TY - THES A1 - Michaelis, Kai T1 - Untersuchungen zur Genomstruktur und Biofilmbildung von pathogenen Escherichia coli Isolaten T1 - Analysis of genome structure and biofilm formation of pathogenic Escherichia coli strains N2 - Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und über das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen häufig Gene für Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate näher untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden für Gene, die für die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zusätzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen Stämmen mit Derivaten, bei denen Pathogenitätsinseln deletiert sind, bestätigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenitätsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten Stämme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die größten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms gehören und charakteristisch für das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch Änderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinflüsse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abhängige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erhöhte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberflächenprotein als Hauptfaktor für die RfaH-abhängige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verkürzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verstärkte Biofilmbildung. Vermutlich verstärkte die verbesserte Präsentation von Agn43 durch ein verkürztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberflächenstrukturen, wie die Colansäure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der Stämme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenitätsinseln waren temperaturabhängig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch phänotypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der äußeren Membran durch eine veränderte LPS-Struktur und die Expression von Adhäsinen die Biofilmbildung beeinflussen können. N2 - Evolutionary adaptation is the driving force for the variability observed within genomes of all different Escherichia coli pathotypes. Beside the core genome, shared by all strains, also variable regions, which can be strain-specific, are scattered on the chromosome. These flexible regions mostly encode virulence factors as well as other fitness factors and are acquired through horizontal gene transfer but are also characterised by their instability. To shed a closer light on the distribution of these virulence factors among different clinical isolates, DNA-arrays were used for genome comparisons. One aim of this Ph.D. thesis was the design of a DNA-array with specific probes for typical virulence-related genes of pathogenic E. coli. With this tool in hand, the distribution of virulence genes among several E. coli isolates was analysed. In addition to virulence related genes, also differences in the core genome of well-known uropathogenic isolates of E. coli were detected using DNA-array technology. Furthermore, the core genome of different wildtype strains was compared with derivatives shown to have lost pathogenicity islands. The results confirmed the assumption that PAI deletion from core genome is a specific process and underlies a specific mechanism. The core genome itself was very conserved and the observed small differences related to genes derived from different bacteriophages. The majority of differences were detected for the flexible regions, which differ in a strain-specific manner. DNA-array technology is also a versatile tool to gain insights in changes of gene expression levels caused by gene function disorders or environmental differences. The expression profiling approach using DNA-arrays was employed in the second part of this thesis. In this work, the RfaH-related regulon was studied by transcriptome analysis. Besides the already known effect of RfaH on facilitated capsule, LPS and alpha-haemolysin expression, the focus was set on genes involved in biofilm formation. Comparison of the 536rfaH and the wildtype strain transcriptomes revealed a significant upregulation of agn43 transcript levels. In order to study the underlying mechanisms of RfaH-dependent increased biofilm formation, selected mutants of E. coli K-12 and 536 were generated and tested for their biofilm forming capacities. In MG1655rfaH we could show that Agn43 is the major factor leading to biofilm formation. In addition, this phenotype was dependent on the LPS core truncation coming along within rfaH deficient strains. In conclusion, these results demonstrated that the LPS core truncation leads to unshielding of Agn43 in this strain, thus supporting autoaggregation and biofilm formation. Other