TY - THES A1 - Chen, Wenchun T1 - Studies on the role of calcium channels and the kinase domain of transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) in platelet function T1 - Studien über die Rolle von Calcium Kanälen und der Kinase Dömane von transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) für die Thrombozytenfunktion N2 - Platelet activation and aggregation are essential processes for the sealing of injured vessel walls and preventing blood loss. Under pathological conditions, however, platelet aggregation can lead to uncontrolled thrombus formation, resulting in irreversible vessel occlusion. Therefore, precise regulation of platelet activation is required to ensure efficient platelet plug formation and wound sealing but also to prevent uncontrolled thrombus formation. Rapid elevations in the intracellular levels of cations are a core signaling event during platelet activation. In this thesis, the roles of Ca2+ and Mg2+ channels in the regulation of platelet function were investigated. Orai1, the major store-operated calcium (SOC) channel in platelets, is not only vital for diverse signaling pathways, but may also regulate receptor-operated calcium entry (ROCE). The coupling between the Orai1 signalosome and canonical transient receptor potential channel (TRPC) isoforms has been suggested as an essential step in the activation of store-operated calcium entry (SOCE) and ROCE in human platelets. However, the functional significance of the biochemical interaction between Orai and TRPC isoforms still remains to be answered. In the first part of this thesis, the functional crosstalk between Orai1 and TRPC6 was addressed. Orai1-mediated SOCE was found to enhance the activity of phospholipases (PL) C and D, to increase diacylglycerol (DAG) production and finally to regulate TRPC6-mediated ROCE via DAG, indicating that the regulation of TRPC6 channel activity seems to be independent of the physical interaction with Orai1. Furthermore, Orai1 and TRPC6 double deficiency led to a reduced Ca2+ store content and basal cytoplasmic Ca2+ concentrations, but surprisingly also enhanced ATP secretion, which may enhance Ca2+ influx via P2X1 and compensate for the severe Ca2+ deficits seen in double mutant platelets. In addition, Orai1 and TRPC6 were not essential for G protein-coupled receptor (GPCR)-mediated platelet activation, aggregation and thrombus formation. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) contains a cytosolic serine/threonine protein kinase. To date, a few in vitro substrates of the TRPM7 kinase have been identified, however, the physiological role of the kinase remains unknown. In the second part of this thesis, mice with a point mutation which blocks the catalytic activity of the TRPM7 kinase (Trpm7KI) were used to study the role of the TRPM7 kinase in platelet function. In Trpm7KI platelets phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) metabolism and Ca2+ mobilization were severely impaired upon glycoprotein (GP) VI activation, indicating that the TRPM7 kinase regulates PLC function. This signaling defect in Trpm7KI platelets resulted in impaired aggregate formation under flow and protected animals from arterial thrombosis and ischemic brain infarction. Altogether, these results highlight the kinase domain of TRPM7 as a pivotal signaling moiety implicated in the pathogenesis of thrombosis and cerebrovascular events. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sind zwei elementare Prozesse für das Abdichten verletzter Gefäßwände und damit zur Verhinderung von exzessivem Blutverlust. Unter pathologischen Bedingungen kann die Thrombozytenaggregation jedoch zur unkontrollierten Thrombusbildung und folglich zum irreversiblen Gefäßverschluss führen. Daher ist eine präzise Regulation der Thrombozytenaktivierung wichtig, um effizient Gefäßverletzungen zu schließen aber gleichzeitig eine unkontrollierte Thrombusbildung zu verhindern. Schnelle Veränderungen der zytoplasmatischen Konztentration von Kationen stellen ein Kernelement der Signaltransduktion während der Plättchenaktivierung dar. In dieser Arbeit wurden die Rolle von Ca2+ und Mg2+ Kanälen in der Regulation der Thrombozytenfunktion untersucht. Orai1, der bedeutendste store-operated calcium (SOC) Kanal in Thrombozyten, ist nicht nur entscheidend für verschiedene Signalwege, sondern reguliert möglicherweise auch receptor-operated calcium entry (ROCE). Die Kopplung zwischen dem Orai1-Signalkomplex und canonical transient receptor potential channel (TRPC) Isoformen wurde als entscheidender Schritt in der Aktivierung in der Aktivierung von store-operated calcium entry (SOCE) und ROCE in humanen Thrombozyten vermutet. Die Frage nach der funktionellen Relevanz der Interaktion zwischen Orai und TRPC Isoformen blieb jedoch unbeantwortet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der funktionelle Crosstalk zwischen Orai1 und TRPC6 adressiert. Hierbei zeigte sich, das Orai1-vermittelter SOCE die Aktivität der Phosholipasen (PL) C und D steigert, die Diacylglycerol (DAG) Produktion verstärkt und schließlich TRPC6-vermittelten ROCE via DAG reguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulation der TRPC6 Kanalaktivität unabhängig von einer direkten Interaktion mit Orai1 zu sein scheint. Darüber hinaus führte die Doppeldefizienz von Orai1 und TRPC6 zu verringerten Ca2+ Konzentrationen in intrazellulären Ca2+-Speichern und im Zytoplasma der Thrombozyten. Überraschenderweise war auch die ATP-Sekretion erhöht, was eventuell den Ca2+-Einstrom durch P2X1 verstärkt und möglicherweise das starke Ca2+-Defizit in den doppeldefizienten Thrombozyten kompensiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orai1 und TRPC6 nicht für die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sowie für die Thrombusbildung mittlels G protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) benötigt werden. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) enthält eine zytosolische Serin/Threonin-Kinase Domain. Bislang wurden zwar wenige in vitro Substrate der TRPM7 Kinase identifiziert, jedoch ist die physiologische Rolle dieser Kinase immer noch unbekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer Punktmutation, welche die katalytische Aktivität der TRPM7 Kinase blockiert (Trpm7KI) eingesetzt um die Rolle der TRPM7 Kinase für die Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In Trpm7KI Thrombozyten war der Metabolismus von phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und die Ca2+-Mobilisierung nach Aktivierung des Rezeptors Glykoprotein (GP) VI schwer beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der TRPM7 Kinase die Funktion der PLC reguliert. Aus diesem Signaltransduktionsdefekt in Trpm7KI Thrombozyten resultierte eine verringerte Aggregatbildung unter Flussbedingungen und ein Schutz der Tiere vor arteriellen Thrombosen und ischämischem Schlaganfall. Zusammenfassend heben diese Ergebnisse die Kinasedomäne von TRPM7 als einen ausschlaggebenden Bestandteil in Signalkaskaden hervor und implizieren eine Rolle dieser Domäne in der Pathogenese von ischämischen Kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Calciumkanal KW - Protein TRPC6 KW - Platelet KW - Orai1 KW - Crosstalk KW - TRPM7 kinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103719 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER -