TY - CHAP A1 - Altschmied, Joachim A1 - Schartl, Manfred T1 - Genetics and molecular biology of tumour formation in Xiphophorus N2 - No abstract available. KW - Schwertkärpfling KW - Tumor KW - Entstehung KW - Molekularbiologie KW - Genetik Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69752 ER - TY - JOUR T1 - Blick - das Magazin der Julius-Maximilians-Universität Würzburg. Ausgabe 2/1994. Schwerpunktthema: Genexpression in Vertebraten-Zellen N2 - Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Genexpression in Vertebraten-Zellen - Funktionsanalyse von Genen mittels gezielter Keimbahn-Mutagenese in Mäusen - Zellkooperation bei der Immunreaktion - Die transkriptionelle Kontrolle von Lymphokin-Genen - Selenocystein-tRNA und die Funktion von Selen in menschlichen Zellen - Start und Stopp der DNA-Replikation: Wie Gene kontrolliert verdoppelt werden - Antigenerkennung durch T-Lymphozyten - Genexpression und Tumorentstehung: Zuviel des Guten? - Molekularbiologie humaner Coronaviren - Molekulare Mechanismen persistierender Masernvirusinfektionen - Polyomavirus-Infektionen im zentralen Nervensystem - Molekulare Mechanismen von intrazellulären Bakterien - Über "simple" und "komplexe" Retroviren - Hilfe für die Zelle im Kampf mit dem AIDS-Virus u.a. KW - Würzburg KW - Universität KW - Zeitschrift KW - Genetik KW - Zelle KW - Melanom KW - Molekularbiologie Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44902 VL - 2/1994 ER - TY - JOUR T1 - Blick - das Magazin der Julius-Maximilians-Universität Würzburg. Ausgabe 1/1995. Schwerpunktthema: Molekulare Mechanismen der Krebsentstehung N2 - Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Molekulare Mechanismen der Krebsentstehung - Reaktiver Sauerstoff in der Krebsentstehung und Krebstherapie - Krebsentstehung durch Stoffwechselprodukte - Von der Krebsauslösung zum Krebswachstum - Zytogenetische Veränderungen bei malignen Lymphomen - Krebs, ein Problem der Deregulierung der Zellteilungskontrolle - Krebstherapie mit Topoisomerase-Inhibitoren u.a. KW - Würzburg KW - Universität KW - Zeitschrift KW - Krebsentstehung KW - Krebstherapie KW - Molekularbiologie Y1 - 1995 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44910 VL - 1/1995 ER - TY - JOUR T1 - Blick - das Magazin der Julius-Maximilians-Universität Würzburg. Ausgabe 2/1999. Schwerpunktthema: "Molekulare Mechanismen kanzerogener Primärveränderungen N2 - Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Krebsentstehung auf der Ebene der Moleküle - Veränderungen am Erbgut ohne direkte DNA-Schädigung - Magenlymphom: von der Infektion zum Tumor - Chaos in der Erbsubstanz - Hautkrebs bei Fischen: ein Tumorgen und die Folgen - Ewiges Leben - ein Albtraum? - Wilms-Tumoren - komplexer als vermutet u.a. KW - Würzburg KW - Universität KW - Zeitschrift KW - Krebs KW - Bakterien KW - Molekularbiologie Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45008 VL - 2/1999 ER - TY - THES A1 - Flügel, Manfred T1 - Molekularbiologische Studien zur Pathogenität und Ökologie von Legionella pneumophila T1 - Molecularbiological studies on the pathogenicity and ecology of Legionella pneumophila N2 - Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein Umweltkeim mit Verbreitung in aquatischen Habitaten. Die Keime sind in der Lage, sich intrazellulär in eukaryontischen Zellen, wie Makrophagen, Monozyten und Protozoen zu vermehren. Die erfolgreiche Besiedlung ökologischer Nischen, aber auch das Virulenzpotential des Keimes können dabei von Umweltfaktoren abhängen. Die Erforschung ökologischer Zusammenhänge kann daher für das Verständnis der bakteriellen Virulenz von großer Bedeutung sein. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die in der späten stationären Phase des Bakterienwachstums von L. pneumophila zu beobachtende intensive Pigmentierung des Kulturmediums. Für diesen Phänotyp ist das Legiolysin (Lly) verantwortlich. Es ist eines der wenigen bekannten Genprodukte von L. pneumophila, die einen Einfluß auf das Überleben des Keimes in der Umwelt haben. Legiolysin kann daher als Fitnessfaktor bezeichnet werden. Um die ökologischen Zusammenhänge der Pigmentgenerierung näher zu untersuchen, wurde das lly-positive Plasmid pEWL 1 subkloniert und sequenziert. Neben lly konnten in diesem Genabschnitt durch Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen sechs weitere Leseraster detektiert werden. Die drei unmittelbar benachbarten Gene von lly kodieren dabei für Proteine mit Funktionalität in Bezug zur lly-Determinante, während die drei upstream von lly liegenden Leseraster Homologien zu Proteinen aufweisen, die an Transportprozessen beteiligt sind. Die Länge des RNA-Transkripts von lly konnte im Northern-Blot mit ungefähr 1,8 kb bestimmt werden und läßt damit auf die gemeinsame Transkription des lly-Gens mit dem unmittelbar upstream liegenden Leseraster schließen. Durch Sequenzanalysen konnte aufgezeigt werden, daß das für diesen Phänotyp verantwortliche Legiolysin-Gen für eine p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) kodiert. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von p-Hydroxyphenylpyruvat zu Homogentisat (HGA). In Zusammenarbeit mit Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) konnte im Vergleich zu lly-negativen L. pneumophila- und rekombinanten E. coli-Stämmen in den Kulturüberständen von lly-positiven Stämmen auf Basis einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) HGA nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, daß das Legiolysin-Gen für ein Protein mit HPPD- Aktivität kodiert, und in die Degradation der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin involviert ist. Des weiteren wurden chromosomale Integrationsmutationen der aus L. pneumophila stammenden Gene lly und mip ("macrophage infectivity potentiator") in E. coli K-12 Stämmen erstellt. Diese wurden nachfolgend in ökologisch ausgerichteten Langzeitstudien eingesetzt. Die chromosomale Integration von lly erfolgte als ortsspezifische Rekombination in die l att - site von E. coli WM 2269. Die Integration von mip erfolgte in die fim-Region des E. coli K-12-Stammes AAEC 160. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befaßt sich mit ökologischen Studien zur Persistenz von L. pneumophila in der Umwelt. Durch die Bestrahlung mit Licht über einen Verlauf von sieben Tagen konnte gezeigt werden, daß die Exprimierung von lly zu einer Persistenz unter Lichtstreß führt. Dieser Lichtschutz könnte in der Umwelt, aber auch bei der Sanierung von Wasserleitungssystemen mittels UV-Licht Relevanz aufweisen. Die Assoziation von L. pneumophila JR32 und JR32-1 (lly-negativ) mit dem Cyanobakterium Fischerella wurde in Mikrokosmen über einen Verlauf von sieben Tagen beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, daß Legionella in Assoziation mit Fischerella bzw. in dessen Überstand zu persistieren vermag, während dies den Bakterien in frischem Fischerella-Medium nicht möglich war. Wie die Coinkubation der Fischerellen mit L. pneumophila JR32-1 zeigte, spielt die Expression von lly dabei keine Rolle. Ein Wachstum der Bakterienkulturen konnte weder im Fischerella-Überstand, noch in Fischerella-Medium beobachtet werden. Durch Rasterelektronenmikroskopie konnte der adhäsive Charakter der Assoziation von L. pneumophila zu Fischerella dokumentiert werden. Durch Persistenzstudien von L. pneumophila und E. coli in Boden wurde die Überlebensfähigkeit der Mikroorganismen in suboptimaler Umgebung getestet. Für Legionella ist eine rapide Abnahme der Zellzahl schon nach kurzer Zeit zu detektieren. Nach sechs Tagen konnten keine Zellen mehr kultiviert werden. Die Defizienz der Pathogenitäts- und Umweltfaktoren Mip, Fla (Flagellin) und Lly hatte dabei keinen Einfluß auf die Persistenz der Bakterien im Boden. Zudem sind die zuvor generierten rekombinanten E. coli-Klone AAEC 160-1 und WM 2269-1 mit genomischer mip- bzw. lly-Integration eingesetzt worden. Innerhalb von vier Wochen konnte für diese Stämme eine kontinuierliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet werden. Somit erwies sich keiner der Organismen als erfolgreicher Besiedler der Bodenprobe. Die Studien zum Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila und E. coli erfolgten in autoklaviertem Leitungswasser bzw. PBS und zwei unterschiedlich behandelten Varianten von Mainwasser. Neben sterilfiltriertem Mainwasser fand die Inokulierung der Organismen auch in einem Ansatz mit autoklaviertem Mainwasser statt. Es konnte gezeigt werden, daß L. pneumophila in Leitungswasser und Mainwasser außerordentlich gut zu persistieren vermochte. Zudem konnte dokumentiert werden, daß auch E. coli DH5a in ein lebensfähiges, aber nicht mehr kultivierbares Ruhestadium (viable but nonculturable, VBNC) eintreten kann. Parallel zur Ermittlung der CFU-Werte wurden während des Verlaufs der Experimente die Lebendzellzahlen durch Fluoreszenzfärbungen bestimmt. Der Übergang von L. pneumophila in das VBNC-Ruhestadium wurde zudem durch in situ - Hybridisierungen mit fluoreszenzmarkierten 16 S rRNA-Oligonukleotidsonden dokumentiert. Im Naturhaushalt spielt dieser Übergang zu VBNC-Stadien bei Umweltbakterien zur Überwindung ungünstiger Phasen eine große Rolle. Schließlich erfolgten Experimente zur Reaktivierung der VBNC-Ruhestadien. Diese Reaktivierung ist abhängig von speziesspezifischen Triggern und kann bei L. pneumophila durch Coinkubation mit Acanthamoeba castellanii erfolgen. N2 - Legionella pneumophila, the causative agent of the Legionnaires' disease, is an environmental strain with a widespread distribution in aquatic habitats. Legionella are able to replicate intracellularly in eucaryotic cells, such as