TY - THES A1 - Nagl, Patrick Alexander T1 - Chemistry meets Cancer Immunotherapy: Synthesis and Characterization of Hapten-like Compounds for Selective Immunotherapy T1 - Chemie trifft Krebsimmuntherapie: Synthese und Charakterisierung von hapten-artigen Verbindungen für selektive Immuntherapie N2 - Chimeric antigen receptors (CARs) are able to specifically direct T cells to tumor antigens and therapy with anti-CD19 CARs has already cured cancer patients with B-cell lymphomas who have undergone long-term therapy non-successful. Despite this impressive result, the therapy is currently only approved as a last treatment option for blood cancers due to its life-threatening deficiencies. For patient safety and to enable additional application such as the treatment of solid tumors, CAR-T cells must be controllable, e. g. by chemically programmable CARs (cpCARs) regulated by hapten-like compounds. This thesis reports the synthesis and characterization of such hapten-like compounds. In the first step, seven different warheads with two different spacers were bound to biotin in order to find a suitable warhead for programming the cpCAR. In a second step, synthetic routes for the three pharmacophores folate, c(RGD), and an RGD peptidomimetic were developed. The routes allow the modification of the pharmacophores with one of the warheads from the first step. CuAAC was chosen as a bioorthogonal approach to link pharmacophores and warheads. In total, three different pharmacophores were modified with the 1,3-diketone motif of compound 21 leading to 112, 113 and 128. Activation of the T-cell signaling cascade was tested after binding of these hapten-like compounds to the cpCAR in the presence of suitable target structures. For 112, only a slight, non-significant, activation of the T-cell signaling cascade was observed, whereas for 113 and 128, a significant activation of the T-cell signaling cascade was observed. The poor solubility of the folate compounds led to alternative strategies. Folic acid was exchanged by pteroic acid and the bifunctional, linear compounds were enlarged to trifunctional dendrimers. Besides the reported regioisomer in 112, a second one, which was not reported to date, occurred by the cyclization of the linear RGD pentapeptide leading to 113. After the reported synthesis of an RGD peptidomimetic analogous to 128 could not be reproduced, a new synthetic route was developed. It also consists of 17 steps, but reduces the number of linear steps from 13 to 10. Moreover, the developed route contains an asymmetric hydrogenation step and is, compared to the published one, more flexible by the use of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In addition, an unknown reaction was observed. Instead of the formation of a Schiff base in the reductive amination of 129, an insertion of propargylamine occurred forming 131. The reaction is almost quantitative and in high purity. After requiring no purification, it could be predestined for industrial purposes, such as the synthesis of N-functionalized 1,2-dihydroquinolines or as a building block with various orthogonal functional groups. Besides the sulfonamide 16, the diketone (21, 27, 31) and lactam compounds (39 – 41), experiments on adapter molecules with further warheads were performed. In the synthesis of a proadapter approach, in which the warhead is formed only after the retro-aldol reaction catalyzed by the mAb, 6 of 10 steps were successfully performed. A newly developed synthesis to keto-sulfonyl and keto-sulfoxide compounds could not be completed but was performed on a small scale to the point of keto-sulfonyl and keto-sulfoxide. Furthermore, a universal synthesis route was designed to allow the introduction of the warhead at the end of the synthesis by acylation. Thus, after 5 shared steps, 3 of them in quantitative yield, different warheads may be introduced. Moreover, this also facilitates the purification and the analysis of the compounds by the absence of tautomerism or labile groups. However, the acylation experiments were not successful with either the acid cyanide or the Weinreb amide. In summary, this thesis has proven that the 1,3-diketone motif is a suitable warhead for programming the cpCAR, which was developed by Hudecek et al. (unpublished data). The hapten-like compounds 112, 113 and 128 simultaneously bind to integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ and the cpCAR activating the T-cell signaling cascade. The modular synthesis strategy and the use of the bioorthogonal CuAAC allow straightforward access to these valuable immunotherapeutics but revealed the need for an additional purification step to remove copper ions. N2 - Chimäre Antigen-Rezeptoren (CARs) ermöglichen es T-Zellen spezifisch auf Tumorantigene auszurichten. Die