TY - THES A1 - Knobloch, Gunnar T1 - Biochemical and structural characterization of chronophin T1 - Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Chronophin N2 - The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency. N2 - HAD Phosphatasen gehören zu einer phylogenetisch alten Proteinfamilie, die in allen drei Domänen des Lebens vertreten ist. Enzyme dieser vergleichsweise wenig charakterisierten Familie von Phosphatasen erweisen sich zunehmend als biomedizinisch interessante Zielmoleküle, da immer mehr Krankheiten identifiziert werden, bei denen HAD Phosphatasen eine Rolle spielen. In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die HAD Phosphatase Chronophin biochemisch und strukturell charakterisiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass Chronophin die Proteine Cofilin-1, ein Schlüsselprotein in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts, und den Steroidrezeptor Coaktivator 3 (SRC-3) dephosphoryliert. Darüberhinaus ist bekannt, dass Chronophin eine spezifische Pyridoxal 5'-Phosphat (PLP, Vitamin B6) Phosphatase ist, und somit an der Regulation verschiedenster Signalwege beteiligt ist. Die hier beschriebene Analyse von Chronophin beinhaltet die Untersuchung intrinsischer Regulationsmechanismen, wie z.B. Determinanten der Substratspezifität, die allosterische Regulation über Dimerisierung, bis hin zur Kontrolle durch extrinsische Faktoren wie interagierende Proteine oder Inhibitoren. Die Interaktion von Chronophin mit den kürzlich in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartnern CIB1 (Kalzium- und Integrin-bindendes Protein 1) und Calmodulin wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter und gereinigter Proteine untersucht. Dabei kam heraus, dass sich die Assoziation von CIB1 und Calmodulin an Chronophin gegenseitig ausschließt, und dass dieser Prozess durch Kalzium reguliert wird. Dabei beeinflusst weder die Bindung an CIB1 noch an Calmodulin die Phosphataseaktivität von Chronophin gegenüber den Substraten PLP oder phosphoryliertem Cofilin-1. Möglicherweise regulieren die beiden interagierenden Proteine die Funktion von Chronophin auf eine andere, hier nicht weiter untersuchte Art und Weise. Der Einfluss der Chronophin-Dimerisierung wurde untersucht, indem wir eine konstitutiv monomere Variante des üblicherweise dimeren Chronophins geschaffen haben. Diese monomere Variante des Enzyms wies eine deutlich reduzierte Aktivität gegenüber PLP auf. Durch röntgenkristallographische Analysen des wild-typischen Proteins und der monomeren Variante konnten wir zeigen, dass die Dimerisierung von Chronophin notwendig ist, um ein Strukturelement, welches wichtig für die Substratspezifität ist, in einer korrekten Position zu halten. Dieser allosterische Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Substratspezifität war bisher unbekannt, und trifft möglicherweise auf alle Proteine der C2a Unterfamilie von HAD Phosphatasen zu, die strukturell mit Chronophin verwandt sind. Die Faktoren, welche auf die Substratspezifität von Chronophin Einfluss nehmen wurden untersucht, indem einzelne Proteindomänen mit dem paralogen Protein AUM ausgetauscht, und die so geschaffenen Protein-Hybride biochemisch untersucht wurden. Durch das Lösen der röntgenkristallographischen Struktur eines Protein-Hybrids, bestehend aus der katalytischen Domäne von Chronophin und der capping-Domäne von AUM, konnte die die erste partielle Struktur von AUM untersucht werden. Mit Hilfe dieser strukturellen Information und durch bioinformatische Analysen konnten anschließend die unterschiedliche Substratspezifitäten der beiden paralogen Phosphatasen Chronophin und AUM in einem evolutionsbiologischen Kontext untersucht werden. Zusätzlich wurden vier mögliche Chronophin-Inhibitoren auf der Basis der PLP-Struktur synthetisiert. Die biochemische Analyse der Substanzen als Chronophin-Hemmer ergab moderate inhibitorische Eigenschaften mit IC50-Werten im micromolaren Bereich. Jedoch stellen die hier charakterisierten Inhibitoren nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von Chronophin als PLP-Phosphatase dar. Die röntgenkristallographische Struktur von Chronophin mit einem der Inhibitoren liefert außerdem eine wichtge Grundlage für die zukünfitige Verbesserung der Inhibitoren bezüglich Effektivität und Spezifität. KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Dimerisierung KW - Inhibitor KW - Chronophin KW - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase KW - Haloacid dehalogenase KW - HAD phosphatase KW - PLP phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088 ER - TY - THES A1 - Schulze, Markus T1 - Role of Chronophin for glioma cell migration and invasion T1 - Die Rolle von Chronophin für die Migration und Invasion von Gliomzellen N2 - Abstract Glioblastomas, primary brain tumors, represent a tumor entity with a dismal prognosis and a median survival of only about one year. Invasion into the healthy brain parenchyma contributes substantially to the malignancy of this type of brain tumor. Therefore, a better understanding of the mechanisms promoting the invasive behavior of these brain tumors is needed to identify new therapeutic targets. Cofilin, an actin regulatory protein, has been shown to be an important regulator of the invasive behavior of tumor cells in other types of cancer and the actin cytoskeleton is involved in the formation of a variety of cellular structures important for cell migration and invasion. Cofilin is regulated by phosphorylation on a single residue, serine 3. The aim of this thesis was to examine the role of the cofilin regulatory phosphatase chronophin for glioma cell migration and invasion. First, it was established that chronophin depletion in the cell line GBM6840 leads to an increase in the ratio of phosphorylated cofilin to total cofilin. Higher chronophin levels were correlated with a decrease in F-actin in the cell lines GBM6840 and U87 as measured in an actin spin down assay and in a flow cytometry based assay. Furthermore, it was shown that knockdown of chronophin in two different cell lines, GBM6840 and DBTRG-05-MG, strongly increased their invasiveness in vitro. Expression of human chronophin in the cell line U87 decreased its invasiveness substantially. There was no difference in cell proliferation between GBM6840 and DBTRG-05-MG cells expressing a chronophin targeting shRNA or a control shRNA and U87 cells transfected with an empty vector or a human chronophin encoding plasmid. The increase in invasiveness after chronophin depletion could be correlated with an increase in directionality in cell migration under 2D culture conditions in the cell lines U87 and GBM6840. Moreover, treatment with the ROCK inhibitor Y-27632 decreased directionality in GBM6840 cells under 2D culture conditions and reduced the invasiveness of GBM6840 chronophin shRNA cells back to control levels. Expression of a non-phosphorylatable cofilin mutant, the S3A mutant, was able to reduce invasiveness and to reduce directionality under 2D culture conditions back to control levels in GBM6840 chronophin shRNA cells. This provides important evidence for the involvement of cofilin phosphoregulation in the phenotypes described above. In vivo, when injected into NOD-SCID mice, chronophin depleted cells showed a dramatic growth reduction as compared to control and rescue cells. Transciptomic characterization of GBM6840 cells by microarray analysis and subsequent comparison of the data with microarray profiles of normal brain tissues and different glioma entities identified two specifically chronophin regulated transcripts potentially involved in tumor progression and invasion, MXI1 and EDIL3. Moreover, c-myc was identified as a significantly altered transcription factor after chronophin deregulation based on the number of c-myc target molecules in the microarray dataset. MXI1 is a potential negative regulator of c-myc dependent transcription, and was strongly downregulated after chronophin knockdown in GBM6840. In line with this, the activity of a c-myc reporter plasmid was increased after chronophin depletion in GBM6840 and reduced after chronophin expression in U87 cells. However, the protein level of the c-myc protein was reduced after chronophin depletion in GBM6840. Finally, anaylsis of the expression of proteases known to be important for glioblastoma pathogenesis revealed no major changes in protease expression between chronophin depleted and control cells. Therefore, a comprehensive analysis of chronophin in the context of glioma pathogenesis