TY  - THES
A1  - Nieberler, Matthias
T1  - The physiological role of autoproteolysis of the Adhesion GPCR Latrophilin/dCIRL
T1  - Die physiologische Bedeutung der Autoproteolyse des Adhäsions-GPCR Latrophilin/dCIRL
N2  - G protein-coupled receptors of the Adhesion family (aGPCRs) comprise the second largest group within the GPCR realm with over 30 mammalian homologs. They contain a unique structure with unusually large extracellular domains (ECDs) holding many structural folds known to mediate cell-cell and cell-matrix interactions. Furthermore, aGPCRs undergo autoproteolytic cleavage at the GPCR proteolysis site (GPS), an integral portion of the GPCR autoproteolysis inducing (GAIN) domain. Thus far, it is largely unknown if and how self-cleavage affects aGPCR activation and signaling and how these signals may shape the physiological function of cells.
Latrophilin, alternatively termed the calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL) constitutes a highly conserved, prototypic aGPCR and has been assigned roles in various biological processes such as synaptic development and maturation or the regulation of neurotransmitter release. The Drosophila melanogaster homolog dCIRL is found in numerous sensory neurons including the mechanosensory larval pentascolopidial chordotonal organs (CHOs), which rely on dCIRL function in order to sense mechanical cues and to modulate the mechanogating properties of present ionotropic receptors.
This study reveals further insight into the broad distribution of dCirl expression throughout the larval central nervous system, at the neuromuscular junction (NMJ), as well as subcellular localization of dCIRL in distal dendrites and cilia of chordotonal neurons. Furthermore, targeted mutagenesis which disabled GPS cleavage of dCIRL left intracellular trafficking in larval CHOs unaffected and proved autoproteolysis is not required for dCIRL function in vivo. However, substitution of a threonine residue, intrinsic to a putative tethered agonist called Stachel that has previously been documented for several other aGPCRs, abrogated receptor function. Conclusively, while this uncovered the presence of Stachel in dCIRL, it leaves the question about the biological relevance of the predetermined breaking point at the GPS unanswered. In an independent approach, the structure of the “Inter-RBL-HRM” (IRH) region, the region linking the N-terminal Rhamnose-binding lectin-like (RBL) and the hormone receptor motif (HRM) domains of dCIRL, was analyzed. Results suggest random protein folding, excessive glycosylation, and a drastic expansion of the size of IRH. Therefore, the IRH might represent a molecular spacer ensuring a certain ECD dimension, which in turn may be a prerequisite for proper receptor function.
Taken together, the results of this study are consistent with dCIRL’s mechanoceptive faculty and its role as a molecular sensor that translates mechanical cues into metabotropic signals through a yet undefined Stachel-dependent mechanism.
N2  - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der Adhäsions-Klasse (aGPCRs) bilden mit über 30 Homologen in Säugern die zweitgrößte Gruppe innerhalb des GPCR-Reichs. Sie teilen eine einzigartige Morphologie mit einer ungewöhnlich großen extrazellulären Domäne (ECD), welche meist vielfältige Strukturen enthält, die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen vermitteln. Weiterhin unterziehen sich aGPCRs einer autoproteolytischen Spaltung an der GPCR proteolysis site (GPS), die einen integralen Bestandteil der GPCR autoproteolysis inducing (GAIN) Domäne darstellt. Bisher ist weitestgehend unbekannt, ob und wie die Selbstspaltung Aktivierung und Signaltransduktion von aGPCRs beeinflusst und wie diese Signale die physiologische Zellfunktion modulieren.
Latrophilin, oder auch der Kalzium-unabhängige Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL), stellt einen evolutiv stark konservierten, prototypischen aGPCR dar und spielt eine Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, darunter die Entwicklung und Reifung von Synapsen, sowie die Regulation der Neurotransmitterausschüttung. Zusätzlich ist dCIRL, das Latrophilinhomolog von Drosophila melanogaster, an der Wahrnehmung mechanischer Reize beteiligt und moduliert die Mechanosensitivität larvaler Chordotonalorgane (CHOs), indem es das mechanisch gesteuerte Verhalten vorliegender ionotroper Rezeptoren verändert. 
