TY  - THES
A1  - Faul, Thomas
T1  - Lokalisation und Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes
T1  - Localization and dynamics of replication proteins of the murine pre-replicative complex
N2  - Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-Übergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und während der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzelluläre Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 % von CDC6-EGFP während der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen für Cyclin-abhängige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste für die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern führt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilität von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilität des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erhöht. In der G1-Phase wurde die Mobilität von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilität von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelförmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. Während ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifität der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-Übergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody während der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilität des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleolären Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 %igen immobilen Fraktion vorlag während das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar.
N2  - One task of this work was to analyze the localization and the dynamics of murine replication proteins in murine fibroblasts in vivo. Therefore, these proteins were expressed as EGFP fusion proteins and analyzed with a confocal laser scanning microscope in vivo. During G1 phase CDC6-EGFP was diffusely distributed throughout the cell. At entry into S phase an increased intensity of CDC6-EGFP staining was found throughout the nucleus, concurrent with the appearance of numerous foci. CDC6-EGFP localized during S phase in replication foci. Endogenous Cdc6p showed an identical cell cycle-specific distribution pattern as CDC6-EGFP in transfected cells. The distribution pattern of fusion proteins of human Cdc6p in HEK-293T was identical to that of murine CDC6-EGFP in L cells. FRAP experiments demonstrated that ~80-90% of CDC6-EGFP were stably associated with the replication apparatus during S phase. To investigate the influence of the phosphorylation status of the three Cdk sites on subcellular localization of CDC6-EGFP in vivo, these sites were mutated. Mutation of conserved serine residues within these consensus sites to nonphosphorylatable alanine residues had no effect on localization of corresponding mutants in replication factories, indicating that phosphorylation of these Cdk sites is dispensable for localization of CDC6-EGFP in replication factories. Mutation of serine residues to aspartates to mimic the negative charge of a phosphate indicated that phosphorylation of serine residue 102 mediates cytoplasmatic localization of CDC6-EGFP. FRAP studies of CDC6-EGFP mutants documented that serine residue 82 of CDC6-EGFP in replication factories was phosphorylated while serine residue 102 was non-phosphorylated. Interestingly, no colocalization of replication foci and acetylated proteins was observed, indicating hypoacetylation of chromatin in replication foci during DNA replication. Treatment of cells expressing CDC6-EGFP with TSA had no influence on localization and dynamics of CDC6-EGFP in replication foci. However, the mobility of the nucleoplasmatic pool of CDC6-EGFP was enhanced. The dynamics of CDC6-EGFP were reduced after TSA treatment during G1 phase. ORC1-EGFP accumulated in globular structures in the nucleus while ORC2-EGFP was diffusely distributed throughout the cells. ORC3-EGFP was localized in “PML nuclear bodies”. ORC4-EGFP and ORC5-EGFP were found to be localized at the centrosome. ORC6-EGFP accumulated in nucleoli. EGFP fusion proteins of Cdc45p, DNA ligase I and PCNA were diffusely distributed in the nucleus. Another task of this work was the identification of in vitro substrates of murine Cdc7p/Dbf4p kinase. Recombinant in Sf9 cells expressed Cdc7p/Dbf4p phosphorylated Orc2p, Orc6p, Cdc45p and Mcm6p in vitro. Phosphopeptide maps of phosphorylated Cdc7p revealed, that Cdc7p was phosphorylated by CyclinE/Cdk2 at one site, whereas CyclinA/Cdk2 phosphorylated Cdc7p at two different sites. CDC7-EGFP was diffusely distributed in the nucleus during G1 phase, G1/S and S phase. Using FISH chromosomal localization of mouse Cdc7 gene was mapped to chomosome 5, band 5E. To identify in vitro substrates of murine Plk1p, kinase assays were performed using pre-RC proteins as substrate. Recombinant in Sf9 cells expressed Plk1 kinase phosphorylated Cdc7p, Orc2p and Orc6p in vitro. Immunofluorescence studies indicated a colocalization of Plk1p with Cdc7p and Orc6p at midbody in telophase of mitosis. In the last part of this work, the mobility of murine transcription termination factor TTF-I was analyzed by FRAP. EGFP-tagged full-length TTF-I and EGFP-NRD were distributed throughout the whole nucleolus. The localization of EGFP-TTFdeltaN185, on the other hand, was more distinct. FRAP experiments with cells expressing EGFP-TTFdeltaN185 indicated the presence of a immobile fraction of ~10% while full-length EGFP-TTF-I was 100% mobile. The nucleolar protein TIP5 interacts with TTF-I. EGFP-TIP5 was freely distributed in the nucleus, whereas nucleolar regions were excluded from nuclear localization. Cotransfections of EGFP-TIP5 with EYFP-TTFdeltaN185 demonstrated, that EGFP-TIP5 was not coimported into nucleoli by EYFP-TTFdeltaN185. By use of BRET, protein-protein interactions between Orc6p and TTF-I were detected while interaction between Orc6p and TTFdeltaN185 were not observed.
KW  - Maus
KW  - Replikation
KW  - Proteine
KW  - DNA-Replikation
KW  - Cdc6
KW  - FRAP
KW  - FLIP
KW  - BRET
KW  - DNA-replication
KW  - Cdc6
KW  - FRAP
KW  - FLIP
KW  - BRET
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10473
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zellner, Elisabeth
T1  - Wechselwirkungen zwischen Replikationsproteinen und Origin-DNA während Proliferation und terminaler Differenzierung
T1  - Interactions between replication proteins and origin DNA during proliferation and terminal differentiation
N2  - Ein Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Fragestellung, ob beim Übergang von Proliferation zu Teilungsruhe und Differenzierung irreversible Veränderungen in der Zusammensetzung des präreplikativen Komplexes auftreten. Ein dafür geeignetes System ist die murine C2C12-Zell-Linie, die durch Kultivierung in Hungermedium zu Myotuben differenziert werden können. FACS-Analyse und BrdU-Einbau ergaben, dass in den Muskelzellen keine signifikante DNA-Synthese mehr stattfindet. Die Fluktuation von Replikationsproteinen wurde im Verlauf der terminalen Differenzierung untersucht. Gleiche Mengen an Kern- und Cytoplasma-Extrakten von proliferierenden, konfluenten und sich differenzierenden Zellen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunblot mit Antikörpern gegen Replikationsproteine untersucht ORC1, CDC6, MCM6 und Geminin konnten nach 132 h nicht mehr detektiert werden, während ORC2, ORC3, MCM3, CDT1 und CDC45 zwar noch vorhanden waren, jedoch in geringerer Menge als in proliferierenden Zellen. Weiterhin wurde die Menge an Replikationsproteinen in durch Serummangel transient aus dem Zellzyklus ausgetretenen G0-Phase-Zellen und Zellen, die durch Serum reaktiviert wurden, untersucht. Die Replikationsproteine waren in quieszenten C2C12- und 3T3-Zellen gleichermaßen wie in den terminal differenzierten Zellen in verringerter Menge vorhanden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Restimulierung von quieszenten, nicht aber terminal differenzierten Zellen, die erneute Expression von Replikationsproteinen zur Folge hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) mit proliferierenden und terminal differenzierten C2C12-Zellen durchgeführt. Eine preRC-Assemblierungsstelle befindet sich im OBR-Bereich der murinen rRNA-Gene von -2519 bis -2152 (Fragment B). In proliferierenden C2C12-Zellen konnte die Bindung von ORC1-5, CDC6, CDT1, MCM3, MCM6, CDC45 und HP1 an Fragment B nachgewiesen werden. Während der terminalen Differenzierung werden ORC1, CDC6, CDT1 und CDC45 von der preRC-Bindungsstelle entfernt, ORC2-5, MCM3, MCM6 und HP1 bleiben an Fragment B gebunden. Die Bindung von preRC-Proteinen an Fragment B sollte durch Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) in vitro detailliert untersucht werden. Dazu mussten zunächst preRC-Proteine nativ aus dem Kernextrakt proliferierender FM3A-Zellen durch Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie angereichert werden. Proteine in den Fraktionen B4 bis B12 bilden einen DNA-Protein-Komplex mit Fragment B. Die ATP-Abhängigkeit der Bildung des DNA-Protein-Komplexes wurde nachgewiesen. Die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes erfolgt sequenzspezifisch an Fragment B. Durch Zugabe spezifischer Antikörper gegen ORC3 und CDT1 zur Bindungsreaktion konnte die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung des DNA-Protein-Komplexes unabhängig von ATP-Hydrolyse erfolgt und dass Diadenosin-Tetraphosphat (Ap4A) die Bindung von preRC-Proteinen an die DNA nicht signifikant stimuliert. Zur Eingrenzung der preRC-Bindungsstelle wurden sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende partiell deletierte B-Fragmente eingesetzt. Mit