TY - THES A1 - Faber, Johan Henrik T1 - Naphthylisoquinoline Alkaloids : Structural Elucidation, Metabolism and Functional Analysis of their Bioactivities T1 - Naphthylisochinolinalkaloide: Strukturaufklärung, Metabolismus und Untersuchungen zu Wirkmechanismen N2 - This thesis deals with the isolation and structural elucidation of bioactive naphthylisoquinoline alkaloids and related analogs. The mode of action of the antiplasmodial activity exhibited by the naphthylisoquinoline alkaloids was explored and compared to that of the antimalarial drug chloroquine. Furthermore, the phase 1 and 2 metabolism of dioncophyllines A and C and dioncopeltine A were investigated. In detail the following results have been obtained: • From the leaves of the recently discovered East African liana A. tanzaniensis six naphthylisoquinoline alkaloids were isolated. • The leaves of a botanical yet undescribed Ancistrocladus species, collected by Prof. Dr. V. Mudogo in the Democratic Republic of Congo in the habitat Yeteto near the town Ikela, were analyzed for naphthylisoquinoline alkaloids for the first time. The isolation work led to the first identification of an N,C-coupled naphthyldihydroisoquinoline alkaloid; ancistrocladinium B. Phytochemical investigation of the roots of the Congolese Ancistrocladus species (habitat Yeteto), , afforded five new derivatives of known naphthylisoquinoline alkaloids, namely 5'-O-demethylhamatine, 5'-O-demethylhamatinine, 6-O-demethylancistroealaine A, 6,5'-O,O-didemethylancistroealaine A, and 5-epi-6-O-methylancistrobertsonine A, along with six known naphthylisoquinoline alkaloids. • The antiplasmodial activity guided purification of 60Co irradiated samples containing commercially available naphthylisoquinoline related substances, afforded the isolation of the irradiation products 3,4-dihydro-1-isoquinolinone, 3,4-dihydro-1-isoquinolineamine, and 1,2,3,4-tetrahydro-1,2-diazirino-isoquinoline. The compounds were found to be more active than the starting material, although only exhibiting weak antiplasmodial activity against P. falciparum. • The effect on the absorption spectrum of FPIX due to complex formation with the naphthylisoquinoline alkaloids dioncophyllines A and C, dioncopeltine A korupensamine A, and ancistrocladine was examined by a titration study. Job's plot analyses by UV-spectroscopy determined the stoichiometry for the complex formation of FPIX and naphthylisoquinoline alkaloids to be 2:1. Furthermore, the dissociation constants for the complexation with FPIX were determined for each of the naphthylisoquinoline alkaloids investigated. Dioncophylline C and dioncopeltine A were found to possess dissociation constants, which are comparable to the one reported for the antimalarial drug chloroquine. The ability of ESI to transfer noncovalent solution-phase assemblies intact into the gas phase, was conducted on solution mixtures of naphthylisoquinoline alkaloid and FPIX, as well as on mixtures of chloroquine and FPIX. The mass spectrometry analyses revealed several peaks, which corresponded to the complex formation of FPIX to the respective ligands investigated. The most interesting results obtained were the detection of peaks corresponding to the complex formation between a chelated dimer of FPIX and dioncophylline Cand of peaks corresponding to a double protonated tetramer of FPIX – consisting of two chelated -oxo dimers of FPIX – in complex formation with two molecules of chloroquine. • Two phase 1 metabolism products of dioncophylline A were identified. Coelution in combination with HPLC-MS/MS, NMR, and CD investigations assigned the major metabolic product as 5'-O-demethyldioncophylline A. The minor metabolic product was only present in small amounts, which disabled an unambiguous structural characterization of the compound. However, as