macrophages, monocytes and protozoa. The sucsessful colonization of ecological niches, but also the virulence potential of Legionella depends on environmental factors. Therefore the investigation of ecological context is expected to provide an understanding of bacterial virulence. The starting-point of this dissertation is the intensive pigmentation of the culture medium of L. pneumophila, witch could be observed in the late stationary phase of bacterial growth. The Legiolysin proteine (Lly) is responsible for this phenotype. This gene product of L. pneumophila is known to show an influence on the survival in the environment, which is why Legiolysin has been termed a fitness factor. In order to investigate the ecological connections of the pigmentation, the lly-positive plasmid pEWL 1 was subcloned and sequenced. In this genetic section six further open reading frames (ORF) could be detected besides lly by sequence comparison of the derived amino acid sequences. The three directly neighbouring genes of lly code for proteins which have functionality with regard to the lly-determinant. The three reading frames upstream of lly show homologies to proteins, which are involved in transport processes. The RNA transcript of lly could be determined by Northern blot with a lenght of about 1,8 kb. Therefore transcription of the lly gene together with the upstream ORF is suggested. It could be shown by sequence analysis, that the Legiolysine gene responsible for this phenotype, is coding for a p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD). This enzyme catalyzes the reaction of p-hydroxyphenylpyruvate to homogentisate (HGA). In collaboration with Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) the existence of HGA was demonstrated in culture supernatants of lly-positive strains on the basis of high performance liquid chromatography (HPLC). It could be shown, that the legiolysin gene is coding for a protein with a HPPD activity, and, therefore, is involved in the degradation of the aromatic amino acids Phenylalanine and Tyrosine. Additionally chromosomal integration mutants of the L. pneumophila genes lly and mip ("macrophage infectivity potentiator") were created in E. coli K-12 strains. These mutants were subsequently used in ecological long-time studies. The chromosomal integration of lly took place as a locus-specific recombination in the l att - site of E. coli WM 2269. The integration of mip happened in the fim-region of the E. coli strain AAEC 160. The second part of the present dissertation is concerned with ecological studies to the persistence of L. pneumophila in the environment. Accordingly, it could be shown, that the expression of lly leds to persistence to light-stress. This light protection could be relevant in the environment, but also during the sanitation of water pipes by UV-light. The association of L. pneumophila JR32 and JR32-1 (lly-negative) with the cyanobacterium Fischerella was observed in microcosms during a course of seven days. Legionella are able to persist in association with Fischerella, and in the Fischerella culture supernatant, respectively. Survival of the bacteria was not possible in fresh Fischerella medium. However, the expression of lly shows no difference, as could be shown by the coincubation of L. pneumophila with Fischerella. The growth of bacterial cultures cold neither be detected in supernatants of Fischerella, nor in fresh Fischerella medium. The adhesive character of the association of L. pneumophila with Fischerella could be documented by SEM (scanning electron microscopy). The survival of Legionella in suboptimal environment was tested by studying the persistence of L. pneumophila and E. coli in soil. A rapid decline of CFU (colony forming unit) for Legionella could be detected within a short time, as cells could not be cultivated any more after six days. The deficiency of the pathogenetic and enviromental factors Mip, Fla (Flagellin) and Lly had no influence on the persistence of the bacteria in the soil. Additionally the recombinant E. coli clones AAEC 160-1 and WM 2269-1 with the genomic mip and lly integrations, were used in this exreriments. During a course of four weeks, a continuous reduction of CFU could be observed for these strains. Therefore none of these organisms proved successful in colonization of soil samples. The studies regarding the loss of culturability of L. pneumophila and E. coli were made in autoclaved potable water and PBS (phosphate buffered saline), respectively, and in two variants of Main river water, one of which was autoclavedwhile the other one was sterilized by filtration. It could be shown, that L. pneumophila are able to persist well in potable water and in the river water. Additionally, not only L. pneumophila, but also E. coli DH5a entered a viable but nonculturable