den um 100 bp verkürzten Fragmenten kann der DNA-Protein-Komplex weiterhin gebildet werden. Deletionen von 200 bp entweder vom 5´- oder 3´-Ende verhindern hingegen die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes. Auf einem 119 bp langen Fragment (-2365 bis -2247), das zentral in Fragment B gelegen ist, kann sich der DNA-Protein-Komplex in einer ATP-stimulierten Weise wiederum ausbilden. Die Analyse dieses Bereiches zeigte, dass sich darin zwei auffällige 9 bp-Sequenzen (CTCGGGAGA) befinden, die im Abstand von 63 bp wiederholt werden (-2343 bis -2335; -2280 bis -2272) und die durch die 200 bp-Deletionen ganz oder teilweise eliminiert wurden. Durch ortsgerichtete Mutagenese mittels PCR wurden innerhalb dieser 9 bp-Wiederholungen die Basen C zu A, T zu G und umgekehrt ausgetauscht. In vier sukzessiven Klonierungen wurden je 4 bp ersetzt (S1 bis S4), wobei die erhaltenen Konstrukte als Ausgangs-DNA für die nachfolgende Klonierung dienten. Die Substitutionen S1, S2 und S3 beeinträchtigten die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes im Wesentlichen nicht. Wurden jedoch 8 bp in beiden 9 bp-Wiederholungen ersetzt (S4), war die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes nahezu vollständig inhibiert. S4 hat außerdem eine leichte reduzierte elektrophoretische Mobilität der proteinfreien DNA-Fragmente zur Folge. Vermutlich stellen die 9 bp-Sequenzen jedoch keine Konsensus-Sequenz für die Bindung der preRC-Proteine per se dar, sondern haben vielmehr Effekte auf die Ausbildung spezifischer Sekundär-Strukturen, die wiederum das Binden der preRC-Proteine an diese Region im OBR der murinen rRNA-Gene erlauben könnten.
N2  - One task of this work was to analyse the composition of preRCs in proliferating and terminally differentiated cells with the aim to monitor irreversible changes in the nature of preRCs upon transition from proliferation to differentiation. Murine C2C12 cells were used which can be triggered to become terminally differentiated myotubes by exposure to low mitogen medium. Differentiation was assessed by morphological examination. FACS analyses and BrdU incorporation showed the cessation of dna replication. Fluctuation of replication proteins during terminal differentiation was examined. Same amounts of nuclear and cytoplasmatic extracts, respectively, prepared from proliferating, confluent or differentiating C2C12 cells were resolved by SDS-PAGE. Immunoblot analyses were carried out using specific antibodies. After 132 h in DM ORC1, CDC6, MCM6 and geminin could not be detected in terminally differentiated myotubes at all, whereas ORC2, ORC3, MCM3, CDT1 and CDC45 were detectable, albeit at lower levels than in proliferating myoblasts. Levels of replication proteins in serum starved G0 phase cells and cells which were induced to reenter the cell cycle upon serum readdition, were investigated. Levels of replication proteins decreased in quiescent C2C12 and 3T3 cells, although different proteins were reduced to various extends. Reactivation of quiescent cells, but not terminally differentiated myotubes, resulted in reexpression of replication proteins. Chromatin immunoprecipitation analyses (ChIP) were performed comparing chromatin of proliferating cells to that of differentiated cells. A preRC binding site is localized within the OBR of the murine rRNA genes from position -2519 to -2152 (fragment B) upstream of the transcription start site. The in vivo binding of ORC1-5, CDC6, CDT1, MCM3, MCM6, CDC45 and HP1 to fragment B was observed in proliferating C2C12 cells. During terminal differentiation of C2C12 cells ORC1, CDC6, CDT1 and CDC45 are released. ORC2-5, MCM3, MCM6 and HP1, however, remain bound to fragment B. The removal