deduced from the mass spectrometry analyses and exclusion of a possible metabolic oxidation product by coelution with authentic reference material, the metabolite should possess a 4-hydroxylated isoquinoline portion and is assumed to be represented by structure. Dioncophylline C and dioncopeltine A were found to be stable to phase 1 metabolism reactions caused by rat liver microsomes. N2 - • Aus Blättern der ostafrikanischen Lianenart Ancistrocladus tanzaniensis wurden sechs Naphthylischinolin-Alkaloide isoliert, darunter Ancistrotectorilin die bereits aus A. tectorius isoliert wurde. Von einer botanisch bisher unbeschriebenen Ancistrocladus Art, gesammelt von Prof. Dr. V. Mudogo in der Demokratischen Republik Kongo bei Yeteto, in der Nähe der Stadt Ikela, wurden die Blätter i auf ihren Inhalt an Naphthylischinolin-Alkloiden phytochemisch untersucht. Dabei konnte das erste N,C gekuppelte Naphthyldihydroisochinolin-Alkaloid, Ancistrocladinium B. • Die phytochemische Untersuchung der Wurzeln der Kongolesischen Ancistrocladus Art (Fundort Yeteto) wurde ausgeführt und ergab die Isolierung von fünf unbekannten Derivaten bereits bekannter Naphthylisochinolin-Alkaloide: 5'-O-Demethylhamatin , 5'-O-Demethylhamatinin, 6-O-Demethylancistroealain A, 6,5'-O,O-Didemethylancistroealain A und 5-epi-6-O-Methylancistrobertsonine A. Parallel dazu wurden sechs bereits bekannte Naphthylisochinolin-Alkaloide identifiziert. Die bioaktivitätsgeleitete Reinigung antiplasmodialer 60Co bestrahlter Proben –kommerziel verfügbarer Naphthylisochinolin abgeleiteter Substanzen – führte zur Isolierung verschiedener Bestrahlungs-Produkte, nämlich 3,4-Dihydro-1-Isochinolinon, 3,4-Dihydro-1-isochinolineamin, und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,2-Diazirino-Isochinolin. Die isolierten Substanzen waren jeweils aktiver als die Edukte, zeigten aber trotzdem nur antiplasmodiale Wirksamkeit im mittleren Berreich. • Die Auswirkung der Komplexbildung unterschiedlicher Naphthylisochinolin-Alkloide – Dioncophylline A und C, Dioncopeltin A, Korupensamin A, und Ancistrocladin – auf das Absorptions-Spektrum von FPIX wurde mittels eines Titrationsexperimentes, unter Anwendung von UV Spektroskopie, untersucht. Durch Job's Plot Analysen konnte so die Stöchiometrie der Komplex-Bildung zwischen FPIX und Naphthylisochinolin-Alkaloide zu 2:1 bestimmt werden. Weiterhin konnten die einzelnen Dissoziationskonstanten für die Komplexierung von FPIX mit den untersuchten Naphthylisochinolin-Alkaloiden errechnet werden. Die für Dioncophyllin C und Dioncopeltin A bestimmten Dissoziationskonstanten sind mit der in der Literatur für das antimalariale Arzneitmittel Chloroquine vergleichbar. Die Möglichkeit durch ESI nicht kovalent gelöste Komponenten intakt in die Gas-Phase zu transferieren, wurden auf Lösungs-Gemische von Naphthylischinolin-Alkaloiden und FPIX sowie auf Lösungs-Gemische von Chloroquine und FPIX angewandt. Die massenspektroskopischen Analysen ergaben mehrere Peaks, die der Komplex-Bildung von FPIX mit den einzeln untersuchten Liganden entsprachen. Die interessantesten Ergebnisse waren dabei die Entdeckung von Peaks, die die Komplex-Bildung zwischen einem chelatisierten Dimer von FPIX mit Dioncophyllin C, sowie zwischen einem doppelt protonierten Tetramer von FPIX – bestehend aus zwei chelatisierten -oxo Dimeren von FPIX – mit zwei Molkülen Chloroquine entsprachen. Zwei Phase 1 Metabolite von Dioncophyllin A konnten in Kooperation mit M. Sieber identifiziert werden. Die Struktur des Haupt-Metabolismus-Produktes konnte durch Koelution, HPLC-MS/MS, NMR und CD Untersuchungen als 5'-O-demethyldioncophyllin A bestätigt werden. KW - Naphthylisochinolinalkaloide KW - Strukturaufklärung KW - Naturstoffe KW - Naphthylisochinoline KW - Metabolismus KW - Strukturaufklärung KW - Wirkmechanismus