state (VBNC). During the course of these experiments, the numbers of live cells were determined by fluorescence dyes Moreover, the transition of L. pneumophila into the VBNC state was documented by in situ hybridization technique with fluorescence marked 16 S rRNA oligonucleotide probes (FISH). This transition into the VBNC state plays an important role to overcome unfavourable phases in natural environments. Finally experiments were made to reactivate the VBNC states. This resuscitation is dependent on species specific triggers and could be achieved by coincubation of L. pneumophila with the amoeba Acanthamoeba castellanii. KW - Legionella pneumophila KW - Pathogenität KW - Ökologie KW - Molekularbiologie KW - Legionella pneumophila KW - Legiolysin KW - p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase KW - Pigmentierung KW - Lichtschutz KW - Fischerella sp. KW - Legionella pneumophila KW - Legiolysin KW - p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase KW - pigmentation KW - light protection KW - Fischerella sp. Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1178 ER - TY - THES A1 - Seeberger, Harald Bruno Gustav T1 - Frühe Entwicklungsschritte in der Pathogenese der B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ T1 - Early steps in the pathogenesis of B cell lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT)-type N2 - B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben. N2 - The largest group of extranodal lymphomas are B cell lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT)-type. They arise on the background of chronic inflammation, e.g. the Helicobacter pylori-associated gastritis in the stomach. The mechanism of MALT-type lymphomagenesis is still enigmatic. The finding of autoreactive malignant B cells which proliferate in response to antigen and T cell-mediated signals may suggest a failure of T cell control. For testing this hypothesis we examined both tumor-infiltrating T cells and malignant B cells of various MALT-type lymphomas. By expression analysis of the T cell receptor (TCR) Vb chain we showed clonal expansions of T cells due to antigenic stimulation. Furthermore we found similar antigen-binding regions (CDR3) in the TCR of tumor-infiltrating T cells in two different MALT-type lymphomas, that indicate potential antitumor-reactivity of the tumor-infiltrating T cells. Furthermore we established an in vitro T/B cell coculture assay for investigating the B cells and focused on the interaction of the pro-apoptotic molecule FasL on activated T cells with its corresponding death receptor Fas on malignant B cells. The malignant B cells from three out of seven MALT-type lymphomas and four out of five DLBL were resistant to FasL/Fas-mediated apoptosis. My results indicate that this is probably due to mutational inactivation of the Fas receptor. In Fas transcripts of malignant B cells from all cases investigated, 14 different point mutations leading to amino acid changes were found. Ten of these mutations were associated with resistance to apoptosis of malignant B cells. Additional investigations showed, that alternative mechanisms of resistance to apoptosis such as decreased expression of Fas, production of soluble Fas (sFas) or an impaired signalling cascade downstream of Fas were not operative. From the results we conclude the following: Resistance to FasL/Fas-mediated apoptosis is a mechanism of early MALT-type lymphomagenesis that could be due to certain Fas mutations. By this mechanism the B cells are able to escape T cell control while still receiving T cell help until they reach autonomous growth. The prolonged survival of the B cells might increase the risk of acquiring additional aberrations, such as the chromosomal translocation t(11;18)(q21;21) which is found in 50 per cent of all MALT-type lymphomas. KW - MALT KW - B-Zell-Lymphom KW - Carcinogenese KW - Molekularbiologie KW - B-Zell-Lymphom KW - MALT KW - Apoptose KW - Apoptose-Resistenz KW - Fas KW - sFas KW - Mutation KW - B cell lymphoma KW - MALT KW - apoptosis KW - resistance to apoptosis KW - Fas KW - Fas KW - mutation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2286 ER - TY - THES A1 - Souto-Carneiro, Maria Margarida T1 - Molecular and functional analyses of human synovial B-lymphocytes in rheumatoid arthritis T1 - Molekularen und funktionellen Analysen humanen synovialen B-Lymphozyten in rheumatoiden Arthritis N2 - B-cells of the rheumatoid synovial tissue are a constant part of and, in some histopathological subtypes, the dominant population of the inflammatory infiltrate, located in the region of tissue destruction. The pattern of B-cell distribution and the relationship to the corresponding antigen-presenting cells (follicular dendritic reticulum cells: FDCs) show a great variety. B-cells may exhibit (i) a follicular organization forming secondary follicles; (ii) follicle-like patterns with irregularly formed FDC networks, and (iii) a diffuse pattern of isolated FDCs. Molecular analysis of immunoglobulin VH and VL genes from human synovial B-cell hybridomas and synovial tissue demonstrates somatic mutations due to antigen activation. The FDC formations in the synovial tissue may therefore serve as an environment for B-cell maturation, which is involved in the generation of autoantibodies. An autoantibody is defined as "pathogenic" if it fulfills the Witebsky-Rose-Koch criteria for classical autoimmune diseases: definition of the autoantibody; induction of the disease by transfer of the autoantibody; and isolation of the autoantibody from the disease-specific lesion. B-cells from rheumatoid synovial tissue show specificity for FcIgG, type II collagen, COMP, sDNA, tetanus toxoid, mitochondrial antigens (M2), filaggrin and bacterial HSPs. The contributions of these antigens to the pathogenesis of RA are still hypothetical. A possible contribution could derive from crossreactivity and epitope mimicry: due to crossreaction, an antibody directed originally against a foreign infectious agent could react with epitopes from articular tissues, perpetuating the local inflammatory process. The characteristic distribution pattern, the localisation within the area of tissue destruction, the hypermutated IgVH and IgVL genes, and their exclusive function to recognize conformation-dependent antigens suggest a central role for B-cells in the inflammatory process of rheumatoid arthritis. Therefore, the analysis of synovial B-cell hybridomas and experimental expression of synovial IgVH and IgVL genes will help to characterise the antigens responsible for the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In the present study 55 IgVH genes amplified from 3 different anatomical regions of a RA patient were analysed adding further information on synovial B-cell maturation and recirculation in RA. This analysis demonstrated somatically mutated IgVh genes in all different regions with amino acid deletions and mixed IgVh molecules, suggesting the existence of a novel pathway to generate (auto)antibody specificities. The comparison of amino acid sequences of amplified genes belonging to the VH1 family (with predominantly the same germline counterpart) exhibited a strong homology, indicating an apparently conserved mutational pattern. This suggests that the number of antigens activating B-cells in the different locations is restricted. The most striking result was the finding of clonally related sequences in different anatomical regions indicating a recirculation of activated B-cells between the different affected joints. Also in the present study a synovial B-cell hybridoma was analyzed for its specific recognition of cartilage antigens. A heptameric peptide of cartilage oligomeric protein (COMP) could be defined as the target structure. The IgVH-gene (IgHV4-59*01) of the IgG2l hybridoma has somatically mutated genes with high R/S values in the CDR regions (9:2). Thus, indicating that this hybridoma originates from a synovial B-cell which has been antigen activated/selected for its affinity. To analyse the presence of the clonotypic IgHV4-59*01 sequences in other cases of RA and osteoarthritis (OA) synovitis, primers specific for the CDR3 rearrangement of this hybridoma were used. The clonotypic and clone related sequences (98 per cent ± 1 per cent homology) could only be detected in synovitis of RA cases but not in OA cases indicating that this B-cell is specific to RA synovitis. The identified heptameric peptide of COMP was used in a peptide ELISA to analyse whether there is a specific binding in RA serum samples. Serum samples (IgG) from RA patients (n=22) showed a significant higher efficiency to the COMP heptamer than the OA sera (n=24) and the age matched healthy controls (n=20) (for both p<1x10-4, Students t-test). The specificity of this B-cell hybridoma may therefore be defined as RA specific. Since COMP is restricted to cartilage and tendons which are organs specifically affected in RA this COMP specific autoantibody represents the first organ specific autoantibody in RA. The IgG2 COMP specific autoantibody with somatically mutated IgVH genes is different from germline encoded, antigen clearing IgM autoantibodies and may therefore be directly involved as an "arthritogenic autoantibody" in cartilage and tendons destruction by complement activation. N2 - B-Zellen des rheumatoiden Synovialgewebes sind einerseits ein konstanter Bestandteil und andererseits in einigen histopathologischen Subtypen sogar die dominante Bevölkerung des entzündlichen Infiltrates, welches sich in direkter Nähe des zerstörten Gewebes befindet. Das Strickmuster der B-Zellen-Verbreitung