TY  - THES
A1  - Heidenreich, Julius Frederik
T1  - Characterization of the widely used Rac1-inhibitors NSC23766 and EHT1864 in mouse platelets
T1  - Untersuchung der Rac1-Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 in murinen Thrombozyten
N2  - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic diseases, such as myocardial infarction and stroke. Extracellular agonists induce platelet activation by stimulation of platelet membrane receptors. Signal transduction results in reorganization of the cytoskeleton, shape change, platelet adhesion and aggregation, cumulating in thrombus formation. Several Rho GTPases, including Rac1, Cdc42 and RhoA, are essential mediators of subsequent intracellular transduction of ITAM- and GPCR-signaling. Therefore, inhibition or knockout can result in severely defective platelet signaling.
Mice with platelet specific Rac1-deficiency are protected from arterial thrombosis. This benefit highlights further investigation of Rac1-specific functions and its potential as a new pharmacological target for prevention of cardiovascular diseases. Two newly developed synthetic compounds, NSC23766 and EHT1864, were proposed to provide highly specific inhibition of Rac1 activity, but both drugs have never been tested in Rac1-deficient cell systems to rule out potential Rac1-independent effects.
This study revealed significant off-target effects of NSC23766 and EHT1864 that occurred in a dose-dependent fashion in both wild-type and Rac1-deficient platelets. Both inhibitors individually affected resting platelets after treatment, either by altering membrane protein expression (NSC23766) or by a marked decrease of platelet viability (EHT1864). Platelet apoptosis could be confirmed by enhanced levels of phosphatidylserine exposure and decreased mitochondrial membrane potential. Phosphorylation studies of the major effector proteins of Rac1 revealed that NSC23766 and EHT1864 abolish PAK1/PAK2 activation independently of Rac1 in wild-type and knockout platelets, which may contribute to the observed off-target effects.
Additionally, this study demonstrated the involvement of Rac1 in G protein-coupled receptor-mediated platelet activation and GPIb-induced signaling. Furthermore, the data revealed that Rac1 is dispensable in the process of integrin  IIb 3-mediated clot retraction.
This study unveiled that new pharmacological approaches in antithrombotic therapy with Rac1 as molecular target have to be designed carefully in order to obtain high specificity and minimize potential off-target effects.
N2  - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach Gefäßverletzungen ist entscheidend um starken Blutverlust zu vermeiden. Allerdings können diese Prozesse auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die Stimulation der Membranrezeptoren durch Triggersubstanzen leitet die Thrombozytenaktivierung und somit die Reorganisation des Zytoskeletts ein. Dies ermöglicht die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und führt letztendlich zur Thrombusbildung. Die Rho GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA sind als wichtige Mediatoren an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt. Eine medikamentöse Hemmung oder ein genetischer Knockout kann daher die intrazellulären Signalkaskaden so stark beeinträchtigen, dass eine effiziente Aktivierung der Thrombozyten nicht mehr möglich ist. In Mäusen mit thrombozytenspezifischem Knockout von Rac1 wurde festgestellt, dass der Funktionsverlust von Rac1 gleichzeitig auch Schutz vor der Entwicklung von arterieller Thrombose bedeutet. Könnte man sich diese Tatsache pharmakologisch zunutze machen, würde die Hemmung von Rac1 möglicherweise einen neuen, erfolgsversprechenden Ansatz in der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen darstellen.
Für den Forschungseinsatz wurden die zwei synthetischen Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 entwickelt um Rac1-vermittelte Funktionen zu studieren. Beide Substanzen versprechen eine hochspezifische Hemmung der Rac(1)-Aktivität, wurden bisher jedoch nicht in Zellsystemen mit Rac1-Defizienz verwendet um die Substanzen kritisch auf mögliche, unerwünschte Nebenwirkungen zu untersuchen.
In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass NSC23766 und EHT1864 zwar effektive Hemmstoffe für Rac1 sind, allerdings genauso Rac1-unabhängige Nebenwirkungen verursachen. Beide Hemmstoffe führten zu Veränderungen der Thrombozyten: Während unter NSC23766 eine verminderte Expression von Membranrezeptoren beobachtet wurde, führte EHT1864 zu einer stark beeinträchtigten Vitalität der Thrombozyten. Anhand von erhöhten Phosphatidylserin-Werten und einer Veränderung des mitochondrialen Membranpotenzials in den behandelten Thrombozyten konnte die EHT1864-vermittelte Apoptose nachgewiesen werden. Letztendlich wurde anhand der verminderten Phosphorylierung von PAK1/PAK2
gezeigt, dass die Aktivierung dieser Rac1-Effektorproteine durch NSC23766 und EHT1864 direkt unterdrückt wird.
Zusätzlich zu den Inhibitor-vermittelten Effekten wurde anhand von Rac1-defizienten Thrombozyten nachgewiesen, dass Rac1 auch an GPCR- und GPIb-vermittelten Signalkaskaden beteiligt ist. Außerdem wurde beobachtet, dass Rac1 für die Integrin  IIb 3-vermittelte clot retraction entbehrlich ist.
Die Ergebnisse dieser Studie legen dar, dass neue pharmakologische Substanzen für die antithrombotische Therapie mit Rac1 als Zielmolekül gründlich erforscht und hinterfragt werden müssen um die Spezifität zu maximieren und vor allem das Nebenwirkungsprofil zu minimieren.
KW  - Thrombozyt
KW  - Thrombose
KW  - Signaltransduktion
KW  - Enzyminhibitor
KW  - Rho-Proteine
KW  - mouse platelets
KW  - rac1 inhibitors
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165453
ER  - 
TY  - THES
A1  - van Eeuwijk, Judith Martina Maria
T1  - Studies on thrombopoiesis and spleen tyrosine kinase-mediated signaling in platelets
T1  - Untersuchungen der Thrombopoese und der spleen tyrosine kinase-vermittelten Signaltransduktion in Thrombozyten
N2  - In mammals, anucleate blood platelets are constantly produced by their giant bone marrow (BM) progenitors, the megakaryocytes (MKs), which originate from hematopoietic stem cells. Megakaryopoiesis and thrombopoiesis have been studied intensively, but the exact mechanisms that control platelet generation from MKs remain poorly understood. Using multiphoton intravital microscopy (MP-IVM), thrombopoiesis and proplatelet formation were analyzed in the murine BM in real-time and in vivo, identifying an important role for several proteins, including Profilin1, TRPM7 and RhoA in thrombopoiesis. Currently, it is thought that blood cell precursors, such as MKs, migrate from the endosteal niche towards the vascular niche during maturation. In contrast to this paradigm, it was shown that MKs are homogeneously distributed within the dense BM blood vessel network, leaving no space for vessel-distant niches. By combining results from in vivo MP-IVM, in situ light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) of the intact BM as well as computational simulations, surprisingly slow MK migration, limited intervascular space and a vessel-biased MK pool were revealed, contradicting the current concept of directed MK migration during thrombopoiesis.
Platelets play an essential role in hemostasis and thrombosis, but also in the pathogenesis of ischemic stroke. Ischemic stroke, which is mainly caused by thromboembolic occlusion of brain arteries, is among the leading causes of death and disability worldwide with limited treatment options. The platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI is a key player in arterial thrombosis and a critical determinant of stroke outcome, making its signaling pathway an attractive target for pharmacological intervention. The spleen tyrosine kinase (Syk) is an essential signaling mediator downstream of GPVI, but also of other platelet and immune cell receptors. In this thesis, it was demonstrated that mice lacking Syk specifically in platelets are protected from arterial thrombus formation and ischemic stroke, but display unaltered hemostasis. Furthermore, it was shown that mice treated with the novel, selective and orally bioavailable Syk inhibitor BI1002494 were protected in a model of arterial thrombosis and had smaller infarct sizes and a significantly better neurological outcome 24 h after transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO), also when BI1002494 was administered therapeutically, i.e. after ischemia. These results provide direct evidence that pharmacological Syk inhibition might become a safe therapeutic strategy. The T cell receptor  chain-associated protein kinase of 70 kDA (Zap-70) is also a spleen tyrosine kinase family member, but has a lower intrinsic activity compared to Syk and is expressed in T cells and natural killer (NK) cells, but not in platelets. Unexpectedly, arterial thrombus formation in vivo can occur independently of Syk kinase function as revealed by studies in Sykki mice, which express Zap-70 under the control of intrinsic Syk promoter elements.