has been performed in this thesis. It has been shown that chronophin depletion strongly enhanced invasiveness of glioma cells and that it induced transcriptomic changes potentially involved in tumor progression. The proteins regulating cofilin phosphorylation are therefore valuable therapeutic targets for anti-invasive therapy in glioblastomas. Inhibitors for kinases upstream of cofilin, e.g. LIMKs and ROCKs, are available, and might be promising agents for anti-invasive therapy. N2 - Zusammenfassung Glioblastome sind primäre Gehirntumore, die eine besonders schlechte Prognose besitzen und bei denen die mediane Überlebenszeit nur ca. ein Jahr beträgt. Zur Malignität dieses Tumortyps trägt entscheidend das Eindringen der Tumorzellen in das gesunde Hirnparenchym bei. Daher ist es notwendig die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, um neue therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren. Cofilin, ein Protein das das Aktinzytoskellet reguliert, ist in anderen Krebsarten als wichtiger Regulator des invasiven Verhaltens von Zellen bekannt und das Aktinzytoskellet ist an der Bildung einer Vielzahl von zellulären Strukturen beteiligt, die wichtig für die Zellmigration und –invasion sind. Cofilin wird über die Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure, des Serin 3, reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Cofilin regulatorischen Phosphatase Chronophin für Zellmigration und -invasion zu untersuchen. Zuerst konnte gezeigt werden, dass eine Chronophin Depletion in der Zelllinie GBM6840 zu einer Zunahme des Anteils von P-Cofilin am Gesamtcofilin führt. Ebenso war ein hohes Chronophin Level in den Zelllinien GBM6840 und U87 mit einer Abnahme des F-Actin Levels korreliert, was in einem Aktin spin down Assay als auch mittels Durchflusszytrometrie gemessen werden konnte. Es konnte weiter gezeigt werden, dass eine shRNA vermittelte Depletion des Chronphin zu einer starken Zunahme der Invasivität in den Zelllinien GBM6840 und DBTRG-05-MG in vitro führt. Chronophin Expression in der Zelllinie U87 führte zu einer starken Abnahme der Invasivität. Es gab hingegen keinen Chronophin abhängigen Unterschied in der Proliferation von GBM6840 und DBTRG-05-MG Zellen, die entweder eine Kontroll- oder eine Chronophin gerichtete shRNA exprimierten, sowie keinen zwischen U87 Zellen, die mit einem Leervektor oder einem Chronophin codierenden Konstrukt transfiziert worden waren. Die Zunahme der Invasion nach Chronophin Depletion konnte mit einer Zunahme der Direktionalität der Zellen bei der Migration in einer 2D Umgebung korreliert werden. Desweiteren konnte durch Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in GBM6840 Zellen eine Erniedrigung der Direktionalität bei der Migration in 2D Kultur ebenso erreicht werden, wie eine Reduktion der Invasivität von Chronophin shRNA exprimierenden GBM6840 Zellen auf Kontrollniveau. Die Expression einer nicht-phosphorylierbaren Cofilin Mutante, der S3A Mutante, erniedrigte sowohl die Direktionalität in der 2D Migration als auch die Invasivität von GBM6840 Chronophin shRNA exprimierenden Zellen zurück auf Kontrollniveau. Diese Experimente lieferten wichtige Hinweise darauf, dass die Phosphoregulation von Cofilin ursächlich an der Entstehung der Phänotypen beteiligt war, die nach Chronophin Knockdown beobachtet wurden. In vivo konnte nach Injektion in NOD-SCID Mäuse eine dramatische Wachstumsreduktion der Chronophin depletierten Zellen gemessen werden. Durch Charakterisierung des Transkriptoms der Zelllinie GBM6840 mittels Microarrays und nachfolgender Vergleich der Ergebnisse mit Microarray-Profilen von Normalhirngewebe und verschiedenen Gliomentitäten konnten zwei spezifisch Chronophin abhängig regulierte Transkripte identifiziert werden, MXI1 und EDIL3, die potentiell mit der Progression und Invasivität von Gliomen verknüpft sind. MXI1, ein potentieller negativer Regulator der c-myc abhängigen Transkription, war nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 stark herunterreguliert. In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Aktiviät eines c-myc Reporterplasmids nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 erhöht, nach Chronophin Expression in U87 jedoch erniedrigt. Das c-myc Protein selbst wies eine deutliche