KW - Natural products KW - naphthylisoquinoline alkaloids KW - metabolism KW - structural elucidation KW - mode of action Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22789 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Aktas, Barsom T1 - Biochemische Charakterisierung des ADP-Rezeptors P2Y12 und pharmakologische Therapiekontrolle von Thrombozytenfunktionshemmern T1 - Biochemical characterization of the ADP receptor P2Y12 and pharmacological drug monitoring of anti-platelet compounds N2 - Die Bedeutung der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinase für die Hemmung der Plättchenaktivierung und -aggregation ist gut beschrieben. Zahlreiche fundamentale Plättchenantworten wie die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, die Exposition von Adhäsionsrezeptoren und die Aktinpolymerisation können durch die Cyclonukleotid vermittelte Kinasenaktivierung fast vollständig gehemmt werden. Die Vielfalt der cGMP bindenden Proteine und deren synergistische Interaktion mit cAMP vermittelten Signalwegen deuten auf eine Reihe von cGMP Zielproteinen hin. Vor kurzem wurde die zentrale Bedeutung einer Gi-Protein Stimulation für die Plättchenaktivierung und –aggregation gezeigt. In dieser Dissertation wurde daher der Frage nachgegangen, ob Signalmoleküle, die an Gi-Protein vermittelten Effekten beteiligt sind, einen Angriffspunkt für cAMP/cGMP-abhängige Proteinkinasen darstellen. Zu diesem Zweck wurden die Effekte erhöhter cGMP Spiegel und die selektive Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase auf die adrenerge und purinerge Rezeptor vermittelte Erniedrigung stimulierter cAMP Konzentrationen untersucht. In unseren Versuchen konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine Erhöhung der intrazellulären cGMP Konzentration Gi-Protein vermittelte Signale hemmt. Dieses erfolgt nicht auf Grund einer cGMP stimulierten Aktivierung von cyclonukleotidabbauenden Phosphodiesterasen, sondern auf Grund einer Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase. In Anbetracht der essentiellen Bedeutung der Gi-Protein Stimulation für die Plättchenaktivierung stellt dies einen wichtigen Mechanismus dar, wie das aus dem Endothel freigesetzte NO über cGMP die Thrombozytenfunktion hemmt. Klinisch bedeutsame Substanzen wie Clopidogrel oder Ticlopidin imitieren diesen in vivo Effekt des NO, indem sie extrazellulär über eine Rezeptorhemmung Gi-Protein Stimulation verhindern. (Aktas et al., Biochem Pharmacol 2002; 64: 433-439) Dipyridamol und im Besonderen die Kombination von Dipyridamol und niedrig dosierter Acetylsalicylsäure sind in der Sekundärprävention des Schlaganfalles sehr gut wirksam. Jedoch sind die hierfür zu Grunde liegenden biochemischen Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt. Da für das Dipyridamol eine in vitro Hemmung der cGMP-spezifischen Phosphodiesterase 5 (PDE 5) nachgewiesen ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob Dipyridamol in therapeutisch relevanten Konzentrationen die NO/cGMP vermittelte Effekte auf die Plättchenfunktion unter ex vivo Bedingungen verstärkt. Die Phosphorylierung von VASP (VAsodilator-Stimulated Phosphoprotein) diente dabei als Meßparameter NO/cGMP Signale in Thrombozyten mit Hilfe von Antikörpern und Western Blot Technik zu quantifizieren. Die Sekretion von Serotonin aus Thrombozyten und die Aktivität der Thromboxansynthase wurden durch die fluorimetrische Bestimmung derivatisierten Serotonins bzw. des Synthaseprodukts Malondialdehyd quantifiziert. Endotheliale Faktoren wie NO oder PG-I2 erhöhen cGMP bzw. cAMP, die zu einer Plättchenhemmung und gleichzeitigen VASP Phosphorylierung führen. In in vitro Versuchen potenzierte Dipyridamol in einer therapeutisch relevanten Konzentration (3,5 µmol/l) nur die cGMP vermittelte, aber nicht die cAMP vermittelte VASP Phosphorylierung. Darüber hinaus konnte Dipyridamol (3,5 µmol/l) die Hemmung von Plättchenfunktionen wie der Serotoninsekretion und die Aktivität der Thromboxansynthase durch einen NO Donor klar verstärken. Schließlich steigerte Dipyridamol die NO vermittelte VASP Phosphorylierung auch in Thrombozyten von Probanden, die vorher Dipyridamol eingenommen hatten. Unter therapeutisch relevanten Bedingungen verstärkt also Dipyridamol NO/cGMP Signalwege und damit die Hemmung von Thrombozyten. Dieser Befund bekräftigt die Vorstellung, dass die Verstärkung endothelialer NO/cGMP Effekte auf Thrombozyten eine wichtige Komponente der Dipyridamol Wirkung unter in vivo Bedingungen darstellt. (Aktas et al., Stroke 2003; 34(3): 764-769) Die Stimulation von Thrombozyten führt u.a. zu einer Sekretion von Plättchenaktivatoren wie Thrombin, Thromboxan A2, ADP oder Serotonin aus dem Zellinnern. Durch diesen Prozess der Degranulierung können nun weitere Thrombozyten aktiviert werden. Die Sekretion stellt somit einen wichtigen, verstärkenden Schritt in der Aktivierung von Thrombozyten während der Hämostase dar. Diese Arbeit zeigt, dass in Thrombozyten eine Gi-Protein Aktivierung nicht nur wie bisher angenommen eine initiale Sekretion durch Gq verstärkt und aufrecht erhält, sondern der eigentliche Stimulus ist, der die Degranulierung von Thrombozyten auslöst. Die Stimulation Gq vermittelter Signalwege ist nur insofern erforderlich, als diese das Auslösen der Sekretion durch eine Aktivierung von Gi-Proteinen ermöglichen. Die Stimulierung beider G-Proteine ist daher essentiell für die thrombozytäre Sekretion. Zudem konnte die Phospholipase D als ein neuer Effektor des P2Y12 nachgewiesen werden, deren Stimulierung wahrscheinlich zur Degranulierung von Thrombozyten führt. Dieser Mechanismus könnte der Entscheidende sein, der der essentiellen Rolle des Gi-Proteins bei der Stimulation der Sekretion und der Aktivierung von Thrombozyten zu Grunde liegt und könnte ein neues Licht auf die Wirkweise des Clopidogrels und des Ticlopidins werfen, die irreversibel an den P2Y12 Rezeptor binden. (Aktas et al., Manuskript in Vorbereitung) N2 - The important role of cGMP and cGMP-dependent protein kinase for the inhibition of platelet activation and aggregation is well established and due to the inhibition of fundamental platelet responses such as agonist-stimulated calcium increase, exposure of adhesion receptors and actin polymerization. The diversity of cGMP binding proteins and their synergistic interaction with cAMP signaling in inhibiting platelets indicates that a variety of cGMP targets contribute to its anti-platelet action. Since stimulation of Gi-proteins was recently shown to be essential for complete platelet activation/aggregation, the possibility that Gi-signaling events are cGMP/cGMP-dependent protein kinase targets was investigated. Thus, the effect of elevated cGMP levels and selective cGMP-dependent protein kinase activation on purinergic and adrenergic receptor-evoked decrease of platelet cAMP content was closely examined. Experiments with a selective activator of cGMP-dependent protein kinase demonstrate for the first time a cGMP-caused Gi-protein inhibition. Our data suggest that this effect is mediated by cGMP-dependent protein kinase. Considering the essential role of Gi-signaling for platelet activation, we propose that inhibition of Gi-mediated signaling by cGMP/cGMP-dependent protein kinase is an important mechanism of action contributing to platelet inhibition by cGMP-elevating endothelium derived factors and drugs. (Aktas et al., Biochem Pharmacol 2002; 64: 433-439) Dipyridamole and in particular dipyridamole in combination with low dose aspirin are very effective in preventing recurrent stroke. However, the mechanism(s) underlying this dipyridamole effect have not