N2  - In Säugetieren werden kernlose Thrombozyten durch ihren riesigen Knochenmark- (KM-) Vorläuferzellen, die Megakaryozyten (MK), die von hämatopoetischen Stammzellen stammen, ständig produziert. Megakaryopoese und Thrombopoese wurden schon intensiv untersucht, aber die genauen Mechanismen, die die Thrombozytenproduktion aus MK kontrollieren, bleiben weitgehend unverstanden. Mittels Multiphotonen-Intravitalmikroskopie (MP-IVM) wurden Thrombopoese und Proplättchenbildung im murinen KM in Echtzeit in vivo untersucht. Dadurch wurde eine wichtige Rolle für die Proteine Profilin1, TRPM7 und RhoA in der Thrombopoese identifiziert. Derzeit wird angenommen, dass Blutzellvorläufer, wie MK, während der Reifung von der endostalen Nische in Richtung der Gefäßnische migrieren. Im Gegensatz zu diesem Paradigma wurde hier gezeigt, dass MK homogen innerhalb des dichten KM Blutgefäßnetzes verteilt sind, so dass kein Raum für Gefäß-ferne Nischen besteht. Durch Ergebnisse von in vivo MP-IVM, in situ Licht-Blatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) des intakten KM sowie Computersimulationen wurden eine überraschend langsame MK-Migration, ein begrenzter intervaskulärer Raum und eine asymmetrische MK-Verteilung gezeigt, was im Widerspruch zum derzeitig akzeptierten Konzept der gerichteten MK-Migration während der Thrombopoese steht.
Die Thrombozyten spielen eine wesentliche Rolle nicht nur bei der Hämostase und Thrombose, sondern auch in der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Der ischämische Schlaganfall, der vor allem durch einen thromboembolischen Verschluss von Gehirnarterien verursacht wird, ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung weltweit und die Behandlungsmöglichkeiten sind sehr eingeschränkt. Der thrombozytäre Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP) VI ist ein wichtiger Faktor in der arteriellen Thrombose und trägt entscheidend zur Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls bei, sodass dessen Signalweg ein attraktives Ziel für pharmakologische Interventionen darstellen könnte. Die spleen tyrosine kinase (Syk) ist ein wichtiges Molekül im GPVI-Signalweg, aber auch in den Signalkaskaden von anderen Thrombozyten- und Immunzellrezeptoren. Es wurde nachgewiesen, dass Mäuse mit einer thrombozytären Syk-Defizienz, vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt sind, aber unveränderte Hämostase zeigen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit dem neuartigen, selektiven und oral bioverfügbaren Syk-Inhibitor BI1002494 behandelt wurden, geschützt sind in einem Modell der arteriellen Thrombose. Auch hatten sie kleinere Infarkte und eine deutlich bessere neurologische Funktion 24 Stunden nach der transienten Arteria cerebri media Okklusion (tMCAO), auch wenn BI1002494 therapeutisch, d.h. nach der Ischämie, verabreicht wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die pharmakologische Hemmung von Syk eine sichere therapeutische Strategie bei Schlaganfall sein könnte. Der T-Zell Rezeptor -chain-associated protein kinase of 70 kDa (Zap-70) ist auch ein spleen tyrosine kinase-Familienmitglied, hat aber eine geringere intrinsische Aktivität im Vergleich zu Syk und wird in T-Zellen und natural killer (NK) Zellen exprimiert, nicht aber in Thrombozyten. Studien in Sykki Mäusen, die unter der Kontrolle der intrinsischen Syk Promotorelemente Zap-70 exprimieren, ergaben, dass die arterielle Thrombusbildung in vivo unabhängig von der Syk-Kinasefunktion stattfinden kann.
KW  - Thrombose
KW  - Megakaryozyt
KW  - Thrombopoese
KW  - Mikroskopie
KW  - Hämostase
KW  - Thrombosis
KW  - Megakaryocyte
KW  - Hemostasis
KW  - Microscopy
KW  - Thrombopoiesis
KW  - Platelet
KW  - Ischemic stroke
KW  - Spleen tyrosine kinase
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142933
ER  - 
TY  - THES
A1  - Popp, Michael
T1  - Mechanisms of platelet activation and receptor regulation in genetically modified mice
T1  - Mechanismen der Thrombozytenaktivierung und Rezeptorregulation in genetisch veränderten Mäusen
N2  - This work summarizes the results of studies on several major aspects of platelet activation and platelet receptor regulation. Therefore, this thesis is divided into four parts.
Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Agonist-induced elevation in cytosolic Ca2+ concentrations is essential for platelet activation in hemostasis and thrombosis. The principal route of Ca2+ influx in platelets is store-operated calcium entry (SOCE). The calcium sensor molecule stromal interaction molecule 1 (STIM1) regulates SOCE by activating the membrane calcium channel protein Orai1, but the exact mechanisms of this interaction are not fully understood. Using affinity chromatography to screen for STIM1 interacting proteins in platelets, bridging integrator 2 (BIN2), an adapter protein belonging to the family of BAR proteins that is mainly expressed in the hematopoietic system, was identified. Newly generated BIN2 KO mice were viable and fertile but their platelets displayed markedly impaired SOCE in response to thapsigargin (TG) as well as agonists acting on immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) or G protein-coupled receptors. This SOCE defect resulted in impaired (hem)ITAM induced platelet activation, aggregate formation under flow and procoagulant activity. As a consequence, mice lacking BIN2 in platelets were protected from occlusive arterial thrombus formation and thrombo-inflammatory cerebral infarct progression in a model of experimental stroke. These results identify BIN2 as a critical regulator of platelet SOCE in thrombosis and thrombo-inflammatory disease.
Integrin αIIbβ3 plays a central role in the adhesion and aggregation of platelets. Integrin activation requires the transmission of a signal from the small cytoplasmic tails of the α or β
subunit to the large extracellular domains resulting in conformational changes of the extracellular domains to enable ligand binding. It was hypothesized that Hic-5 is a novel regulator of integrin αIIbβ3 activation in mice. As demonstrated in the second part of this thesis, lack of Hic-5 had no detectable effect on platelet integrin activation and function in vitro and in vivo under all tested conditions. These results indicate that Hic-5 is dispensable for integrin αIIbβ3 activation and consequently for arterial thrombosis and hemostasis in mice.
The Rho GTPase family members RhoA and Rac1 play major roles in platelet activation at sites of vascular injury. Little is known about possible redundant functions of these Rho GTPases in regulating platelet function. To investigate functional redundancies of RhoA and Rac1 in platelet production and function, mice with MK- and platelet-specific double- deficiencies in RhoA and Rac1 were generated. RhoA/Rac1 double-deficiency phenocopied the respective single knockouts without any additional effects in the double-knockout animals, demonstrating for the first time a functional non-redundancy of RhoA and Rac1 in platelet function.
Antibodies against platelet glycoproteins (GP) trigger platelet destruction in immune thrombocytopenia (ITP) by binding to Fcγ receptors (FcγRs) on immune cells. However, antibodies against the platelet collagen receptor GPVI exert powerful anti-thrombotic action in vivo by inducing ectodomain shedding of the receptor associated with a transient thrombocytopenia. As shown in the final part of this thesis, blockade or deficiency of the inhibitory FcγRIIB abolished sequestration of anti-GPVI opsonized platelets in the hepatic vasculature and GPVI shedding. This process was mediated by liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the major FcγRIIB expressing cell type in the body. Furthermore, LSEC FcγRIIB mediated hepatic platelet sequestration and contributed to thrombocytopenia in mice treated with antibodies against αIIbβ3, the major target antigen in human ITP. These results reveal a novel and unexpected function of hepatic FcγRIIB in the processing of antibody-opsonized platelets.
N2  - Diese Arbeit fasst Untersuchungen zu verschiedenen Aspekten der Aktivierung von Thrombozyten und deren Rezeptorregulation zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in vier Teile gegliedert.
Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden, kann aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall, führen. Bei der Aktivierung der Thrombozyten kommt es zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration. Der Ca2+-Einstrom in die Thrombozyten erfolgt hauptsächlich durch den „store operated calcium entry“ (SOCE). Der Calciumsensor „stromal interaction molecule 1“ (STIM1) reguliert den SOCE indem er das Ionenkanal-bildende Protein Orai1 in der Plasmamembran aktiviert. Der genaue Mechanismus dieser Interaktion ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Durch den Einsatz von Affinitätschromatographie, um Interaktionspartner von STIM1 zu identifizieren, wurde „bridging integrator 2“ (BIN2) gefunden. BIN2 ist ein Adapterprotein, aus der Familie der BAR Proteine, welches hauptsächlich von Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert wird. BIN2-defiziente Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, aber ihre Thrombozyten zeigten einen deutlich verminderten SOCE. Diese Reduktion zeigte sich sowohl nach der Stimulation mit Thapsigargin, aber auch nach der Stimulation mit Agonisten, die „immunoreceptor tyrosine-based activation motif-“ (ITAM-) oder G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren. Der defekte SOCE führte zu verminderter (hem)ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung, reduzierter Thrombenbildung im Flusskammersystem und verminderter prokoagulanter Aktivität. Dies hatte zur Folge, dass Mäuse mit thrombozytenspezifischer BIN2-Defizienz vor arterieller Thrombose und, in einem Schlaganfallmodell, vor thrombo-inflammatorischer Infarktprogression geschützt sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass BIN2 ein wichtiger Regulator des SOCE in Thrombozyten bei Thrombosen und thrombo-inflammatorischen Erkrankungen ist.
Das Integrin αIIbβ3 spielt bei der Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten eine wichtige Rolle. Um das Integrin zu aktivieren, bedarf es einer Signalübertragung von den kleinen zytoplasmatischen Teilen der α und β Untereinheiten zu den großen extrazellulären Domänen, was zu deren Konformationsänderung führt und schließlich die Ligandenbindung ermöglicht. Es besteht die Hypothese, dass Hic-5 an der Regulation des Integrins αIIbβ3 in murinen Thrombozyten beteiligt ist. Wie im zweiten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, hat eine Hic-5 Defizienz jedoch weder in vitro noch in vivo Einfluss auf die Aktivierung und Funktion des Integrins αIIbβ3 in Thrombozyten. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hic-5 für die Aktivierung des Integrins αIIbβ3 und folglich auch für die arterielle Thrombose und Hämostase in Mäusen entbehrlich ist.
Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Rac1 spielen bei der Thrombozytenaktivierung bei Gefäßverletzungen eine wichtige Rolle. Dennoch ist wenig über redundante Funktionen von RhoA und Rac1 bei der Steuerung der Thrombozytenfunktion bekannt. Um eine mögliche funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 zu untersuchen, wurden MK- und thrombozytenspezifische RhoA und Rac1 doppelt-defiziente Tiere gezüchtet. Die Thrombozyten der Tiere zeigten die Phänotypen einer RhoA- und Rac1-Defizienz, ohne dass weiter Effekte bemerkbar waren. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass es keine funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 bei der Regulation der Thrombozytenfunktion gibt.
Antikörper, die gegen Glykoproteine auf Thrombozyten gerichtet sind, führen bei einer Immunthrombozytopenie (ITP) durch die Bindung an Fcγ Rezeptoren auf Immunzellen, zu einer Zerstörung der Thrombozyten. Eine Ausnahme sind Antikörper gegen den Kollagenrezeptor GPVI der Thrombozyten. Hier führen diese Antikörper zu einem starken antithrombotischen Schutz in vivo, indem sie das sog. „Shedding“ der Ektodomäne des Rezeptors und nur eine vorübergehende Thrombozytopenie auslösen. Im letzten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die Blockade, also auch das vollständige Fehlen des inhibitorischen FcγRIIB, die Sequestrierung von anti-GPVI-opsonierten Thrombozyten und das Shedding von GPVI verhindert. Für diese Prozesse ist speziell der FcγRIIB auf „liver sinusoidal endothelial cells“ (LSEC) ursächlich. Ferner konnte gezeigt werden, dass FcγRIIB auf LSECs auch für die Sequestrierung von Thrombozyten und die Thrombozytopenie in Mäusen, die mit Antikörpern gegen αIIbβ3, dem Hauptantigen bei humaner ITP, behandelt wurden, verantwortlich ist. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue und unerwartete Funktion des hepatischen FcγRIIB bei der Reaktion auf Antikörper-opsonierte Thrombozyten.
KW  - Hämostase
KW  - Maus
KW  - Thrombose
KW  - Thrombozyt
KW  - Schlaganfall
KW  - RhoGTPase
KW  - Hic-5
KW  - SOCE
KW  - GPVI
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135494
ER  -