of essential regulatory replication proteins like ORC1, CDC6, CDT1 and CDC45 from chromatin in terminally differentiated cells might contribute to the establishment and maintenance of an “out-of-cycle” state. One aim of the present work was to further characterize the binding of preRC proteins to fragment B in vitro by electrophoretic mobility shift assays (EMSAs). For that purpose, preRC proteins were enriched from nuclear extracts of proliferating FM3A cells by a combination of ion-exchange and gelfiltration chromatography. Purified proteins of fractions B4 to B12 caused a DNA/protein complex with fragment B. Purified preRC proteins bind exclusively to fragment B. When ORC3 and CDT1 antibodies were added to the DNA/protein binding reaction, formation of the DNA/protein complex was reduced, indicating that these proteins may play a role in formation of this DNA/protein complex. It was shown that this DNA/protein complex is formed independently of ATP hydrolysis and that diadenosine tetraphosphate (Ap4A) does not significantly stimulate binding of preRC proteins to DNA. In order to further narrow down the preRC binding site, EMSAs were performed using fragments shortened by 100 bp and 200 bp, respectively, at the 3´- or 5´-end. The DNA/protein complex is formed with both fragments truncated 100 bp at each end. However, if 200 bp are deleted, no shifts were observed, neither with fragment 5.200 nor with 3.200. On a central 119 bp fragment (-2365 to -2247) the DNA/protein complex is formed in an ATP-stimulated manner. Two conspicuous 9 bp sequence elements, CTCGGGAGA, were observed which are repeated at intervals of 63 bp (-2343 to -2335; -2280 to -2272). The sequence of these elements was altered by introducing C to A, T to G and vice versa substitutions. 4 successive substitutions of 4 bp each were constructed and the constructs were used as template DNA for subsequent mutageneses. Substitutions S1, S2 or S3 did not affect formation of the DNA/protein complex. If, however, 8 bp out of 9 bp in both sequence elements were substituted (S4), formation of the DNA/protein complex is abrogated. A naked S4 DNA fragment migrates distinctly slower than WT and S1-S3 suggesting that the secondary structure of the DNA is altered as a result of nucleotide substitutions. Probably, the 9 bp repeats do not constitute a consensus binding site per se, but rather have effects on formation of specific secondary DNA structures which in turn allow binding of preRC proteins to this region of murine rDNA.
KW  - Replikation
KW  - Proteine
KW  - Replikationsursprung
KW  - Proliferation
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - DNA-Replikation
KW  - Proliferation
KW  - terminale Differenzierung
KW  - präreplikativer Komplex
KW  - Origin
KW  - DNA replication
KW  - proliferation
KW  - terminal differentiation
KW  - prereplicative complex
KW  - origin
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15263
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brand, Normen
T1  - Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine
T1  - Localization, regulation and interactions of murine DNA replication proteins
N2  - Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert.
N2  - Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated.
KW  - Maus
KW  - Replikation
KW  - Proteine
KW  - Interaktion
KW  - Regulation
KW  - DNA-Replikation
KW  - Zellzyklus-Kontrolle
KW  - präreplikativer Komplex
KW  - Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer
KW  - DNA replication
KW  - cell cycle control
KW  - pre-replicative complex
KW  - bioluminescence resonance energy transfer
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057
ER  - 
TY  - THES
A1  - Höhn, Karsten P.
T1  - Funktionsanalyse des murinen Replikationsfaktors ORC2
T1  - FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE MURINE REPLICATIONFACTOR ORC2
N2  - Für Studien an murinen Initiationsfaktoren wurden in dieser Arbeit die Gene mcm2, orc3, cdc6, cdc7, dbf4 sowie das Gen ttf1 in ihrem chromosomalen Kontext mit Hilfe einer genomischen Bibliothek identifiziert und isoliert. Diese Gene sollen als Ausgang für Zielvektoren von transgenen Mäusen dienen oder für chromosomale Lokalisationsstudien verwendet werden. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein Zielvektor für eine orc2-„knock out“-Maus konstruiert. Für den „knock out“ wurde eine konditionale Strategie mit dem Cre/loxP-System gewählt, wobei Exon 2-5 von loxP-Stellen flankiert sein sollten. Als Ausgangsmaterial stand ein BAC-Vektor mit einem ca. 200 kb großen genomischen Insert, der das orc2-Gen enthält, zur Verfügung. Die erforderlichen Subklonierungen wurden durch die Größe des Inserts bzw. der daraus gewonnenen orc2-Subfragmente und durch die unbekannten Intronsequenzen negativ beeinträchtigt, da sich dadurch die Anzahl an verwendbaren Schnittstellen erheblich reduzierte. Nachdem es letztendlich nicht möglich war den vorletzten Schritt der Klonierung abzuschließen, wurde das Projekt aus Zeitgründen eingestellt. Ein weiterer Teil diese Arbeit beschäftigte sich mit der Lokalisation des murinen Orc2-Proteins am Centrosom. Bei Studien mit EGFP-gekoppelten murinen Replikationsproteinen zeigten Mcm4p-7p und Orc2p-5p eine Lokalisation am Centrosom. Für endogenes Orc2p sollte diese ebenfalls überprüft werden. Über Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen mit Antikörpern sowohl gegen Orc2p als auch gegen das centrosomale Protein γ-Tubulin konnte in NIH/3T3-Zellen eine centrosomale Orc2p-Lokalisation bestätigt werden. Diese trat sowohl in Interphase- als auch in Mitose-Zellen auf. Darüber hinaus wurde von anti-Orc2-Antikörpern in Telophase-Zellen eine punktförmige Struktur in der äquatorialen Ringfurche angefärbt. Diese Region entspricht vermutlich der des „midbodys“. Zusätzlich zu den Immunfluoreszenz-Analysen wurden Immunpräzipitationen durchgeführt. Durch diese konnte gezeigt werden, dass Orc2p durch γ-Tubulin präzipitierbar ist. Solch eine Lokalisation und Interaktion von Orc2p am Centrosom legt eine von der Replikation unabhängige Funktion nahe, wie sie bereits für andere Initiationsfaktoren beschrieben wurde. Um die Funktion von Orc2p genauer untersuchen zu können, wurden in einem weiteren Teil dieser Arbeit die Auswirkungen eines Orc2p-“knock downs“ auf NIH/3T3-Zellen untersucht. Das dabei verwendete RNAi-System basiert auf einem induzierbaren Expressionssystem, wobei die Orc2-siRNA aus der exprimierten „small hairpin RNA“ prozessiert wird. Um eine zeitliche Regulation zu ermöglichen, wurde das Tet-on-System verwendet. Auf Basis dieser beiden Systeme wurde eine stabile NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zelllinie hergestellt. Zur Vereinfachung zukünftiger Arbeiten mit regulierbaren Expressionssystemen, wurde parallel dazu eine NIH/3T3-Tet-on-Zelllinie, mit Neomycin als Selektionsmarker, hergestellt, in die nur noch der gewünschte shRNA-Expressionsvektor transfiziert werden muss. Durch Zugabe von Doxycyclin zum Nährmedium wird in den NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen die Expression der Orc2-shRNA induziert. Dies löst anschließend den RNAi-Mechanismus aus. Es konnte bei diesen Zellen unter Einfluss von Doxycyclin eine deutliche Abnahme der Orc2-Proteinmenge festgestellt werden. Eine Analyse der Proliferationsrate von Zellen unter Doxycyclin-Einfluss ergab schon nach zwei Tagen eine deutliche Verlangsamung der Wachstumsrate. In Dox-behandelten Zellen führte die Orc2-shRNA-Expression zu einer veränderten Verteilung der Zellen auf die Zellzyklus-Phasen. Es konnte nach sieben Tagen eine Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase, nach 14 Tagen aber in der G1-Phase gezeigt werden. Diese Auswirkungen des Orc2p“knock downs“ stehen im Einklang mit dessen Funktion als Initiationsprotein. Weiterhin konnten während der Doxycyclin-Behandlung von NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen auffällig viele multinukleäre Zellen, bzw. Zellen die über Zytoplasmabrücken verbunden waren, beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass bei Zellen mit einer reduzierten Orc2-Proteinmenge die Cytokinese beeinträchtigt ist. Des weiteren zeigten sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl von Kernen sowie Kerne verschiedener Größe. Eine Färbung dieser Zellen mit Propidiumiodid ergab, dass alle Tochterkerne Nukleinsäuren enthalten. Dies deutet darauf hin, dass nicht in allen Zellen die DNA in gleichen Teilen auf die Tochterkerne verteilt wird. Eine ungerade Anzahl an Kernen weist darauf hin, dass diese sich in unterschiedlichen Zellzyklus-Phasen befinden können. Da vielkernige Zellen auch bei Beeinträchtigung des Spindelfaserapparates auftreten können, wurden bei Doxycyclin-behandelten NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA-Zellen Immunfluoreszenzfärbungen mit anti-β-Tubulin-Antikörpern durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen, die Orc2-siRNA exprimieren, diffus verteilte, unregelmäßig organisierte Mikrotubuli aufweisen. Dies spricht dafür, dass Orc2p neben seiner Funktion als Replikationsprotein noch weitere Aufgaben in der Mitose bzw. Cytokinese besitzt.