und die Verbindung zu den korrespondierenden antigenerzeugenden Zellen (follikuläre dendritische Zellen, sprich: FDC) zeigen eine große Vielfalt. B-Zellen können a) in der Form eines follikulären Verbandes sich bildender Sekundärfollikel; b) als follikelähnliche Muster mit unregelmäßig geformten FDC-Netzwerken und c) als ein diffuses Muster isolierter FDCs auftreten. Molekularanalysen der immunglobulinen VH- und VL-Gene von menschlichen synovialen B-Zell-Hybridomen und Synovialgewebe zeigen somatische Mutationen aufgrund von Antigenaktivierung auf. Die FDC-Schichten im Synovialgewebe dürften daher als ein Nährboden für B-Zell-Reifung dienen, welche wiederum in den Prozeß der Autoantikörperbildung eingreift. Ein Autoantikörper wird als "pathogenisch" bezeichnet, wenn er das Witebsky-Rose-Koch-Kriterium für klassische Autoimmunkrankheiten erfüllt: Bildung des Autoantikörpers; Einleitung der Krankheit durch Übertragung des Autoantikörpers und Isolation des Autoantikörpers vom krankheitsspezifischen Entzündungskomplex. B-Zellen aus rheumatoidem Synovialgewebe zeigen Spezifität für die Fc-Region von lgG; Typ II Kollagen; COMP; sDNA; Tetanustoxin; mitochondrische Antigene (M2); Fillaggrin und bakterielle HSPs. Der Beitrag dieser Antigene zur Pathogenese in der RA ist weiterhin hypothetisch. Ein möglicher Beitrag könnte aus der Kreuzreaktion und Epitopähnlichkeit aufgrund dieser Kreuzreaktion herrühren. Ein Antikörper, der ursprünglich gegen einen fremden Infektionsherd gerichtet war, könnte mit Epitopen aus Gelenkgewebe reagieren und somit den lokalen Entzündungsprozeß aufrechterhalten. Das charakteristische Verteilungsmuster, die Lokalisierung inmitten des zerstörten Gewebes, die hypermutierten IgVH- und IgVL-Gene und ihre ausschließliche Funktion, strukturabhängige Antigene zu erkennen, läßt auf eine zentrale Bedeutung der B-Zellen im Bezug auf den Entzündungsverlauf in der rheumatoiden Arthritis schließen. Deswegen wird die Analyse synovialer B-Zellen-Hybridome und die experimentelle Erkundung synovialer IgVH- und IgVL-Gene eine große Hilfe zur Charakterisierung der Antigene sein, welche verantwortlich für die Pathogenese in der RA sind. In dieser Studie wurden 55 IgVH-Gene analysiert, die von 3 verschiedenen anatomischen Regionen eines RA-Patienten amplifiziert wurden, wodurch man zusätzliche Informationen über synoviale B-Zellen-Reifung und -Rezirkulation in der RA erhielt. Diese Analyse zeigte somatisch mutierte IgVH-Gene in allen verschiedenen Regionen auf, mit Aminosäuredeletionen und gemischten IgVH-Molekülen, die Grund zur Annahme geben, daß eine neue Möglichkeit existiert, (Auto-) Antikörperspezifizierungen zu generieren. Der Vergleich von Aminosäuresequenzen amplifizierter Gene, die zur VH1-Familie gehören (mit überwiegend denselben Keimbahngenen) zeigten eine starke Homologie auf und wiesen auf ein scheinbar erhaltenes Mutationsmuster hin. Dieses läßt annehmen, daß die Anzahl der Antigene begrenzt ist, die B-Zellen in den verschiedenen Regionen aktivieren. Das markanteste Ergebnis war das Auffinden klonal verwandter Sequenzen in verschiedenen anatomischen Regionen, die darauf hinweisen, daß aktivierte B-Zellen zwischen den verschiedenen befallenen Gelenken rezirkulieren. Desweiteren wurde in dieser Studie ein synoviales B-Zellen-Hybridom analysiert bezüglich seiner spezifischen Erkennung von Knorpelantigenen. Ein heptameres Peptid des COMP könnte als eine mögliche Zielstruktur definiert werden. Die IgVH-Gene (IgHV4-59*01) des IgG2?-Hybridomes besitzt somatisch mutierte Gene mit hohen R/S-Werten in den CDR-Regionen (9.2). Somit weist dies darauf hin, daß dieses Hybridom aus einer synovialen B-Zelle stammt, welche aufgrund ihrer Affinität antigen-aktiviert wurde. Um das Vorkommen der klonotypischen IgHV4-59*01-Sequenzen in anderen Fällen der RA und Osteoarthritis (OA)-Synovitis zu analysieren, wurden Primer benutzt, die spezifisch für die CDR3 dieses Hybridomes sind. Die klonotypischen und klonal verwandten Sequenzen (98 Prozent ± 1 Prozent Homologie) konnte nur in Fällen der RA-Synovitis erkannt werden, jedoch nicht bei OA-Fällen, was darauf hinweist, daß diese B-Zelle spezifisch für die RA-Synovitis ist. Das identifizierte heptamere COMP-Peptid wurde in einer Peptid-ELISA verwendet, um festzustellen, ob es eine spezifische Bindung in RA-Seren gibt. Seren (IgG) von RA-Patienten (n=22) zeigten eine bedeutend höhere Wirksamkeit des COMP-Heptamers an als in OA-Seren (n=24) und den altersabhängigen gesunden Kontrollen (n=20); (für beide p<1x10-4; Students t-Test). Die Spezifizierung dieses B-Zellen-Hybridomes könnte daher als RA-spezifisch angesehen werden. Da COMP sich auf Knorpel und Sehnen beschränkt - welches hauptsächlich in der RA betroffene Organe sind - repräsentiert dieser COMP-spezifische Autoantikörper den ersten organspezifischen