surface structures like colanic acid had no influence on this effect. Besides the expression profiles of strains E. coli 536 and 536rfaH at 37 degrees, also expression profiles at 30 degrees and in biofilms were analysed. Typical differences in either stage were characterised. In general, when comparing the expression profiles from wildtype and mutant the changes observed were very small. However, the influence of temperature and also the mode of growth (planktonic cells vs. biofilm) affected the expression profiles in both strains more severely. In conclusion, E. coli strains not only differ in their genotypes, moreover complex phenotypic differences are observable. The obtained phenotypic differences in biofilm formation were shown to be multifactorial. The phenotype was attributed to variances in the composition of the outer membrane. In this context, the influence of LPS structures and adhesin expression was pointed out. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Transkriptomanalyse KW - Genomvariabilität KW - DNA-Array KW - Transkriptomanalyse KW - Biofilmbildung KW - Phasenvariation KW - genome variability KW - DNA-array KW - transcriptome analysis KW - biofilm formation KW - phase variation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17593 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Roland T1 - Modellierung von Metabolismus, Transkriptom und Zellentwicklung bei Arabidopsis, Listerien und anderen Organismen T1 - Modeling of metabolism, transcriptome and cell development in Arabidopsis, Listeria and other organisms N2 - Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab. N2 - In the same way that informatical knowledge has made its way into almost all areas of research in the Life Sciences, the focus of bioinformatical research has shifted towards topics originating more in the fields of mathematics and theoretical computer science. Bioinformatics today is more than the computer-driven processing of huge amounts of biological data, but it has a special focus on the emphmodelling of complex biological systems. Of special importance hereby are theories from stochastics and statistics, from the field of machine learning and theoretical computer science. In the following dissertation, I describe the systematic modelling of biological systems from an informatical-mathematical point of view in a case studies approach, applying methods from the aforementioned areas of research and on different levels of biological abstraction. Beginning with the sequence information itself, followed by the transcriptome, metabolome and the interaction of both and finally population effects I show how current biological questions can be tackled with mathematical models and combined with a variety of different experimental datasets. A special focus lies hereby on the procedure of modelling and the concept and notion of a model as such in the framework of bioinformatical research. In more detail, the projects contained the development of a new approach for embedding and visualizing Multiple Sequence and Structure Alignments, which was illustrated using a hemagglutinin alignment from different H5N1 variants as an example. Furthermore we investigated the A. thaliana transcriptome by means of a kernelized non-parametric meta-analysis, thus being able to annotate several new genes as pathogen-defense related. Another major part of this work was the modelling of the metabolic network of L. monocytogenes under activation of the transcription factor prfA, establishing predictions which were later verified by experimental 13C isotopologue studies. Following this project we investigated the relationship between the regulation of metabolism by changes in the cellular genexpression patterns and the flux distributions of the metabolic steady-state network. Modelling of a complex organismal property, the cell size development of the planktonic diatom Pseudo-nitzschia delicatissima concludes this work. KW - Bioinformatik KW - Würzburg / Universität / Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Modellierung KW - Metabolismus KW - Stoffwechsel KW - Transkriptom KW - Transkriptomanalyse KW - bioinformatics KW - metabolome KW - transcriptome KW - modeling KW - steady-state Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27622 ER - TY - THES A1 - Westermann, Alexander J. T1 - Dual RNA-seq of pathogen and host T1 - Duale RNA-Sequenzierung eines Pathogens und seines Wirts N2 - The infection of a eukaryotic host cell by a bacterial pathogen is one of the most intimate examples of cross-kingdom interactions in biology. Infection processes are highly relevant from both a basic research as well as a clinical point of view. Sophisticated mechanisms have evolved in the pathogen to manipulate the host response and vice versa host cells have developed a wide range of anti-microbial defense strategies to combat bacterial invasion and clear infections. However, it is this diversity and complexity that makes infection research so challenging to technically address as common approaches have either been optimized for bacterial or eukaryotic organisms. Instead, methods are required that are able to deal with the often dramatic discrepancy between host and pathogen with respect to various cellular properties and processes. One class of cellular macromolecules that exemplify this host-pathogen heterogeneity is given by their transcriptomes: Bacterial transcripts differ from their eukaryotic counterparts in many aspects that involve both quantitative and qualitative traits. The entity of RNA transcripts present in a cell is of paramount interest as it reflects the cell’s physiological state under the given condition. Genome-wide transcriptomic techniques such as RNA-seq have therefore been used for single-organism analyses for several years, but their applicability has been limited for infection studies. The present work describes the establishment of a novel transcriptomic approach for infection biology which we have termed “Dual RNA-seq”. Using this technology, it was intended to shed light particularly on the contribution of non-protein-encoding transcripts to virulence, as these classes have mostly evaded previous infection studies due to the lack of suitable methods. The performance of Dual RNA-seq was evaluated in an in vitro infection model based on the important facultative intracellular pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium and different human cell lines. Dual RNA-seq was found to be capable of capturing all major bacterial and human transcript classes and proved reproducible. During the course of these experiments, a previously largely uncharacterized bacterial small non-coding RNA (sRNA), referred to as STnc440, was identified as one of the most strongly induced genes in intracellular Salmonella. Interestingly, while inhibition of STnc440 expression has been previously shown to cause a virulence defect in different animal models of Salmonellosis, the underlying molecular mechanisms have remained obscure. Here, classical genetics, transcriptomics and biochemical assays proposed a complex model of Salmonella gene expression control that is orchestrated by this sRNA. In particular, STnc440 was found to be involved in the regulation of multiple bacterial target mRNAs by direct base pair interaction with consequences for Salmonella virulence and implications for the host’s immune response. These findings exemplify the scope of Dual RNA-seq for the identification and characterization of novel bacterial virulence factors during host infection. N2 - Die Infektion einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem bakteriellen Pathogen ist eines der komplexesten Beispiele einer Domänen-überschreitenden Wechselwirkung zweier Organismen. Infektionsprozesse sind in höchstem Maße relevant, sowohl in der Grundforschung als auch von einem klinischen Blickwinkel aus betrachtet. Im Laufe der Evolution entstanden komplizierte Mechanismen, die es einem Pathogen erlauben, die Wirtsantwort zu manipulieren. Umgekehrt haben potentielle Wirtszellen eine Reihe von anti-mikrobiellen Verteidigungsstrategien entwickelt, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen und letztlich zu beseitigen. Es sind jedoch genau diese Verschiedenheit und Komplexität, welche die Infektionsforschung so anspruchsvoll und technisch schwer analysierbar machen. Gängige Analysemethoden wurden zumeist entweder für bakterielle oder aber eukaryontische Organismen entwickelt. Dagegen werden Techniken benötigt, welche es erlauben, mit den mitunter extremen Unterschieden zwischen Wirt und Pathogen umzugehen, die sich in etlichen zellulären Eigenschaften und Prozessen manifestieren. Eine Klasse zellulärer Makromoleküle, die diese Heterogenität zwischen Wirt und Pathogen widerspiegelt, sind ihre jeweiligen Transkriptome: Bakterielle Transkripte unter-scheiden sich von ihren eukaryontischen Pendants in vielerlei Hinsicht, was sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte miteinschließt. Die Gesamtheit zellulärer Transkripte ist von größter Bedeutung, da sie den physiologischen Zustand der jeweiligen Zelle unter den gegebenen Bedingungen reflektiert. Aus diesem Grund werden Genom-weite Transkriptom-techniken wie etwa die RNA-Sequenzierung seit etlichen Jahren erfolgreich angewandt, um biologische Prozesse zu untersuchen – jedoch ist deren Eignung für Infektionsstudien in starkem Maße limitiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines neuartigen Ansatzes, „Duale RNA-Sequenzierung“ genannt, der Transkriptomstudien mit der Infektionsbiologie kompatibel macht. Mithilfe dieser Technologie wurde hier im Besonderen versucht, die Rolle nicht-proteinkodierender RNA-Moleküle für die Virulenz zu beleuchten, da die Charakterisierung dieser RNA-Klassen bisherigen Infektionsstudien weitgehend verwehrt blieb. Die Anwendbar-keit der Dualen RNA-Sequenzierung wurde innerhalb eines In-vitro-Infektionsmodells getestet, welches auf dem wichtigen, fakultativ intrazellulären Pathogen Salmonella enterica serovar Tyhimurium und verschiedenen humanen Zelllinien basiert. Die Duale RNA-Sequenzierung zeigte sich dabei in der Lage alle wesentlichen bakteriellen sowie humanen Transkriptklassen zu erfassen und erwies sich als reproduzierbar. Im Zuge dieser Experimente wurde ein Gen für eine zuvor kaum beschriebene kleine nicht-kodierende RNA (STnc440) als eines der am stärksten induzierten Gene intrazellulärer Salmonellen identifiziert. Interessanterweise hatten vorherige Studien gezeigt, dass die Inaktivierung dieses Gens zu einem Virulenzdefizit innerhalb unterschiedlicher Tiermodelle für Salmonellose führt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen blieben jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische, Transkriptom- sowie biochemische Analysen eingesetzt um das komplexe Regulationsnetzwerk dieser kleinen RNA erstmals näher zu beleuchten. Im Einzelnen konnte gezeigt werden, dass STnc440 die Expression mehrerer bakterieller mRNAs durch das Ausbilden zwischen-molekularer Basenpaarungen reguliert, was weitreichende Konsequenzen sowohl für die Virulenz des Pathogens als auch die Immunantwort des Wirts hat. Diese Ergebnisse veranschaulichen das Potential der Dualen RNA-Sequenzierung für das Auffinden und Charakterisieren neuer bakterieller Virulenzfaktoren während der Wirtsinfektion. KW - Transkriptomanalyse KW - Dual RNA-seq KW - Salmonella enterica KW - Wirtszelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112462 ER - TY - THES A1 - Terhoeven, Niklas T1 - Genomics of carnivorous Droseraceae and Transcriptomics of Tobacco pollination as case studies for neofunctionalisation of plant defence mechanisms T1 - Genomik karnivorer Droseraceae und Transkriptomik der Befruchtung von Tabak als Fallstudien zur Umfunktionierung pflanzlicher Verteidigungsmechanismen N2 - Plants have evolved many mechanisms to defend against herbivores and pathogens. In many cases, these mechanisms took other duties. One example of such a neofunction- alisation would be carnivory. Carnivory evolved from the defence against herbivores. Instead of repelling the predator with a bitter taste, the plant kills it and absorbs its nutrients. A second example can be found in the pollination process. Many of the genes involved here were originally part of defence mechanisms against pathogens. In this thesis, I study these two examples on a genomic and transcriptomic level. The first project, Genomics of carnivorous Droseraceae, aims at obtaining annotated genome sequences of three carnivorous plants. I assembled the genome of Aldrovanda vesiculosa, annotated those of A. vesiculosa, Drosera spatulata and Dionaea muscipula and com- pared their genomic contents. Because of the high repetitiveness of the D. muscipula genome, I also developed reper, an assembly free method for detection, classification and quantification of repeats. With that method, we were able to study the repeats without the need of incorporating them into a genome assembly. The second large project investigates the role of DEFL (defensin-like) genes in pollen tube guidance in tobacco flowers. We sequenced the transcriptome of the SR1 strain in different stages of the pollination process. I assembled and annotated the transcriptome and searched for differentially expressed genes. We also used a method based on Hidden- Markov-Models (HMM) to find DEFLs, which I then analysed regarding their expression during the different stages of fertilisation. In total, this thesis results in annotated genome assemblies of three carnivorous Droser- aceae, which are used as a foundation for various analyses investigating the roots of car- nivory, insights into the role of DEFLs on a transcriptomic level in tobacco pollination and a new method for repeat identification in complex genomes. N2 - Im Laufe der Evolution haben Pflanzen viele Methoden entwickelt, um sich gegen Fress- feinde und Pathogene zu verteidgen. Viele dieser Methoden wurden im Laufe der Zeit umfunktioniert. Ein Beispiel hierfür ist die Karnivorie, welche aus der Verteidigung ge- gen Fressfeinde entstanden ist. Anstelle einen Angreifer durch bitteren Geschmack zu vertreiben, tötet die Pflanze das Tier und nimmt seine Nährstoffe auf. Ein weiteres Bei- spiel ist der Bestäubungs- und