Therapie mit anti-CD19 CARs konnte bereits eindrucksvolle Ergebnisse liefern und austherapierte Krebspatienten mit B-Zell-Lymphomen heilen. Durch zum Teil lebensbedrohliche Nebenwirkungen ist sie aktuell jedoch nur als letzte Therapiemöglichkeit zugelassen. Um Patienten zu schützen und ihr Einsatzgebiet zu erweitern, beispielsweise zur Behandlung von soliden Tumoren, müssen CAR-T-Zellen kontrollierbar sein, z. B. durch chemisch programmierbare CARs (cpCARs), die durch hapten-artigen Verbindungen reguliert werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung von solchen Verbindungen. Dafür wurden im ersten Schritt sieben verschiedene reaktive Gruppen mit zwei unterschiedlichen Spacern an Biotin gebunden, um eine geeignete reaktive Gruppe für die Programmierung des cpCARs zu finden. Im zweiten Schritt wurden Syntheserouten für die drei Pharmakophore Folat, c(RGD) und ein RGD-Peptidomimetikum entwickelt. Die Routen ermöglichen es das jeweilige Pharmakophor mit einer der reaktiven Gruppe aus dem ersten Schritt zu modifizieren. Zur Verbindung von Pharmakophor und reaktiver Gruppe, wurde die CuAAC als bioorthogonaler Ansatz gewählt. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit drei verschiedene Pharmakophore mit dem 1,3-Diketon-Motiv von Verbindung 21 modifiziert. Mit den resultierenden Verbindungen 112, 113 und 128 wurde die Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade bei Anwesenheit geeigneter Zielstrukturen untersucht. Bei 112 konnte nur eine leichte, nicht signifikante Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet werden, während bei 113 und 128 eine deutliche Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet wurde. Die schlechte Löslichkeit der Folatverbindungen führte zu Versuchen Folsäure gegen Pteroinsäure zu tauschen und die linearen Verbindungen zu trifunktionalen, dendrimeren Verbindungen mit weiteren Triethylenglycol-Ketten zu vergrößern. Neben dem publizierten Regioisomer in 112 trat bei der Zyklisierung des linearen RGD-Pentapeptides ein zweites Regioisomer auf, das zu 113 führte. Nachdem die veröffentlichte Syntheseroute eines RGD-Peptidomimetikums, das analog zu 128 ist, nicht reproduziert werden konnte, wurde eine neue Syntheseroute entwickelt. Sie besteht ebenfalls aus 17 Schritten, die Anzahl der linearen Schritte konnte jedoch von 13 auf 10 reduziert werden. Zusätzlich enthält die entwickelte Route einen asymmetrischen Hydrierungsschritt und ist durch den Einsatz der Kupfer-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) flexibler als die bereits publizierte Synthese. Während der Entwicklung der Syntheseroute wurde eine Reaktion beobachtet, die in der Literatur bisher nicht bekannt ist. Anstatt der Bildung eines Imins bei der reduktiven Aminierung von 129 kam es zu einer Insertion von Propargylamin, was zu 131 führte. Die Reaktion verläuft dabei nahezu quantitativ und in hoher Reinheit, so dass keine Aufreinigung notwendig ist. Sie könnte somit prädestiniert für industrielle Zwecke sein, wie zum Beispiel die Synthese von N-funktionalisieren 1,2-Dihydrochinolinen oder als Baustein mit mehreren funktionellen Gruppen, die orthogonal zu einander sind. Zusätzlich zum Sulfonamid 16, den Diketon- (21, 27, 31) und Lactamverbindungen (39 – 41), wurden Versuche zu Adaptermolekülen mit weiteren reaktiven Gruppen durchgeführt. Bei der Synthese eines Proadapter-Ansatzes, bei dem die reaktive Gruppe erst nach der vom mAb katalysierten Retroaldolreaktion entsteht, konnten 6 von 10 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Eine neu entwickelte Synthese von Keto-Sulfonyl- und Keto-Sulfoxid-Verbindungen konnte nicht abgeschlossen, aber im kleinen Maßstab bis zum Keto-Sulfonyl bzw. Keto-Sulfoxid durchgeführt werden. Des Weiteren wurde eine universelle Syntheseroute entworfen, um die Einführung der reaktiven Gruppe am Ende der Synthese durch Acylierung zu ermöglichen. So können nach den ersten 5 gemeinsamen Schritten, 3 davon in quantitativer Ausbeute, verschiedene reaktive Gruppen eingeführt werden. Darüber hinaus wird durch die Abwesenheit von Tautomerie oder labilen Gruppen sowohl die Aufreinigung als auch die Analytik der Verbindungen erleichtert. Die Acylierungsversuche waren jedoch weder mit dem Säurecyanid noch mit dem Weinreb-Amid erfolgreich. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit bewiesen werden, dass das 1,3-Diketon-Motiv eine geeignete reaktive Gruppe zur Programmierung des cpCARs ist, der von Hudecek et al. (bisher unveröffentlicht) entwickelt wurde. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die hapten-artigen Verbindungen gleichzeitig an Integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ und den cpCAR binden und die T-Zell-Signalkaskade aktivieren. Die modulare Synthesestrategie und der Einsatz der bioorthogonalen CuAAC für die Herstellung der Verbindungen ermöglichen einen unkomplizierten Zugang zu diesen wertvollen Immuntherapeutika, offenbarten jedoch die Notwendigkeit für einen zusätzlichen Reinigungsschritt zur Entfernung der Kupferionen. KW - Organische Synthese KW - Synthetische Biologie KW - Click-Chemie KW - Peptidsynthese KW - NMR-Spektroskopie KW - chemically programmable KW - chemisch programmierbar KW - CAR T cells KW - monoclonal antibodies KW - CAR T-Zellen KW - monoklonale Antikörper Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211385 ER - TY - THES A1 - Weinand, Hanne T1 - Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen die Endonuklease NmeDI zur Typisierung von Neisseria meningitidis T1 - Development of monoclonal antibodies directed against the endonuclease NmeDI for typing of Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt. N2 - Neisseria meningitidis is a leading cause of morbidity and mortality in children and adolescents. Typing is essential for epidemiological surveillance of meningococcal disease. The endonuclease NmeDI is specific to the clonal lineages ST-8 and ST-11 complex associated with serogroup C disease. Therefore, a monoclonal antibody was developed for rapid identification of strains belonging to these lineages. The antibody specifically recognized ST-8 and ST-11 complex meningococci in Western blots and dot blots. It is now routinely used at the German National reference centre for meningococci for presumptive identification of the lineages without multilocus sequence typing. KW - Herzmuskel KW - Durchblutungsmessung KW - NMR-Tomographie KW - Neisseria meningitidis KW - monoklonale Antikörper KW - NmeDI KW - Typisierung KW - Neisseria meningitidis KW - monoclonal antibodies KW - NmeDI KW - typing Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12878 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Tanja T1 - Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur T1 - Generation and characterization of anti-PrP antibodies with inhibitory effect on prion replication in cell culture N2 - Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infektiöse Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc übernimmt. Die Konversion des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten mögliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen können und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antikörper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen können und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antikörpern für therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antikörper mittels „Hybridom“-Technik hergestellt. Zwei der Antikörper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-Mäusen, die zuvor mit fibrillärem PrP immunisiert wurden. Bei fünf Antikörpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde für die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antikörper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Aviditäten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar. Das Epitop des Antikörpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), während die Antikörper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globulären C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antikörper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits häufiger für inhibitorisch wirksame Antikörper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antikörper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antikörper 48-11-5 führte zu einer unvollständigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verlängerung des Applikationszeitraums nicht verstärken ließ. Dagegen inhibierten die Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollständig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antikörper mit PrP zurückgeführt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch hätte verringern können, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosität von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antikörper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosität der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antikörper 103-8 reduzierte die Infektiosität der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 die Infektiosität der ScN2a-Zellen vollständig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers wird zusätzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterstützt, der mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antikörpern der Antikörper B2-43-133 ein Kandidat für weiterführende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antikörper für die Inhibition nutzen, konnte nicht geklärt werden. Obwohl der Antikörper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfläche (Retention) verlängerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Moleküle der PrPSc-Konversion entzogen werden können, wurde dies für einen Referenzantikörper, welcher einen ähnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder dafür, dass die Verlängerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antikörper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder dafür, dass verschiedene Antikörper verschiedene Mechanismen nutzen können. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antikörpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht bestätigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erhöhung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antikörper führte. N2 - The development of prion diseases is characterized by accumulation of an abnormal folded isoform of the cellular prion protein (PrPC). This infectious isoform, called PrPSc, emerges through interaction with PrPC adopting the conformation of PrPSc. Thus, conversion of PrPC to its pathogenic isoform and the resulting PrPSc accumulation are substantial hallmarks of prion diseases that provide possible therapeutical intervention points. Recent studies have shown that antibodies recognizing PrPC and/or PrPSc interfere with the conversion process in vitro and in vivo and inhibit PrPSc accumulation (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). This study was initiated to generate new anti-PrP antibodies that could efficiently inhibit the PrPSc conversion and thereby extend the repertoire of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic and diagnostic use. Altogether, seven antibodies could be established by hybridoma-technique: two mAbs from immunisation of Prnp0/0 mice with fibrillar PrP (B2-31-166 and B2-43-133) and the remainder (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) by using recombinant PrP as immunogen. All antibodies were able to detect recombinant PrP as well as native and denaturated PrPC and PrPSc. The avidities and similar dissociation constants were comparable to commercial reference antibodies. The epitope of mAb B2-31-166 was determined in the unstructured N-terminal domain (residues 96-110), whereas mAbs 7-12-5, 12-29 and 48-115 detected an epitope in the C-terminal globular domain (residues 158-176). The epitopes of mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 are located in the C-terminus (residues 142-157) as well and correspond to the -helix 1 of PrPC (residues 144-152). This region was already determined as a potential epitope for other inhibitory effective antibodies. Three antibodies (7-12-5, 12-29 and B2-31-166) did not inhibit PrPSc accumulation in prion-infected cells (ScN2a cells). MAb 48-11-5 only led to an incomplete reduction of the PrPSc content. This effect could not be strengthened through extending the treatment period. In contrast, mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 were able to completely inhibit the PrPSc accumulation in ScN2a cells. This effect was attributed to a specific interaction between antibodies and PrP as no cytotoxic effect was detectable that could lead to an unspecific reduction of the PrPSc content. Interestingly, analysis of the infectivity of antibody-treated ScN2a cells showed that mAb 110-10 was indeed able to inhibit PrPSc accumulation, although it did not affect the infectivity of ScN2a cells. MAb 103-8 reduced the infectivity level, but new PrPSc accumulation could be detected in ScN2a cells 30 days after the treatment had been finished. Only treatment with mAb B2-43-133 completely eliminated the infectivity of ScN2a cells and no PrPSc could be detected in ScN2a cells even 36 days after treatment. The strong inhibitory effect of this antibody is supported by a very low IC50 value (0,31 nM) which is also comparable with commercial anti-PrP antibodies. In summary, these results indicate that anti-PrP antibody B2-43-133 represents a good candidate for future immunotherapeutic approaches. Furthermore, it was impossible to clearly identify the underlying mechanisms of the antibodies for the inhibition of PrPSc accumulation. Although mAb B2-43-133 prolonged the retention of PrPC on the cell surface, whereby the bound PrPC molecules could hypothetical withdraw the PrPSc conversion, this could not be observed for commercial antibodies with similar inhibitory effect. These data imply that the prolongation of the PrP retention is only one feature of mAb B2-43-133. However, it is possible that different antibodies use different mechanisms to inhibit PrPSc conversion and that the retention is one of them. In addition, the inhibition of PrPSc accumulation is probably not mediated by the formation of an antibody-protein complex since the treatment of ScN2a cells with a stable complex consisting of B2-43-133 and recombinant PrP complex decreased