Autoantikörper in der RA. Der IgG2-COMP-spezifische Autoantikörper mit somatisch mutierten IgVH-Genen unterscheidet sich von dem der antigenvernichtenden IgM Autoantikörper und könnte daher direkt in die Knorpel- und Sehnenzerstörung durch Komplementaktivierung miteinbezogen sein, als ein "arthritogener Autoantikörper". KW - Rheumatoide Arthritis KW - B-Lymphozyt KW - Synovialmembran KW - Molekularbiologie KW - rheumatoiden Arthritis KW - B-Lymphozyten KW - Autoantikörper KW - Antigen KW - Cartilage Oligomeric Matrix Protein KW - rheumatoid arthritis KW - B-lymphocytes KW - autoantibody KW - antigen KW - cartilage oligomeric matrix protein Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2308 ER - TY - THES A1 - Werner, Monika T1 - Molekulare Charakterisierung der Reaktion von Lycopersicon esculentum auf den phanerogamen Parasiten Cuscuta reflexa T1 - Molecular characerisation of the tomato reaction against the phanerogamic parasite Cuscuta reflexa N2 - In der inkompatiblen Interaktion von Lycopersicon esculentum und Cuscuta reflexa wird die Ausbildung von Haustorien, spezieller Organe, die der Nahrungsaufnahme durch den Parasiten dienen,bereits in einem sehr frühen Stadium der Infektion gehemmt. Um einen Einblick in die Regulationsmechanismen der Tomatenreaktion zu gewinnen, wurde eine Subtraktive Hybridisierung durchgeführt und es konnten 20 Gene identifiziert werden, deren Transkripte nach Cuscuta-Befall im Wirtsgewebe akkumulieren. Entsprechend ihrer möglichen Proteinfunktion lassen sich die mRNAs verschiedenen Bereichen der Tomatenreaktion im Infektionsprozess zuordnen: (a) Abwehr-assoziierte Proteine, (b) Signaltransduktionsassoziierte Proteine, (c) Zellstreckungsassoziierte Proteine und (d) Proteine mit bislang vollständig unbekannter Funktion. Einige der identifizierten mRNAs wurden durch Northern Analysen näher charakterisiert. Da eine der mRNAs eine mögliche Xyloglucanendotransglycosylase (XET) kodiert, wurde die XET-Aktivität im Tomatengewebe nach Infektion bestimmt. Außerdem wurde der Einfluß des Phytohormons Auxin auf die Akkumulation der Xyloglucanendotransglycosylase LeEXT1 sowie des Aquaporins LeAqp2 untersucht. Trotz auxinregulierter Transkription nach Cuscuta-Befall zeigte die auxininsensitive Tomatenmutante diageotropica im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Kompatibilität. N2 - The resistant host tomato prevents the development of haustoria, specialised parasitic organs for the uptake of water and assimilates, at early stages of infection with the phanerogamic parasite Cuscuta reflexa. In order to elucidate molecular mechanisms involved in tomato response to the attack by Cuscuta reflexa a suppressive subtractive hybridisation technique was used thereby identifying genes expressed following parasitic attachment. The twenty cDNA clones obtained represent mRNAs which possibly encode proteins of several functions during the infection process: (a) defence-related proteins, (b) proteins involved in signal transduction, (c) cell expansion-associated proteins, and (d) proteins with so far unknown function. Of these clones initially identified to have elevated transcript levels within 12 hours after onset of infection, several were further characterised by Northern analysis. One of the genes identified encode a putative xyloglucan endotransglycosylase (XET). The XET activity in tomato tissue was estimated following parasitic onset. After auxin treatment, both the xyloglucan endotransglycosylase LeEXT1 and the aquaporin LeAqp2 mRNA showed elevated transcript levels in cortical cells of tomato stems suggesting a potential in auxin-mediated cell expansion which occurred after parasitic attack. Analysis of the auxin insensitive tomato mutant diageotropica indicated no changes in the degree of compatibility in comparison to the wildtyp. KW - Tomate KW - Cuscuta reflexa KW - Wirt KW - Parasit KW - Genexpression KW - Indonylessigsäure <3-> KW - Molekularbiologie KW - Inkompatible Parasit-Wirt-Interaktion KW - Lycopersicon esculentum KW - Cuscuta reflexa KW - Subtraktive Hybridisierung KW - Auxin KW - Incompatible parasite-host interaction KW - Lycopersicon esculentum KW - Cuscuta reflexa KW - Subtractive hybridisation KW - auxin Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2462 ER - TY - THES A1 - Stolzenberger, Sascha T1 - Spezifische Hemmung der allergieassoziierten Interleukin-4 Signaltransduktion N2 - Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn. N2 - Interleukin-4 (IL-4) is the major factor in the development of allergic diseases like hay fever or asthma. The most important cytoplasmic event following stimulation with IL-4 is the activation of the transcription factor Stat6 (signal transducer and activator of transcription 6). Stat6 binds via a single SH2 domain first to tyrosine-phosphorylated