Befruchtungsprozess. Viele der Gene, die hier involviert sind, stammen ursprünglich aus Mechanismen zur Verteidigung gegen Pathogene. In dieser Arbeit untersuche ich diese beiden Beispiele auf genomischer und transkrip- tomischer Ebene. Die Zielsetzung des ersten Projekts, Genomik von karnivoren Dro- seraceaen, ist es, assemblierte und annotierte Genome von drei karnivoren Pflanzen zu generieren. Ich habe dazu das Genom von Aldrovanda vesiculosa assembliert und dieses, sowie die Genome von Drosera spatulata und Dionaea muscipula annotiert und mit- einander verglichen. Aufgrund des hohen Anteils repetitiver Elemente im D. muscipula Genom habe ich reper, eine Methode zum Detektieren, Klassifizieren und Quantifizieren von Repeats, entwickelt. Mit dieser Methode ist es nun möglich, repetitive Elemente zu untersuchen, ohne diese in einem Genomassembly integrieren zu müssen. Das zweite große Projekt untersucht die Rolle von DEFL (defensin-like) Genen im Pollenschlauchwachstum in Tabakblüten. Dazu haben wir das Transkriptom der SR1 Variante zu verschiedenen Zeitpunkten im Befruchtungsprozess sequenziert. Ich habe dieses Transkriptom assembliert und annotiert und darin nach differentiell exprimierten Genen gesucht. Zudem haben wir mit einer auf Hidden Markov Modellen (HMM) ba- sierten Methode nach DEFL Genen gesucht und ich habe die Expression dieser in den verschiedenen Stadien untersucht. Zusammenfassend beinhalten die Ergebnisse dieser Thesis annotierte Genomassemb- lies von drei karnivoren Droseraceaen, Erkenntnisse über die Rolle von DEFL Genen bei der Befruchtung auf einer transkriptomischen Ebene und eine neue Software zur Analyse von repetitiven Elementen in komplexen Genomen. KW - Droseraceae KW - Genom KW - Nicotiana tabacum KW - Transkriptomanalyse KW - Repeats KW - genomics KW - carnivorous plants KW - next generation sequencing Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189712 ER - TY - THES A1 - Herz, Michaela T1 - Genome wide expression profiling of Echinococcus multilocularis T1 - Genomweite Expressionsanalysen von Echinococcus multilocularis N2 - Alveolar echinococcosis, which is caused by the metacestode stage of the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a severe zoonotic disease with limited treatment options. For a better understanding of cestode biology the genome of E. multilocularis, together with other cestode genomes, was sequenced previously. While a few studies were undertaken to explore the E. multilocularis transcriptome, a comprehensive exploration of global transcription profiles throughout life cycle stages is lacking. This work represents the so far most comprehensive analysis of the E. multilocularis transcriptome. Using RNA-Seq information from different life cycle stages and experimental conditions in three biological replicates, transcriptional differences were qualitatively and quantitatively explored. The analyzed datasets are based on samples of metacestodes cultivated under aerobic and anaerobic conditions as well as metacestodes obtained directly from infected jirds. Other samples are stem cell cultures at three different time points of development as well as non-activated and activated protoscoleces, the larval stage that can develop into adult worms. In addition, two datasets of metacestodes under experimental conditions suitable for the detection of genes that are expressed in stem cells, the so-called germinative cells, and one dataset from a siRNA experiment were analyzed. Analysis of these datasets led to expression profiles for all annotated genes, including genes that are expressed in the tegument of metacestodes and play a role in host-parasite interactions and modulation of the host's immune response. Gene expression profiles provide also further information about genes that might be responsible for the infiltrative growth of the parasite in the liver. Furthermore, germinative cell-specific genes were identified. Germinative cells are the only proliferating cells in E. multilocularis and therefore of utmost importance for the development and growth of the parasite. Using a combination of germinative cell depletion and enrichment methods, genes with specific expression in germinative cells were identified. As expected, many of these genes are involved in translation, cell cycle regulation or DNA replication and repair. Also identified were transcription factors, many of which are involved in cell fate commitment. As an example, the gene encoding the telomerase reverse transcriptase (TERT) was studied further. Expression of E. multilocularis tert in germinative cells was confirmed experimentally. Cell culture experiments indicate that TERT is required for proliferation and development of the parasite, which makes TERT