been elucidated. Since dipyridamole inhibits the cGMP-specific phosphodiesterase type V in vitro, we hypothesized and tested whether therapeutically relevant dipyridamole concentrations enhance NO/cGMP-mediated effects in intact human platelets studies ex vivo. Phosphorylation of VASP (VAsodilator-Stimulated Phosphoprotein), an established marker of NO/cGMP effects in human platelets, was quantified by phosphorylation-specific antibodies and western blots. Serotonin secretion and thromboxane synthase activity were determined by fluorimetric quantification of derivatized serotonin and synthase product, respectively. Endothelium-derived factors such as NO and PG-I2 are known to elevate both, cGMP and cAMP levels with concomitant platelet inhibition and VASP phosphorylation. In our in vitro experiments, therapeutically relevant dipyridamole concentrations (3.5 µmol/l) only amplified cGMP-mediated VASP phosphorylation due to NO donor sodium nitroprusside, but not cAMP-mediated effects. Furthermore, thromboxane synthase activity and serotonin secretion, events important for initial platelet activation, were inhibited by sodium nitroprusside, an effect also enhanced by dipyridamole demonstrating the functional relevance of these observations. Finally, the ex vivo enhancement of NO/cGMP effects was also observed with platelets obtained from healthy volunteers treated with extended released dipyridamole. Under therapeutically relevant dipyridamole conditions, dipyridamole enhances platelet inhibition by amplifying the signalling of the NO-donor SNP. These data support the concept that enhancement of endothelium-derived NO/cGMP-mediated signalling in vivo is an important component of dipyridamole action. (Aktas et al., Stroke 2003; 34(3): 764-769) Activation of platelets causes secretion of several platelet activators, including thrombin, thromboxan A2, ADP or serotonin. By this process, other platelets get attracted and contribute to the thrombus. Therefore, secretion represents an important amplifying mechanism during platelet activation and hemostasis. In the present work, we could demonstrate that Gi-protein signalling does not only amplify initial secretion induced by Gq-protein activation, as it has been proposed so far, but is the actual stimulus to induce secretion. However, stimulation of Gq-proteins is required, since this enables Gi-proteins to induce secretion. Therefore, activation of both G-proteins is essential for platelet release. We could exclude inhibition of adenylyl cyclase to be the major mechanism contributing to the observed effects of Gi-proteins during secretion. We suggest phospholipase D as a novel effector of the Gi-coupled ADP receptor P2Y12, whose stimulation may lead to degranulation of platelets. This mechanism could be the major one underlying the essential role of Gi-proteins during secretion and activation of platelets. This could provide new insights in the mechanism by which P2Y12 receptor antagonists like clopidogrel exert their antithrombotic action. (Aktas et al., manuscript in preparation) KW - Purinorezeptor KW - Regulation KW - Dipyridamol KW - Clopidogrel KW - Wirkmechanismus KW - Wirkmechanismus KW - Dipyridamol KW - Clopidogrel KW - Therapiekontrolle KW - Rezeptorregulation KW - dipyridamole KW - clopidogrel KW - drug-monitoring KW - receptor-regulation Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6957 ER - TY - THES A1 - Seupel, Raina T1 - Antiinfektive und Antitumorale Naphthylisochinolin-Alkaloide: Isolierung und Strukturaufklärung, Totalsynthese und Untersuchungen zum Wirkmechanismus T1 - Antiinfective and Antiturmoral Naphthylisoquinoline Alkaloids: Isolation and Elucidation, Total Synthesis, and Investigations on the Mode of Action N2 - Bedingt durch ihre strukturelle Diversität und biologischen Eigenschaften