motifs in the IL-4Ra-chain, and then to another Stat6 molecule, which results in the formation of active dimers. Since Stat6 is exclusively used by the IL-4 receptor, it is a promising approach to specifically disrupt IL-4 signal- transduction by inhibiting Stat6 activation. A vector system was established for the delivery of hydrophilic agents into living cells. To this purpose, a 16 amino acid membrane-permeable peptide derived from the Drosophila transcription factor Antennapedia was used. The Antennapedia peptide has been shown to internalize into living cell in a receptor- and energy-independent manner. In this thesis it is shown that a peptide derived from the Stat6-binding region of IL-4Ra (Stat6BP) is an effective inhibitor when it is delivered into cells by coupling with the Antennapedia peptide. Stat6BP completely inhibited IL-4 dependent phosphorylation of Stat6 in different human and murine cell lines, while IL-3 and IL-4 dependent phosphorylation of Stat5 was not affected. The inhibitory effect of Stat6BP was transient, but could be prolonged by treating the cells with the phospatase inhibitor sodium pervanadate. Transcription from a reporter gene construct with a Stat6-dependent promoter was inhibited by Stat6BP as well, indicating that the peptide is a suitable inhibitor for cellular responses downstream from Stat6 phosphorylation. Another aim of this study was to investigate the role of the src-kinases p56lck and p59fyn in IL-4 signaltransduction. The results indicate, that the activation of both kinases is celline dependent. In some T-cellines p56lck was activated dominantly, in others p59fyn. KW - Interleukin 4 KW - Allergie KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - IL-4 KW - Interleukin-4 KW - Allergie KW - Peptide KW - STAT6 KW - Signaltransduktion KW - IL-4 KW - Interleukin-4 KW - Allergy KW - Peptid KW - Stat6 KW - Signaltransduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2375 ER - TY - THES A1 - Biela, Alexander T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung von pflanzlichen Aquaporinen T1 - Molecular and functional characterization of plant aquaporins N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Aquaporine aus Nicotiana tabacum und Samanea saman mit molekularbiologischen Methoden analysiert und durch heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis funktionell charakterisiert. Das aus Tabak isolierte Aquaporin NtAQP1 wird am höchsten in Wurzeln exprimiert, ist trotz vorhandener Cysteine nicht quecksilbersensitiv und permeabel für Glycerin und Harnstoff. Sowohl eine Ionenleitfähigkeit, als auch eine Regulation auf Proteinebene konnten im Oozytensystem nicht nachgewiesen werden. Die Leguminose Samanea saman bewegt im Tag-/Nachtrhythmus ihre Fiederblätter und -stengel. Dieses wird durch Variieren des Turgors im Flexorgewebe von Pulvini realisiert. Während SsAQP1 in seinen Charakteristika mit NtAQP1 übereinstimmt, ist SsAQP2 quecksilbersensitiv und hoch selektiv für Wasser. Der für SsAQP2 ermittelte Permeabilitätskoeffizient war um den Faktor 10 höher als der von SsAQP1. Northern Experimente zeigten, dass SsAQP2 ausschließlich im Flexorgewebe exprimiert wird. Die Expression ist zum Zeitpunkt der Streckungsbewegung des Pulvinus um 7 Uhr am stärksten. Dagegen wurde SsAQP1 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur schwach in Pulvini exprimiert. N2 - Plant aquaporins from Nicotiana tabacum and Samanea saman were analysed with molecular techniques and functionally characterised by heterologous expression in Xenopus laevis oocytes. The tobacco aquaporin NtAQP1 is highly expressed in roots and flowers. Though it possesses several cysteines residues it is not sensitive to mercurials. Additionally NtAQP1 is permeable for glycerol and urea, but not for ions. A regulation on the protein level could not be detected. The leguminose Samanea saman moves its leaflets by bending or stretching of motor organs called pulvini. This turgor related movement is restricted to the flexor and accompanied by a high flow of water. While the characteristics of SsAQP1 resemble those of NtAQP1, SsAQP2 is sensitive to mercurials and highly selective for water. The calculated permeability coefficient of SsAQP2 was ten times higher than that for SsAQP1. Northern experiments revealed a high expression of SsAQP2 exclusively in the flexor tissue, when the pulvinus is stretching in the morning. In contrast, SsAQP1 is poorly expressed in pulvini. KW - Tabak KW - Regenbaum KW - Porin KW - Wassertransport KW - Molekularbiologie KW - Aquaporin KW - NtAQP1 KW - SsAQP1 KW - SsAQP2 KW - Glycerin KW - Quecksilber KW - Oozyten KW - Pulvini KW - aquaporin KW - NtAQP1 KW - SsAQP1 KW - SsAQP2 KW - glycerol KW - mercury KW - oocytes KW - pulvini Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3207 ER -