Die vorliegende Arbeit enthüllt weitere Erkenntnisse zur umfassenden Expression von dCirl im larvalen Zentralnervensystem, an der motorischen Endplatte (NMJ), und stellt erstmals dessen subzelluläre Lokalisation in distalen Dendriten und Zilien von Chordotonalneuronen dar. Außerdem zeigen Mutationsstudien mit ausgeschalteter Autoproteolyse an der GPS, dass diese für den intrazellulären Transport und die Rolle von dCIRL in larvalen CHOs in vivo von untergeordneter Bedeutung ist. Die Mutation eines Threonins, welches integraler Bestandteil eines möglichen gebundenen Agonisten Stachel, der kürzlich für einige andere aGPCRs beschrieben wurde, ist, verschlechtert jedoch drastisch die Rezeptorfunktion. Während dies die Existenz Stachels in dCIRL aufdeckt, bleibt die Frage nach der biologischen Bedeutung der vorgegebenen Bruchstelle an der GPS unbeantwortet. Zusätzlich wurde die Struktur der „Inter-RBL-HRM“ (IRH) Region von dCIRL, die die N-terminale Rhamnose-binding lectin-like (RBL) und die hormone receptor motif (HRM) Domänen verbindet, analysiert. Die Ergebnisse legen eine zufällige Proteinfaltung, starke Glykosylierung sowie riesige strukturelle Ausmaße von IRH nahe. Daher könnte die IRH einen molekularen Abstandhalter für dCIRL darstellen, der eine bestimmte Länge der ECD sicherstellt, was wiederum eine Voraussetzung für die Rezeptorfunktion sein könnte.
Zusammen betrachtet sind die Ergebnisse dieser Arbeit vereinbar mit der mechanozeptiven Funktion von dCIRL und dessen Rolle als molekularer Sensor, der mechanische Reize mit Hilfe eines bisher unbekannten Stachel-abhängigen Mechanismus in metabotrope Signale umwandelt.
KW  - Latrophilin
KW  - Autoproteolysis
KW  - Adhesion GPCR
KW  - Mechanosensation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165894
ER  - 
TY  - THES
A1  - Altrichter, Steffen
T1  - Labeling approaches for functional analyses of adhesion G protein-coupled receptors
T1  - Markierungsverfahren zur funktionellen Analyse von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
N2  - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and an intracellular region (ICR). A special feature of aGPCRs is the extraordinary size of the ECR through which they interact with cellular and matricellular ligands via adhesion motif folds. In addition, the ECR contains a so-called GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domain, which catalyzes autoproteolytic cleavage of the protein during maturation. This cleavage leads to the formation of an N-terminal (NTF) and a C-terminal fragment (CTF), which build a unit by means of hydrophobic interactions and therefore appear as a heterodimeric receptor at the cell surface. In the past, it has been shown that the first few amino acids of the CTF act as a tethered agonist (TA) that mediates the activation of the receptor through the interaction with the 7TM domain. However, the molecular mechanism promoting the TA-7TM domain interaction remains elusive. This work reveals a novel molecular mechanism that does not require the dissociation of the NTF-CTF complex to promote release of the TA and thus activation of the aGPCR. The introduction of bioorthogonal labels into receptorsignaling- relevant regions of the TA of various aGPCRs demonstrated that the TA is freely accessible within the intact GAIN domain. This suggests a structural flexibility of the GAIN domain, which allows a receptor activation independent of the NTF-CTF dissociation, as found in cleavage-deficient aGPCR variants. Furthermore, the present study shows that the cellular localization and the conformation of the 7TM domain depends on the activity state of the aGPCR, which in turn indicates that the TA mediates conformational changes through the interaction with the 7TM domain, which ultimately regulates the receptor activity. In addition, biochemical analyses showed that the GAIN domain-mediated autoproteolysis of the human aGPCR CD97 (ADGRE5/E5) promotes further cleavage events within the receptor. This suggests that aGPCRs undergo cleavage cascades, which are initialized by the autoproteolytic reaction of the GAIN domain. Thus, it can be assumed that aGPCRs are subject to additional proteolytic events. Finally, the constitutive internalization of the NTF and the CTF of E5 was demonstrated by various labeling methods. It was possible to label both fragments independently and to follow their subcellular location in vitro. In summary, these obtained results contribute to a better understanding about the molecular mechanisms of activity and signaling of aGPCRs.
