakten und am krankhaft veränderten isolierten Herzmuskel der Ratte mit NMR-Mikroskopietechniken untersucht. N2 - The goal of the present work is the development of new NMR techniques, which can be used for a broad characterization of the heart muscle. The morphology as well as the function and the status of coronary arteries was investigated in intact and in chronic infarcted hearts. KW - Herzfunktionsdiagnostik KW - NMR-Bildgebung KW - NMR KW - Bildgebung KW - Mikroskopie KW - Herz KW - Muskelfaser KW - NMR KW - imaging KW - microscopy KW - heart KW - muscle fiber Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9060 ER - TY - THES A1 - Haddad, Daniel T1 - Hochfeld 1H-NMR-Mikroskopie zur biophysikalischen Grundlagenforschung T1 - High Field 1H-NMR-Microscopy for Basic Biophysical Research N2 - Dank der mit modernen NMR-Spektrometern (Kernspintomographen) routinemäßig realisierbaren isotropen räumlichen Auflösungen von wenigen Mikrometern, ergeben sich für die 1H NMR-Mikroskopie zahlreiche neue Anwendungsgebiete. Allerdings sind die Möglichkeiten und Grenzen der NMR-Mikroskopie bezüglich ihrer praktischen Anwendbarkeit bisher nur wenig untersucht worden. Die vorliegende Arbeit ist im Bereich der biophysikalischen Grundlagenforschung angesiedelt und soll die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie auf neuen medizinischen und biologischen Anwendungsgebieten anhand von ausgewählten Beispielen aus diesen Bereichen demonstrieren. Die einzelnen Projekte besitzen deswegen immer auch den Charakter von Machbarkeitsstudien, die aufzeigen sollen, welche Möglichkeiten und Vorteile die NMR-Mikroskopie im Vergleich zu etablierten Untersuchungsmethoden bietet. Im Detail wurden unterschiedliche lebende und fixierte biologische Proben mittels NMR-Mikroskopie zerstörungsfrei und räumlich hochaufgelöst dargestellt. Dabei variierte die spezielle Zielsetzung von der Visualisierung der Invasion eines Tumorsphäroiden in ein Zellaggregat anhand von T2-Parameterkarten (Zeitkonstante der Spin-Spin-Relaxation) über die dreidimensionale Darstellung des Gehirns der Honigbiene in der intakten Kopfkapsel bis hin zur nicht-invassiven Abbildung der Anatomie prenataler Delphine. Für alle durchgeführten Projekte war der nicht-invasive Charakter der NMR-Experimente von entscheidender Bedeutung. Die zu beobachtende Tumorinvasion durfte nicht durch die Messung beeinflusst werden, das Bienengehirn sollte möglichst naturgetreu abgebildet werden, und die untersuchten Delphine sind seltene Museumsstücke, die nicht zerstört werden durften. Die verschiedenen Proben wurden mit der jeweils bestmöglichen räumlichen Auflösung visualisiert, die sich entweder durch das minimal nötige Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) oder durch die zur Verfügung stehende Messzeit ergab. Um einzelne feine Strukturen in den Bildern auflösen zu können, mussten sowohl das SNR, als auch das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Die Messungen wurden an Hochfeld-NMR-Spektrometern bei 500 und 750 MHz durchgeführt, um das für die hohe Auflösung notwendige SNR zu gewährleisten. Mit den Experimenten konnten zahlreiche Fragen bezüglich mikroskopischer Details der verschiedenen untersuchten Proben nicht-invasiv beantworten werden. Gleichzeitig führten sie zu neuen interessanten Fragestellungen bezüglich der NMR-Mikroskopie an fixierten Proben. Darüber hinaus konnte die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie als Alternative bzw. Ergänzung zu herkömmlichen Untersuchungsmethoden wie der konfokalen Lasermikroskopie bei der Visualisierung des Bienengehirns und der konventionellen Histologie bei der Untersuchung der Anatomie der prenatalen Delphine demonstriert werden. Durch die Untersuchung der speziellen Vorteile und der Grenzen der Anwendung der NMR-Mikroskopie gegenüber den herkömmlichen Untersuchungsmethoden konnte konkret der praktische Nutzen ihres Einsatzes aufgezeigt und Ergebnisse erzielt werden, die sonst nicht erzielbar wären. Gerade der Einsatz der NMR-Mikroskopie in Form der NMR-Histologie stellt einen vielversprechenden Weg zur Etablierung der NMR-Mikroskopie als Routineuntersuchungsmethode dar. Als ebenso erfolgreich hat sich die Anwendung der NMR-Mikroskopie als Untersuchungsmethode bei der Beobachtung der Tumorinvasion erwiesen, so dass sie auch in der medizinischen in-vitro Forschung und Therapiesimulation als sinnvolle Alternative zu den vorhandenen Methoden angesehen werden kann. Anhand der ausgewählten Anwendungsbeispiele ist es in dieser Arbeit somit gelungen, neue, konkrete Einsatzmöglichkeiten für die NMR-Mikroskopie