N2  - To study the function of murine initiation factors of DNA replication one part of this work was dedicated to the identification and isolation of genes in their chromosomal context. A genomic mouse library was screened for the mcm2, orc3, cdc6, cdc7, dbf4 and ttf1 genes. Genes in their exon-intron structure can serve as an origin of targeting vectors for transgene mice or chromosomal localisation experiments, respectively. A further part of this work was the construction of a targeting vector for an orc2 knock out mouse. A conditional strategy based on the cre/loxP system was chosen for this purpose. In the targeting vector exons 2-5 of the orc2 gene should be flanked by loxP sites. The source for the orc2 gene was a BAC vector with an approximately 200 kb genomic insert. The size of this insert and the resulting orc2 fragments, respectively, limited considerably the number of useful restriction sites. As the steps of the cloning strategy were greatly time consuming and the penultimate step could not be finished, it was decided to discontinue this project. Furthermore, the function of Orc2p was examined via localisation analyses and knock down strategies. Studies with EGFP tagged components of the pre-replicative complex showed that Mcm4p-7p and Orc2p-5p were localised at the centrosome. Therefore, the centrosomal localisation of the endogenous murine Orc2 protein was examined. By immunofluorescence staining of NIH/3T3 cells against Orc2p and the well known centrosomal protein γ-tubulin, respectively, a co-localisation at the centrosome of both proteins was shown. This co-localisation could be shown in interphase as well as mitotic cells. Additionally, between separating cells a dot-shaped struc-ture was also stained by Orc2p antibodies, which likely represents the midbody region. Furthermore, the association of Orc2p with γ-tubulin was demonstrated by immunoprecipitation. The localisation at the centrosome and the interaction with γ-tubulin suggests that Orc2p is involved in functions beyound the initiation of DNA replication. A further aspect of this work was an approach to knock down Orc2p in NIH/3T3 cells. The knock down was induced by the expression of small hairpin RNA directed against Orc2. A temporal regulation of the shRNA expression was achieved by the use of the Tet-on system. Both systems were combined in a stable NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA cell line. To facilitate further work with Tet-on regulated expression systems, a stable NIH/3T3 cell line with a Tet-on system was created. This cell line only has to be transfected with the desired shRNA expression vector. In NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA cells the Orc2 shRNA expression was induced by application doxycycline to the media. This resulted in a down regulation of Orc2 protein via a RNAi mechanism. Also the proliferation rate of NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA cells decreased upon doxycycline treatment. Analysis of the cell cycle distribution of Orc2 shRNA-expressing cells by FACS analysis showed an accumulation in G2/M after seven days but in G1 after 14 days. These effects of the Orc2p knock down correspond with its function in the initiation process. Interestingly, the doxycycline treatment also resulted in cells with more than one nuclus as well as cells connected by cytoplasma bridges. This suggests that a reduced Orc2p level can lead to an impaired cytokinesis. Furthermore, several cells showed an odd number of nuclei and nuclei of different sizes, all containing DNA, which was sown by propidium iodide staining. This indicates that in cells with a reduced Orc2p level the distribution of the chromosomes is impaired. An odd number of nuclei suggests that not all nuclei are in the same cell cycle phase. Multinucleated cells also arise from defects in the spindle apparatus. Thus, microtubuli of doxycycline treated NIH/3T3-TetOn-Orc2siRNA cells were analysed. Immunofluorescence staining against β-tubulin showed insufficiently organized microtubuli which are deficiently bound to the cell periphery. These results indicate the possibility that Orc2p is also involved in functions in mitosis and cytokinesis, respectively.
KW  - DNA-Replikation
KW  - Initiation
KW  - ORC
KW  - Orc2
KW  - DNA-Replication
KW  - Initiation
KW  - ORC
KW  - Orc2
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23488
ER  -