the inhibitory effect compared to free antibody. KW - Monoklonaler Antikörper KW - Prionprotein KW - ScN2a Zellen KW - Immunisierung KW - Scrapie KW - Behandlung KW - monoclonal antibodies KW - prion protein KW - scrapie KW - treatment KW - ScN2a cells Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998 ER - TY - JOUR A1 - Scheer, Ulrich A1 - Messner, Karin A1 - Hazan, Rachel A1 - Raska, Ivan A1 - Hansmann, Paul A1 - Falk, Heinz A1 - Spiess, Eberhard A1 - Franke, Werner W. T1 - High sensitivity immunolocalization of double and single-stranded DNA by a monoclonal antibody N2 - A monoclonal antibody (AK 30-10) is described which specifically reacts with DNA both in double and single-stranded forms but not with other molecules and structures, including deoxyribonucleotides and RNAs. When used in immunocytochemical experiments on tissue sections and permeabilized cultured cells, this antibody detects DNA-containing structures, even when the DNA is present in very small amounts. Examples of high resolution detection include the DNA present in amplified extrachromosomal nucleoli, chromomeres of lampbrush chromosomes, mitochondria, chloroplasts and mycoplasmal particles. In immunoelectron microscopy using the immunogold technique, the DNA was localized in distinct substructures such as the "fibrillar centers" of nucleoli and certain stromal centers in chloroplasts. The antibody also reacts with DNA of chromatin of living cells, as shown by microinjection into cultured mitotic cells and into nuclei of amphibian oocytes. The potential value and the limitations of immunocytochemical DNA detection are discussed. KW - Cytologie KW - DNA antibodies KW - monoclonal antibodies KW - DNA immunolocalization KW - chromatin KW - mycoplasma tests Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-41063 ER - TY - JOUR A1 - Aistleitner, Karin A1 - Heinz, Christian A1 - Hoermann, Alexandra A1 - Heinz, Eva A1 - Montanaro, Jacqueline A1 - Schulz, Frederik A1 - Maier, Elke A1 - Pichler, Peter A1 - Benz, Roland A1 - Horn, Matthias T1 - Identification and Characterization of a Novel Porin Family Highlights a Major Difference in the Outer Membrane of Chlamydial Symbionts and Pathogens JF - PLoS ONE N2 - The Chlamydiae constitute an evolutionary well separated group of intracellular bacteria comprising important pathogens of humans as well as symbionts of protozoa. The amoeba symbiont Protochlamydia amoebophila lacks a homologue of the most abundant outer membrane protein of the Chlamydiaceae, the major outer membrane protein MOMP, highlighting a major difference between environmental chlamydiae and their pathogenic counterparts. We recently identified a novel family of putative porins encoded in the genome of P. amoebophila by in silico analysis. Two of these Protochlamydia outer membrane proteins, PomS (pc1489) and PomT (pc1077), are highly abundant in outer membrane preparations of this organism. Here we show that all four members of this putative porin family are toxic when expressed in the heterologous host Escherichia coli. Immunofluorescence analysis using antibodies against heterologously expressed PomT and PomS purified directly from elementary bodies, respectively, demonstrated the location of both proteins in the outer membrane of P. amoebophila. The location of the most abundant protein PomS was further confirmed by immuno-transmission electron microscopy. We could show that pomS is transcribed, and the corresponding protein is present in the outer membrane throughout the complete developmental cycle, suggesting an essential role for P. amoebophila. Lipid bilayer measurements demonstrated that PomS functions as a porin with anion-selectivity and a pore size similar to the Chlamydiaceae MOMP. Taken together, our results suggest that PomS, possibly in concert with PomT and other members of this porin family, is the functional equivalent of MOMP in P. amoebophila. This work contributes to our understanding of the adaptations of symbiotic and pathogenic chlamydiae to their different eukaryotic hosts. KW - cell wall KW - protochlamydia amoebophila KW - escherichia coli KW - matrix protein porin KW - gram negative bacteria KW - single channel analysis KW - developmental cycle KW - mycobacterium smegmatis KW - monoclonal antibodies KW - signal peptides Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131176 VL - 8 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - BOOK A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave 99 promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS- 15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und 101 da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - synaptic proteins KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - monoclonal antibodies Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270205 