zu eröffnen und ihre praktische Anwendbarkeit als Untersuchungsmethode für Fragestellungen im Bereich der medizinischen in-vitro Forschung und verschiedener neuro- und entwicklungsbiologischer Bereiche zu demonstrieren. N2 - With modern MR-spectrometers it is possible to achieve isotropic spatial resolutions in the range of only a few microns. Thus, several new fields of application for 1H-MR-Microscopy are being developed. Still, the practical possibilities and limitations of this technique have only been determined rarely. This work has a biophysical background and uses different examples to demonstrate the practical applicability of NMR-Microscopy in the medical and biological sector. Therefore, the different projects are feasibility studies which are used to compare the possibilities and advantages of NMR-Microscopy with other, established examination techniques. In detail, using MR-Microscopy, different living and fixed biological samples have been visualized non-invasively with high spatial resolution. The specific purpose of the studies ranged from the visualization of the invasion of tumor-spheroids into cell aggregates using T2 parameter maps (time constant of the spin-spin relaxation) to the three-dimensional display of the honey bee brain in the intact head capsule and the non-invasive visualization of the anatomy of prenatal dolphins. For all these projects, the non-invasive character of MR-experiments was of utmost importance. The tumor invasion was not to be disturbed by the measurements, the bee brain should be visualized as close to its true natural shape as possible and the examined dolphins represent rare museum specimens which should not be destroyed. The different samples were all imaged with the best possible spatial resolution which was either limited by the necessary signal-to-noise ratio (SNR) or the available scan time. In order to resolve single details and fine structures in the images, it was necessary to optimize the SNR as well as the contrast-to-noise ratio. To guarantee the necessary SNR, the measurements were performed on high field MR-spectrometers with resonance frequencies of 500 and 750 MHz. Numerous questions about microscopic details of the examined samples could be answered non-invasively with the experiments performed. At the same time, the experiments led to new interesting questions about MR-Microscopy on fixed samples. Furthermore, the practical applicability of MR-Microscopy as an alternative or a supplement to conventional examination methods could be demonstrated. Here, these methods were confocal laser microscopy in the case of the honey bee brain and conventional histology in the case of the prenatal dolphins. By investigating the specific advantages and limitations of MR-Microscopy in these cases, it was possible to demonstrate the practical value of its application and to obtain results which would otherwise have been impossible. Especially the use of MR-Microscopy as MR-Histology is a promising application which will help to establish MR-Microscopy as a routine examination method. Since the tumor invasion process could also be observed very successfully using MR-Microscopy, this technique can as well be considered as a valuable tool for medical in-vitro research and therapy simulation and thus an alternative to existing methods. In summary, with the examples chosen in this work, it was possible to find new applications for MR-Microscopy and to demonstrate the practical applicability of this method in the fields of medical in-vitro research as well as neurological and developmental biology. KW - NMR-Spektroskopie KW - NMR-Bildgebung KW - Hochauflösendes Verfahren KW - NMR KW - Magnetresonanztomographie KW - Kernspintomographie KW - Mikroskopie KW - Bildgebung KW - MRI KW - magnetic resonance KW - imaging KW - microscopy Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12449 ER - TY - THES A1 - Niehörster, Thomas T1 - Spektral aufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie mit vielen Farben T1 - Spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy with many colours N2 - Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine vielseitig einsetzbare Untersuchungsmethode für biologische Proben, bei der Biomoleküle selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, um sie dann mit sehr gutem Kontrast abzubilden. Dies ist auch mit mehreren verschiedenartigen Zielmolekülen gleichzeitig möglich, wobei üblicherweise verschiedene Farbstoffe eingesetzt werden, die über ihre Spektren unterschieden werden können. Um die Anzahl gleichzeitig verwendbarer