Reduktion nach Chronophin Depletion in GBM6840 auf. Abschließend wurde die Expression von Proteasen untersucht, für die eine Rolle in der Gliominvasion bekannt ist. Hier wurden jedoch keine größeren Chronophin abhängigen Expressionsunterschiede gefunden. Zusammenfassend gesagt konnte eine umfassende Charakterisierung der Rolle des Chronophin in der Gliompathogenese erreicht werden. Zum einen konnte gezeigt werden, dass Chronophin ein äußerst wichtiger Regulator der Invasion ist, zum anderen dass es zu Chronophin abhängigen transkriptomischen Veränderungen kommt, die potentiell zur Malignisierung des Tumors beitragen. Daher sind die Proteine die die Cofilinphosphorylierung regulieren potentielle therapeutische Zielmoleküle für eine anti-invasive Therapie im Glioblastom. Inhibitoren für die Kinasen, die Regulatoren des Cofilin sind, die ROCK- und LIM-Kinasen, sind verfügbar und stellen möglicherweise vielversprechende Substanzen für die anti-invasive Therapie dar. KW - Zellmigration KW - Chronophin KW - Invasion KW - Glioblastom KW - Gliom KW - PDXP KW - Glioma KW - Glioblastoma KW - Invasion KW - Migration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109292 ER - TY - THES A1 - Zink [geb. Sondergeld], Thomas Gerd T1 - Der Cofilin-Signalweg im Glioblastoma multiforme - Ursachen für den Verlust von Chronophin und Einfluss von LIM-Kinase-Inhibitoren T1 - The cofilin pathway in glioblastoma multiforme - Reasons for chronophin loss and effect of LIM-kinase inhibitors N2 - Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2. Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe. N2 - The invasive potential of malignant gliomas is the main reason for the dismal prognosis of this tumor entity. Migration and invasion of tumor cells is crucially determined by the cofilin dependent reorganization of the actin cytoskeleton regulated by the activity of antagonistic cofilin kinases and phosphatases. This study revealed a progressive loss of expression of the cofilin phosphatase chronophin with increasing malignancy grade of astrocytic glioma, accompanied by an increase of cofilin phosphorylation. Moreover, the analyzed glioma specimens were characterized by a simultaneous increase of expression of the cofilin kinase LIMK-2. Integrated genetic and epigenetic analysis of the chronophin locus identified an aberrant promoter methylation as a possible mechanism leading to chronophin down-regulation in glioblastoma tissue samples. In contrast, molecular alterations of the chronophin locus were undetectable in glioblastoma cell lines characterized by different chronophin expression levels. Analysis of glioblastoma cells demonstrated striking effects of ROCK and LIMK inhibitors on cell morphology, providing first evidence of the induction of a stellate cell-phenotype by the LIMK inhibitor BMS-5. While ROCK and LIMK inhibitors had no detectable effect on the 2D motility of the tumor cells, the inhibitors increased or decreased the 3D-invasiveness of the glioma cells depending on their basal cofilin activity. The findings of this study stress the importance of the cofilin signaling pathway as a key regulator of glioma migration and invasion, indicate novel targets for glioma therapy, but also warn against a noncritical use of new drugs. KW - Cofilin KW - Glioblastom KW - Chronophin KW - Actin KW - Rho-Proteine KW - PDXP KW - LIMK KW - BMS-5 KW - Signalkette KW - Rho-GTPasen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127065 ER - TY - THES A1 - Kestler, Christian T1 - Untersuchungen über die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin T1 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin N2 - Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern. N2 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin KW - Dimerisierung KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Ortspezifische Mutagenese KW - Chronophin KW - Substratspezifitätsschleife Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777 ER - TY - THES A1 - Wilhelm, Christian T1 - Die Rolle von Chronophin bei Schlaganfall-induziertem Funktionsverlust der Blut-Hirn-Schranke T1 - The role of chronophin in stroke-induced loss of function of the blood-brain barrier N2 - Der ischämische Schlaganfall ist mit einer jährlichen Inzidenz von 