sind Naturstoffe seit jeher Quelle und Inspiration für Arzneimittel vor allem im therapeutischen Bereich der Onkologie und der Infektionskrankheiten. Ihr einzigartiges pharmakologisches Potenzial wird durch die selektive Interaktion mit einer Vielzahl von Zielmolekülen hervorgerufen. Aufgrund der zentralen Bedeutung von Naturstoffen in der Entdeckung und Entwicklung von neuen Arzneimitteln sind nach wie vor die Isolierung und Strukturaufklärung, die totalsynthetische Darstellung und Derivatisierung sowie die Identifizierung der Zielmoleküle und die Aufklärung des Wirkmechanismus dieser natürlichen Wirkstoffe unabdingbar. Die kleine, aber spannende Klasse der Naphthylisochinolin-Alkaloide, die ausschließlich aus den beiden Pflanzenfamilien der Dioncophyllaceae und der Ancistrocladaceae gewonnen werden, zeichnet sich mit ihren mehr als 200 Vertretern nicht nur durch ihre strukturelle Vielfalt aus, sondern zeigt vor allem pharmakologisch interessante Wirksamkeiten. Neben ausgeprägten In-vitro-Aktivitäten gegen protozoische Erreger wie Leishmanien, Plasmodien und Trypanosomen besitzen die Vertreter dieser einzigartigen Naturstoffklasse nach neuesten Untersuchungen auch vielversprechende antitumorale Aktivitäten. Für deren Weiterentwicklung zu möglichen Arzneistoffen ist es daher unabdingbar, ihr pharmakologisches Potenzial tiefergehend zu untersuchen. Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung totalsynthetischer Zugänge zu biologisch interessanten Naphthylisochinolin-Alkaloiden mit Hilfe unterschiedlicher Synthesestrategien. Ebenfalls sollten durch die Darstellung strukturell vereinfachter Derivate sowie markierter Naturstoffe in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern mögliche Zielmoleküle identifiziert und Beiträge zum Wirkmechanismus untersucht werden. N2 - Due to their structurally diversity and biological properties, natural products have been, for a long time, a source and inspiration for drugs, especially in the therapeutic areas of oncology and infectious diseases. Their unique pharmacological potential is a result of their selective interaction with a variety of target molecules. Owing to the central role of natural products in the discovery and development of new drugs, the isolation, structural elucidation, the total synthesis and derivatization, the identification of target molecules, and investigations on the mode of action of these natural compounds are still essential. The small, yet fascinating class of naphthylisoquinoline alkaloids, which are exclusively obtained from the two plant families of Dioncophyllaceae and Ancistrocladaceae, does not only stand out due to their structural diversity with more than 200 representatives, but also shows pharmacologically interesting activities. In addition to pronounced in vitro activities against protozoan pathogens such as leishmania, plasmodia and trypanosoma, the representatives of this unique class of natural products also show promising antitumoral activities. For their further development as possible drugs, their pharmacological potential has to be investigated in more detail. The aim of the present thesis was the development of total synthetic approaches to biologically interesting naphthylisoquinoline alkaloids by means of different strategies. The synthesis of structurally simplified derivatives and of labeled natural products together with cooperation partners was also intended to identify potential targets and contribute to the mode of action. KW - Naphthylisochinolinalkaloide KW - Organische Synthese KW - Naturstoffe KW - Natural products KW - Totalsynthese KW - Isolierung KW - Strukturaufklärung KW - Wirkmechanismus KW - total synthesis KW - isolation KW - structure elucidation KW - mode of action Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167950 ER -