TY - THES A1 - Matenia, Dorthe T1 - Die Rolle der Serin/Threonin Kinase Cot in Proliferation, Differenzierung und Apoptose N2 - Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren. N2 - Mitogenic signals initiated at the plasma membrane are transmitted to the nucleus through complex and partially connected signal transduction cascades. The proto oncoprotein Cot was identified in this thesis as a new component of mitogenic signalling cascades, which activates both, the classic cytoplasmic cascade and the JNK stress pathway. Wildtype and activated Cot phosphorylate and activate MEK-1 and SEK-1 in vitro. Moreover, expression of oncogenic Cot in 293, NIH3T3 and PC12 cells leads to phosphorylation of endogenous c-Jun and ERK 1/2 in vivo. To test the relevance of the ability of Cot to stimulate two different signalling cascades we have examined the effects of Cot on different cell types as well as on tumor induction in mice. Expression of oncogenic c-Raf-1 or v-Mos leads to differentiation of PC12 cells. Cot induces as well neurite outgrowth in these cells. Furthermore, oncogenic Cot shows similar to v-raf an antiapoptotic effect on 32D cells after IL-3 deprivation. Retrovirally expressed oncogenic Cot induces B-cell lymphomas in newborn NSF/N mice after a latency of 7-10 weeks similiar to v-raf/v-myc [191]. This data are consistent with the role of Cot in the classic mitogenic cascade and suggest that the simultaneously activated JNK stress pathway has no antagonistic effects in this context. Active NF-kB regulates transcription of a variety of target genes involved in distinct cellular functions. Many stimuli activate NF-kB including members of the mitogenic cascade, e.g. c-Raf-1, which seems to function on the same level as oncogenic Cot and has partially overlapping effects on apoptosis suppression, transformation and differentiation. The work presented in this thesis demonstrates that Cot activates NF-kB and that this activation occurs indirectly via an autocrine loop which involves the EGF-receptor and also results in the activation of the stresskinase pathway. Similar results have been obtained in our lab in the past with Raf-1 [234]. An additional more direct pathway from Cot to NF-kB activation was demonstrated by our identification of p105, a precursor protein and regulator of NF-kB, as Cot interaction partner in a Two-hybrid screen. Furthermore, Cot coprecipitates with IKKa and IkBa, which are both regulators of NF-kB. The process of NF-kB activation is mainly controlled by the shuttling of components of the active transcription factor complex as well as of its regulators between cytosol and the nucleus. It is assumed that the small GTPase Ran plays a crucial role in these transports. Interestingly, we observed in a Two-hybrid screen that Ran is interacting with Cot which also was confirmed by coimmunoprecipitation experiments. These results point to a new mechanism of NF-kB regulation by activated Cot and gives new starting points to analyse the complex functions of Cot in the cell. KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - Apoptosis KW - Proliferation KW - Zelldifferenzierung KW - Molekularbiologie KW - Proto-Onkoprotein Cot KW - Apoptose KW - JNK-Streß-Kinase KW - proto oncoprotein Cot KW - apoptosis KW - JNK stress pathway Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1712 ER - TY - THES A1 - Wurzer, Walter T1 - Die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-KappaB in Influenza-A-Virus infizierten Zellen T1 - The role of the transcriptionfactor NF-kB in influenza-A-virus infected cells N2 - Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus. N2 - Activation of the transcription factor NF-kB is a hallmark of infections by viral pathogens including influenza-A-viruses (Hiscott J. et al., 2001). Since gene expression of many proinflammatory and antiviral cytokines, such as IFNb of TNF-a is controlled by NF-kB the concept emerged that NF-kB and its upstream regulator IKK are essential components of the innate antiviral immune response to infections with RNA viruses (Chu WM. et al., 1999). In contrast to this common view this work presents data that for efficient influenza virus production NF-kB activity is required. On a molecular level this is due to NF-kB-dependent viral induction of the proapoptotic factor TRAIL which enhances virus propagation in an auto- and parakrine fashion. Thus, NF-kB acts both proapoptotic and proviral in the context of an influenza virus infection. Induction of apoptosis is a hallmark observed upon infection with many viral pathogens, including influenza-A-virus. Since the consequences of apoptosis induction for the outcome of an influenza virus infection are not clear, we have addressed this issue by interfering with the function of a major virus-induced apoptosis effector, caspase-3. Surprisingly, influenza virus propagation was strongly impaired in the presence of a caspase-3 inhibitor in cultures cells. Consistent with these findings, virus yields are reduced in cells expressing XIAP and enhanced when procaspase-3 is overexpressed. Mechanistically, the block in virus propagation appears to be