Färbungen zu maximieren, wird in dieser Arbeit zusätzlich zur spektralen Information auch das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe mittels spektral aufgelöster Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, sFLIM) vermessen. Dazu wird die Probe in einem Konfokalmikroskop von drei abwechselnd gepulsten Lasern mit Wellenlängen von 485 nm, 532nm und 640nm angeregt. Die Detektion des Fluoreszenzlichtes erfolgt mit einer hohen spektralen Auflösung von 32 Kanälen und gleichzeitig mit sehr hoher zeitlicher Auflösung von einigen Picosekunden. Damit wird zu jedem detektierten Fluoreszenzphoton der Anregungslaser, der spektrale Kanal und die Ankunftszeit registriert. Diese detaillierte multidimensionale Information wird von einem Pattern-Matching-Algorithmus ausgewertet, der das Fluoreszenzsignal mit zuvor erstellten Referenzpattern der einzelnen Farbstoffe vergleicht. Der Algorithmus bestimmt so für jedes Pixel die Beiträge der einzelnen Farbstoffe. Mit dieser Technik konnten pro Anregungslaser fünf verschiedene Färbungen gleichzeitig dargestellt werden, also theoretisch insgesamt 15 Färbungen. In der Praxis konnten mit allen drei Lasern zusammen insgesamt neun Färbungen abgebildet werden, wobei die Anzahl der Farben vor allem durch die anspruchsvolle Probenvorbereitung limitiert war. In anderen Versuchen konnte die sehr hohe Sensitivität des sFLIM-Systems genutzt werden, um verschiedene Zielmoleküle voneinander zu unterscheiden, obwohl sie alle mit demselben Farbstoff markiert waren. Dies war möglich, weil sich die Fluoreszenzeigenschaften eines Farbstoffmoleküls geringfügig in Abhängigkeit von seiner Umgebung ändern. Weiterhin konnte die sFLIM-Technik mit der hochauflösenden STED-Mikroskopie (STED: stimulated emission depletion) kombiniert werden, um so hochaufgelöste zweifarbige Bilder zu erzeugen, wobei nur ein einziger gemeinsamer STED-Laser benötigt wurde. Die gleichzeitige Erfassung von mehreren photophysikalischen Messgrößen sowie deren Auswertung durch den Pattern-Matching-Algorithmus ermöglichten somit die Entwicklung von neuen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie für Mehrfachfärbungen. N2 - Fluorescence microscopy is an important and near-universal technique to examine biological samples. Typically, biomolecules are selectively labelled with fluorophores and then imaged with high contrast. This can be done for several target molecules simultaneously, using different fluorophores that are usually distinguished by their spectra. This thesis describes a method to maximize the number of simultaneous stainings. Not only the spectral information but also the temporal information of the fluorescence decay is exploited by means of spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy (sFLIM). Using a confocal laser scanning microscope, the sample is excited by three alternatingly pulsed lasers at 485 nm, 532 nm, and 640 nm. Fluorescence light is detected on 32 spectrally separated detection channels with high time resolution of a few picoseconds. Thus, in this setup, we record the excitation laser, the spectral channel, and the time of arrival for each fluorescence photon. This detailed multi-dimensional information is then processed by a pattern-matching algorithm that compares the fluorescence signal with reference patterns of the used fluorophores to determine the contribution of each fluorophore in each pixel. Using this technique we imaged five different stainings per excitation laser, implying that 15 simultaneous stainings should theoretically be achievable. Current constraints in the sample preparation procedure limited the number of simultaneous stainings to nine. In additional experiments, we exploited the sensitivity of the sFLIM system to image several different target molecules simultaneously with the same fluorophore, taking advantage of slight changes in the fluorescence behaviour of the fluorophore due to environmental changes. We also combined sFLIM with stimulated emission depletion (STED) to perform super-resolution multi-target imaging with two stainings that operated with one common STED laser. Thus, the simultaneous exploitation of several photophysical parameters, in combination with algorythmic evaluation, allowed us to devise novel modes of multi-target imaging in fluorescence microscopy. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie KW - Konfokale Mikroskopie KW - STED-Mikroskopie KW - Fluoreszenz KW - Mustervergleich KW - Pattern Matching KW - sFLIM KW - TCSPC KW - Mikroskopie KW - Microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296573 ER -