N1 - ursprüngliche Originalausgabe der Dissertation erschienen am 19.01.2012 unter: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 ER - TY - JOUR A1 - Buchner, Erich A1 - Blanco Redondo, Beatriz A1 - Bunz, Melanie A1 - Halder, Partho A1 - Sadanandappa, Madhumala K. A1 - Mühlbauer, Barbara A1 - Erwin, Felix A1 - Hofbauer, Alois A1 - Rodrigues, Veronica A1 - VijayRaghavan, K. A1 - Ramaswami, Mani A1 - Rieger, Dirk A1 - Wegener, Christian A1 - Förster, Charlotte T1 - Identification and Structural Characterization of Interneurons of the Drosophila Brain by Monoclonal Antibodies of the Würzburg Hybridoma Library JF - PLoS ONE N2 - Several novel synaptic proteins have been identified by monoclonal antibodies (mAbs) of the Würzburg hybridoma library generated against homogenized Drosophila brains, e.g. cysteine string protein, synapse-associated protein of 47 kDa, and Bruchpilot. However, at present no routine technique exists to identify the antigens of mAbs of our library that label only a small number of cells in the brain. Yet these antibodies can be used to reproducibly label and thereby identify these cells by immunohistochemical staining. Here we describe the staining patterns in the Drosophila brain for ten mAbs of the Würzburg hybridoma library. Besides revealing the neuroanatomical structure and distribution of ten different sets of cells we compare the staining patterns with those of antibodies against known antigens and GFP expression patterns driven by selected Gal4 lines employing regulatory sequences of neuronal genes. We present examples where our antibodies apparently stain the same cells in different Gal4 lines suggesting that the corresponding regulatory sequences can be exploited by the split-Gal4 technique for transgene expression exclusively in these cells. The detection of Gal4 expression in cells labeled by mAbs may also help in the identification of the antigens recognized by the antibodies which then in addition to their value for neuroanatomy will represent important tools for the characterization of the antigens. Implications and future strategies for the identification of the antigens are discussed. KW - cell staining KW - drosophila melanogaster KW - gene expression KW - hybridomas KW - immune serum KW - library screening KW - monoclonal antibodies KW - neurons Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97109 ER - TY - THES A1 - Langenhan, Ronny T1 - Identifizierung immunodominanter antigener Strukturen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) mit Hilfe einer Expressionsgenbank T1 - Identification immunodominant and antigenic structures of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with an expression library N2 - Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen. N2 - Infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are increasingly difficult to threat due to the presence of multiple antibiotic resistance traits. Therfore, the developemet of alternative strategies are urgently demanded to combat severe staphylococcal infections. Immunotherapy has become a promising approach using specific, monoclonal antibodies against defined immunodominant structures (antigens) of the bacterium. The recent progress of genome-based research of bacterial pathogens allows now the global analysis of factors involved in pathogenicity. The identification of such virulence-associated factors might result in the development of specific antibodies against bacterial pathogens which may administered supplementary to antibiotics increasing the success of of a therapy. In this study an expression library of an MRSA strain was constructed. For this purpose, genomic DNA of a MRSA strain was digested with Sau3A and DNA fragments of 3 to 10 kb were ligated into the expression vector ZAP-express. The gene library encompasses approximately 10,000 clones. To detect specific antigenic structures the expression library was screened by using human sera of MRSA septiceamic patients and sera of asymptomatically colonized individuals. Clones which specifically reacted with the patients sera were further analyzed by DNA-sequencing and BLAST analysis. Several staphylococcal antigenic and immunodominant structures were identified including a putative holin and a gene with strong homology to the amidase lytA. Both proteins may phage-derived as they show significant similarity to a range of phage proteins. In addition, genes of the isd-locus reacted with the immunsera. These genes encode proteins which are important for transport of iron into the cell. Furthermore, a cadmium resistance factor (cadA), unknown proteins localized on Staphylococcus aureus pathogenicity island 3 (SaPI3) and protein A showed a positive reaction with the immune sera. Interestingly, almost