200/100 000 Einwohnern die häufigste Gefäßerkrankung in Deutschland. Atherothrombose, arterielle Hypertonie und Embolien unterschiedlichen Ursprungs sind die wesentlichen Ursachen des ischämischen Schlaganfalls. Die neurologischen Defizite nach einem Schlaganfall resultieren aus einem gestörten zerebralen Blutfluss und somit einer insuffizienten Sauerstoffversorgung. Zusätzlich ist die Ödembildung, welche von einer gesteigerten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke verursacht wird, am neuronalen Zelltod beteiligt. Chronophin ist eine Aktinzytoskelett-regulierende Serin-Phosphatase. In einem ischämischen Schlaganfall-Modell konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der globale Verlust von Chronophin zu einer vermehrten Ödembildung und einem aggravierten neurologischen Zustand der Mäuse im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen führte. Hirnlysate von wildtypischen Mäusen zeigten verringerte Chronophin-Level in der vom Schlaganfall betroffenen Hemisphäre. Jedoch konnten initiale immunhistochemische und zellbiologische Untersuchungen weder Chronophin-abhängige Veränderungen der Blut-Hirn-Schranke feststellen noch einen zerebralen Zelltyp identifizieren, der für den schützenden Effekt von Chronophin verantwortlich ist. Diese Ergebnisse weisen auf einen komplexen, vielzelligen Mechanismus hin, dem die schützende Rolle von Chronophin im ischämischen Schlaganfall unterliegt. Die Entschlüsselung dieses Mechanismus ist Aufgabe künftiger Untersuchungen. N2 - Ischemic stroke is the most common vessel disease with a yearly incidence of more than 200/100 000 inhabitants in Germany. Atherothrombosis, hypertension and embolisms of different origin are major causes of ischemic stroke. The neurological deficits following stroke result from impaired cerebral blood flow and thus insufficient oxygen supply. In addition, edema formation caused by an increased permeability of the blood-brain barrier also contributes to neural cell death. Chronophin is an actin cytoskeleton regulating serine phosphatase. Employing an ischemic stroke model, this work shows that the whole-body loss of chronophin resulted in increased edema formation and an aggravated neurological state of mice compared to the wildtype controls. Brain lysates of wildtype mice showed decreased levels of chronophin on the ipsilateral hemisphere after experimental stroke. However, initial immunohistochemical and cell biological investigations could neither determine chronophin-dependent changes of the blood-brain barrier, nor identify a cerebral cell type which is responsible for the protective effect of chronophin. These findings suggest a complex, multicellular mechanism that underlies the protective role of chronophin in ischemic stroke. This mechanism has to be decoded in further studies. KW - Schlaganfall KW - Chronophin KW - Blut-Hirn-Schranke KW - PDXP KW - Phosphatase KW - chronophin KW - stroke KW - blood-brain barrier KW - phosphatase KW - pdxp Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163877 ER - TY - THES A1 - Zink, Christoph T1 - Biochemische und strukturbiologische Charakterisierung der Inhibition der Pyridoxal 5´-Phosphat Phosphatase durch 7,8-Dihydroxyflavon T1 - Biochemical and structural characterization of pyridoxal 5´-phosphate phosphatase inhibitor 7,8-dihydroxyflavone N2 - Die Pyridoxal-5‘-Phosphat Phosphatase (PDXP), auch bekannt als Chronophin (CIN), ist eine HAD-Phosphatase, die beim Menschen ubiquitär exprimiert wird und eine entscheidende Rolle im zellulären Vitamin-B6-Metabolismus einnimmt. PDXP ist in der Lage Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), die co-enzymatisch aktive Form von Vitamin B6, zu dephosphorylieren. In-vivo Studien mit Mäusen zeigten, dass die Abwesenheit von PDXP mit verbesserten kognitiven Leistungen und einem verringerten Wachstum von Hirntumoren assoziiert ist. Dies begründet die gezielte Suche nach einem pharmakologischen Inhibitor für PDXP. Ein Hochdurchsatz-Screen legte nahe, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) hierfür ein potenzieller Kandidat ist. Zahlreiche Studien beschreiben bereits vielfältige positive neurologische Effekte nach in-vivo Administration von 7,8-DHF, allerdings bleibt der genaue Wirkmechanismus umstritten