N2  - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr
als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien
unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion,
Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie
innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR
typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einer sieben
Transmembrandomäne (7TM) und einer intrazellulären Region (ICR) auf. Eine
Besonderheit stellt hierbei die außergewöhnliche Größe der ECR, welche über
vielfältige Domänen mit zellulären und matrixgebundenen Liganden interagieren, dar.
Zusätzlich umfasst die ECR eine sogenannte GPCR Autoproteolyse-induzierende
(GAIN) Domäne, an welcher während der Proteinreifung eine autoproteolytische
Spaltung stattfindet. Diese Spaltung führt zur Entstehung eines N-terminalen (NTF)
und C-terminalen Fragmentes (CTF), welche mittels hydrophober Wechselwirkung
eine Einheit an der Zelloberfläche und daher einen heterodimeren Rezeptor bilden.
In der Vergangenheit zeigte sich, dass die ersten paar Aminosäuren des CTF als
angebundener Agonist (TA) agieren und über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine
Aktivierung des Rezeptors vermitteln. Der molekulare Mechanismus, welcher die
Wechselwirkung zwischen TA und 7TM Domänen fördert, ist jedoch weiterhin
unbekannt. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen molekularen Mechanismus, welcher
keine Dissoziation des NTF-CTF Komplexes benötigt, um eine Freisetzung des TA
und damit eine Aktivierung des aGPCR zu gewährleisten. Mittels der Einbringung von
bioorthogonalen Markierungen in rezeptorsignalisierungs-relevante Bereiche des TA
von diversen aGPCRs, wurde gezeigt, dass dieser innerhalb der intakten GAIN
Domäne freizugänglich vorliegt. Dies lässt auf eine strukturelle Flexibilität der GAIN
Domäne schließen, welche eine Rezeptoraktivierung unabhängig von der NTF-CTF
Dissoziation erlaubt, wie sie auch bei spaltungsdefizienten aGPCR Varianten
vorzufinden ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass sich die zelluläre
Lokalisation und die Konformation der 7TM Domäne abhängig vom Aktivitätszustand
des aGPCR ist, was wiederrum daraufhin deutet, dass der TA über die Interaktion mit
der 7TM Domäne eine Konformationsänderung vermittelt, welche letztendlich die
Rezeptoraktivität reguliert. Zudem zeigten biochemische Analysen, dass neben der
GAIN Domänen-vermittelten Autoproteolyse des humanen aGPCRs CD97
(ADGRE5/E5) weitere proteolytische Spaltungen innerhalb des Rezeptors stattfinden.
Dies deutet daraufhin, dass aGPCRs Spaltungskaskaden durchlaufen, welche über
die autoproteolytischen Reaktion der GAIN Domäne initialisiert werden. Dadurch kann
angenommen werden, dass aGPCRs zusätzlichen proteolytischen Ereignissen unterliegen. Schlussendlich konnte mittels diverser Markierungsverfahren die
konstitutive Internalisierung des NTF und des CTF von E5 nachgewiesen werden. Es
war möglich beide Fragmente unabhängig voneinander zu markieren und deren
subzelluläre Lokalisation in vitro zu verfolgen. Zusammenfassend tragen die
gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden
molekularen Mechanismen in Bezug auf Aktivität und Signalübertragung von aGPCRs
bei.
KW  - G-Protein gekoppelter Rezeptor
KW  - Labeling
KW  - Functional analyses
KW  - Adhesion GPCR
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207068
ER  -