all proteins identified are associated with mobile genetic elements. The results of the study suggests that proteins encoded on mobile genetic elements are indeed expressed during infection which in turn are recognized by the immune system resulting in the production of specific antibodies. To what extend these antibodies contribute to a successful defence of staphylococcal cells is currently not known and subject of ongoing studies. Moreover, the antigenic and immunodominant structures identified in this study have to subcloned to characterize their immunoreactive potential. The positive reaction of the patient serum with protein A is probably caused by the antibody-binding capacity of the protein to the FC-fragment of antibodies. An alternative theoretical opportunity could be that an acute S. aureus infection causes a massive production of protein A that subsequently consume antibodies due to binding of the FC-Fragment. The sum of these events may cause a dramatic immunsuppressive effect. In conclusion, several putative immunodominant structures have been identified being the basis for further studies to assess whether or not these structures may serve as targets of an antibody-based therapy of infections caused by S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - Expressionsgenbank KW - Pathogenitätsinsel KW - Bakteriophagen KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - expression library KW - pathogenicity island KW - bacteriophage Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13719 ER - TY - THES A1 - Bittner, Thomas T1 - Immunhistologische Charakterisierung immunkompetenter Zellen in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes T1 - Immunohistochemical characterisation of immunocompetent cells in squamous cell carcinomas of the upper aerodigestive tract N2 - Ziel der vorliegenden Studie war es, die Beziehung zwischen Expression der Basalmembran und der damit einhergehen Veränderung des Immunzelleninfiltrates zu untersuchen. Eine Reihe von 23 Plattenepithelkarzinomen des Larynx und Hypopharynx wurden lichtmikroskopisch untersucht. Hierzu wurde eine immunhistochemischen Färbung verwendet mit monoklonalen Antikörpern gegen folgende Membranantigene: CD 1a, CD 4, CD 8, Pan B, CD 14, ICAM 1, LFA, HLA-DR, Kollagen 4. Die immunhistochemische Analyse wurde bezogen auf den Differenzierungsgrad des Tumors, definiert durch die Ausprägung der Basalmembran. Epithel und Stroma wurden getrennt ausgezählt. Der Verlust der Basalmembran wurde von einer Veränderung in der Zusammensetzung des Immunzelleninfiltrates begleitet: HLA-DR und LFA nahm in beiden Kompartimenten ab. Pan B und CD 14 zeigten eine Parallelität im Färbeverhalten. Pan B zeigte die stärkste Färbung in Plattenepithelkarzinomen mit annähernd ununterbrochener Basalmembran. CD 8 zeigte die stärksteFärbung in Plattenepithelkarzinomen mit lückenhafter, aber noch vorhandener Basalmembran. Die CD 8 positiven Zellen zeigten stellenweise engen Kontakt zur Basalmembran, stellenweise keimzentrumsähnliche Anordnungen. Wir schlussfolgern, dass bei gut differenzierten Tumoren das B-Zell System, bei mäßig differenzierten das T-Zell System eine gewisse Rolle spielt. Der Übergangszone Tumor-Stroma scheint eine besondere immunologische Bedeutung zu zukommen. N2 - The objective of the present study was to evaluate the relationship between the expression of the basement Membrane (BM) in SCC and the relative proportions of selective immune cell populations. A series of 23 SCC of the Larynx and the Hypopharynx was assessed by light microscopy and using immunohistochemical staining with monoclonal antibodies directed against the following cell surface antigens: CD 1a, CD 4, CD 8, Pan B, CD 14, ICAM 1, LFA, HLA-DR, Collagen 4. Immunhistochemical analysis of the tumor infiltrating cells was performed and correlated with the transformation level as defined by the grade of expression of BM. The loss of BM was accompanied by a change in immune infiltrate: HLA-DR and LFA decreased in both compartiments. The B cells stained in parallel with CD 14 positive cells. Pan B showed the highest levels in SCC with a nearly continous BM. CD 8 peaked in tumors with a leaky but still present BM. The CD 8 cells showed sometimes tight junction to the BM, sometimes formations similar to germinal centers. We conclude that in well differentiated SCC the B cell system plays a certain role, in middle differentiated the T cell system. The epithelio-stromal junction zone seems to play an important immunologic role. KW - Plattenepithelkarzinom KW - immunkompetente Zellen KW - monoklonale Antikörper KW - Immunantwort KW - squamous cell carcinoma KW - immunocompetent cells KW - monoclonal antibodies KW - immune response Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12087 ER -