due to retention of the viral RNP complexes in the nucleus preventing formation of progeny virus particles. An explanation might given by an effect of caspase-3, which is involved in cleavage of protein of the nuclear pore complex in cells undergoing apoptosis, which results in fusion of the pores and might thus allow free diffusion of viral RNA complexes. Finally, this work presented here led to a new hypothesis concerning the role of the IKK-NF-kB-pathway, its influence on the regulation of apoptosis in influenza infected cells and the outcome for the virus. KW - Nuklearfaktor Kappa B KW - Influenza-A-Virus KW - Virusinfektion KW - NF-kB KW - Influenza A Virus KW - Apoptose KW - TRAIL KW - Export KW - NF-kB KW - influenza A virus KW - apoptosis KW - TRAIL KW - export Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5901 ER - TY - JOUR A1 - Sanges, C. A1 - Scheuermann, C. A1 - Zahedi, R. P. A1 - Sickmann, A. A1 - Lamberti, A. A1 - Migliaccio, N. A1 - Baljuls, A. A1 - Marra, M. A1 - Zappavigna, S. A1 - Reinders, J. A1 - Rapp, U. A1 - Abbruzzese, A. A1 - Caraglia, M. A1 - Arcari, P. T1 - Raf kinases mediate the phosphorylation of eukaryotic translation elongation factor 1A and regulate its stability in eukaryotic cells JF - Cell Death and Disease N2 - We identified eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) Raf-mediated phosphorylation sites and defined their role in the regulation of eEF1A half-life and of apoptosis of human cancer cells. Mass spectrometry identified in vitro S21 and T88 as phosphorylation sites mediated by B-Raf but not C-Raf on eEF1A1 whereas S21 was phosphorylated on eEF1A2 by both B- and C-Raf. Interestingly, S21 belongs to the first eEF1A GTP/GDP-binding consensus sequence. Phosphorylation of S21 was strongly enhanced when both eEF1A isoforms were preincubated prior the assay with C-Raf, suggesting that the eEF1A isoforms can heterodimerize thus increasing the accessibility of S21 to the phosphate. Overexpression of eEF1A1 in COS 7 cells confirmed the phosphorylation of T88 also in vivo. Compared with wt, in COS 7 cells overexpressed phosphodeficient (A) and phospho-mimicking (D) mutants of eEF1A1 (S21A/D and T88A/D) and of eEF1A2 (S21A/D), resulted less stable and more rapidly proteasome degraded. Transfection of S21 A/D eEF1A mutants in H1355 cells increased apoptosis in comparison with the wt isoforms. It indicates that the blockage of S21 interferes with or even supports C-Raf induced apoptosis rather than cell survival. Raf-mediated regulation of this site could be a crucial mechanism involved in the functional switching of eEF1A between its role in protein biosynthesis and its participation in other cellular processes. KW - EF-1A KW - Raf kinases KW - signal transduction KW - apoptosis KW - ubiquitin KW - mass spectrometry Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124149 VL - 3 IS - e276 ER - TY - JOUR A1 - Sanges, C. A1 - Scheuermann, C. A1 - Zahedi, R. P. A1 - Sickmann, A. A1 - Lamberti, A. A1 - Migliaccio, N. A1 - Baljuls, A. A1 - Marra, M. A1 - Zappavigna, S. A1 - Rapp, U. A1 - Abbruzzese, A. A1 - Caraglia, M. A1 - Arcari, P. T1 - Raf kinases mediate the phosphorylation of eukaryotic translation elongation factor 1A and regulate its stability in eukaryotic cells JF - Cell Death & Disease N2 - We identified eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) Raf-mediated phosphorylation sites and defined their role in the regulation of eEF1A half-life and of apoptosis of human cancer cells. Mass spectrometry identified in vitro S21 and T88 as phosphorylation sites mediated by B-Raf but not C-Raf on eEF1A1 whereas S21 was phosphorylated on eEF1A2 by both B-and C-Raf. Interestingly, S21 belongs to the first eEF1A GTP/GDP-binding consensus sequence. Phosphorylation of S21 was strongly enhanced when both eEF1A isoforms were preincubated prior the assay with C-Raf, suggesting that the eEF1A isoforms can heterodimerize thus increasing the accessibility of S21 to the phosphate. Overexpression of eEF1A1 in COS 7 cells confirmed the phosphorylation of T88 also in vivo. Compared with wt, in COS 7 cells overexpressed phosphodeficient (A) and phospho-mimicking (D) mutants of eEF1A1 (S21A/D and T88A/D) and of eEF1A2 (S21A/D), resulted less stable and more rapidly proteasome degraded. Transfection of S21 A/D eEF1A mutants in H1355 cells increased apoptosis in comparison with the wt isoforms. It indicates that the blockage of S21 interferes with or even supports C-Raf induced apoptosis rather than cell survival. Raf-mediated regulation of this site could be a crucial mechanism involved in the functional switching of eEF1A between its role in protein biosynthesis and its participation in other cellular processes. KW - signal transduction KW - mass spectrometry KW - elongation KW - protein docking KW - factor EEF1A2 KW - cancer-cells KW - lung cancer KW - EF-1A KW - Raf kinases KW - aminoacyl-transfer-RNA KW - tyrosine phosphorylation KW - factor 1-alpha KW - nucleotide exchange KW - polyarcylamide gels KW - chain KW - apoptosis KW - ubiquitin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134673 VL - 3 IS - e276 ER -