und wird bis dato nicht mit PDXP in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit ist es, die Inhibition von PDXP durch 7,8-DHF näher zu charakterisieren und damit einen Beitrag zur Beantwortung der Frage zu leisten, ob PDXP an den 7,8-DHF-induzierten Effekten beteiligt ist. Hierzu wurde der Effekt von 7,8-DHF auf die enzymatische Aktivität von rekombinant hergestelltem, gereinigtem PDXP in in-vitro Phosphatase-Assays charakterisiert. Um die Selektivität von 7,8-DHF gegenüber PDXP zu untersuchen, wurden fünf weitere HAD-Phosphatasen getestet. Unter den analysierten Phosphatasen zeigte einzig die dem PDXP nah verwandte Phosphoglykolat Phosphatase (PGP) eine geringer ausgeprägte Sensitivität gegen 7,8-DHF. Ein Vergleich von 7,8-DHF mit sechs strukturell verwandten, hydroxylierten Flavonen zeigte, dass 7,8-DHF unter den getesteten Substanzen die höchste Potenz und Effektivität aufwies. Außerdem wurde eine Co-Kristallisation von PDXP mit 7,8-DHF durchgeführt, deren Struktur bis zu einer Auflösung von 2,0 Å verfeinert werden konnte. Die in der Kristallstruktur identifizierte Bindungsstelle von 7,8-DHF an PDXP wurde mittels verschiedener, neu generierter PDXP-Mutanten enzymkinetisch bestätigt. Zusammenfassend zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse, dass 7,8-DHF ein direkter, selektiver und vorwiegend kompetitiver Inhibitor der PDXP-Aktivität ist, mit einer IC50 im submikromolaren Bereich. Die Ergebnisse dieser in-vitro Untersuchungen motivieren zu weiterer Forschung bezüglich der 7,8-DHF-vermittelten Inhibition der PDXP-Aktivität in Zellen, um die Frage beantworten zu können, ob PDXP auch in-vivo ein relevantes Target für 7,8-DHF darstellt. N2 - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase (PDXP, also known as chronophin, CIN), is a ubiquitously expressed HAD-phosphatase. PDXP is known to dephosphorylate pyridoxal-5'-phosphate (PLP), the biologically active form of vitamin B6 that is one of the most versatile cofactors found in nature. In-vivo studies revealed improved cognition and impaired glial tumor growth with mice absent of PDXP, and caused the search for a pharmacological inhibitor of PDXP. The result of a high-throughput screen suggested that 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) is a suitable candidate for this. Interestingly, numerous scientific studies highlighted diverse positive neurological effects after administration of 7,8-DHF to mice, however, the precise mode of action remains disputed, and at this date is unrelated to PDXP. The aim of this work is to characterize the inhibition of PDXP by 7,8-DHF. This approach is a first step to determine whether 7,8-DHF may indeed exert some of its neurological effects via PDXP inhibition. For this purpose, the effect of 7,8-DHF on the enzymatic activity of recombinantly expressed and purified PDXP was characterized in in-vitro phosphatase assays. To investigate the selectivity of 7,8-DHF on PDXP, five additional HAD phosphatases were tested. Among the phosphatases analyzed, only the phosphoglycolate phosphatase (PGP), closely related to PDXP, showed a less pronounced sensitivity to 7,8-DHF. A comparison of 7,8-DHF with six structurally related, hydroxylated flavones showed that 7,8-DHF had the highest potency and effectiveness among the substances tested. In addition, a co-crystallization of PDXP with 7,8-DHF was carried out. The resulting co-crystal structure could be resolved and refined to a resolution of 2.0 Å. The binding site of the ligand to the enzyme identified in the crystal structure was confirmed via activity-based assays using various newly generated PDXP mutants. In summary, the results described here show that 7,8-DHF is a direct, selective, and predominantly competitive inhibitor of PDXP activity with an IC50 in the submicromolar range. The results of these in-vitro studies motivate further research into the 7,8-DHF-mediated inhibition of PDXP activity in cells to be able to answer the question of whether PDXP is also a relevant target for 7,8-DHF in-vivo. KW - Pyridoxalphosphat KW - Pyridoxalphosphat Phosphatase KW - PDXP KW - 7,8-Dihydroxyflavon KW - 7,8-dihydroxyflavone KW - Chronophin KW - Pyridoxal phosphate phosphatase Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251511 ER -