a potentially interesting drug target for chemotherapy of alveolar echinococcosis. Germinative cell specific genes in E. multilocularis also include genes of densoviral origin. More than 20 individual densovirus loci with information for non-structural and structural densovirus proteins were identified in the E. multilocularis genome. Densoviral elements were also detected in many other cestode genomes. Genomic integration of these elements suggests that densovirus-based vectors might be suitable tools for genetic manipulation of tapeworms. Interestingly, only three of more than 20 densovirus loci in the E. multilocularis genome are expressed. Since the canonical piRNA pathway is lacking in cestodes, this raises the question about potential silencing mechanisms. Exploration of RNA-Seq information indicated natural antisense transcripts as a potential gene regulation mechanism in E. multilocularis. Preliminary experiments further suggest DNA-methylation, which was previously shown to occur in platyhelminthes, as an interesting avenue to explore in future. The transcriptome datasets also contain information about genes that are expressed in differentiated cells, for example the serotonin transporter gene that is expressed in nerve cells. Cell culture experiments indicate that serotonin and serotonin transport play an important role in E. multilocularis proliferation, development and survival. Overall, this work provides a comprehensive transcription data atlas throughout the E. multilocularis life cycle. Identification of germinative cell-specific genes and genes important for host-parasite interactions will greatly facilitate future research. A global overview of gene expression profiles will also aide in the detection of suitable drug targets and the development of new chemotherapeutics against alveolar echinococcosis. N2 - Alveoläre Echinokokkose wird durch das Metazestodenstadium des kleinen Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis verursacht und medizinisch als eine schwere Zoonose mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten betrachtet. Um ein besseres Verständnis für die Biologie der Zestoden zu erlangen, wurde das Genom von E. multilocularis, zusammen mit denen anderer Zestoden, bereits sequenziert. Bisher wurden nur wenige Studien zum Transkriptom von E. multilocularis durchgeführt und eine umfassende Analyse der Transkriptionsprofile über verschiedene Stadien des Lebenszyklus hinweg fehlt bislang. Diese Arbeit stellt die bisher umfassendste Untersuchung des Transkriptoms von E. multilocularis dar. Unterschiede in der Genexpression in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus und unter experimentellen Bedingungen wurden qualitativ und quantitativ untersucht. Dazu wurden Daten aus RNA-Sequenzierungen in drei biologischen Replikaten verwendet. Die untersuchten Datensätze beruhen auf Proben von Metazestoden, die unter aeroben und anaeroben Bedingungen kultiviert, sowie von Metazestoden, die direkt aus Gerbilen isoliert wurden. Weitere Proben umfassen Stammzellkulturen zu drei verschiedenen Entwicklungszeitpunkten sowie nicht-aktivierte und aktivierte Protoskolizes, das Larvenstadium das sich zu Adulten entwickeln kann. Zusätzlich wurden zwei Datensätze von Metazestoden unter experimentellen Bedingungen, die zur Identifizierung stammzellspezifischer (keimzellspezifischer) Gene geeignet sind, sowie ein Datensatz von einem siRNA-Experiment untersucht. Die Analyse dieser Datensätze führte zu Genexpressionsprofilen für alle annotierten Gene, unter anderem für Gene, die im Tegument des Metazestoden exprimiert werden und eine Rolle spielen bei Wirt-Parasit-Interaktionen und der Modulierung der Immunantwort des Wirts. Genexpressionsprofile liefern zudem Informationen über Gene, die für das infiltrative Wachstum des Parasiten in der Leber verantwortlich sein könnten. Des Weiteren wurden keimzellspezifische Gene identifiziert. Keimzellen sind die einzigen proliferierenden Zellen in E. multilocularis und daher von essentieller Bedeutung für die Entwicklung und das Wachstum des Parasiten. Durch eine Kombination von Keimzelldepletierungs- und Keimzellanreicherungsverfahren wurden Gene mit keimzellspezifischer Expression identifiziert. Wie erwartet, sind viele dieser Gene in der Translation, der Zellzyklusregulation oder DNA-Replikation und –Reparatur involviert. Darüber hinaus wurden keimzellspezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren detektiert, von denen viele in der Festlegung des Zellschicksals eine Rolle spielen. Als Beispiel eines keimzellspezifischen Genes wurde das Gen, das für die reverse Transkriptase (TERT) kodiert, genauer untersucht. Die Expression von E. multilocularis tert in Keimzellen wurde experimentell bestätigt. Zellkulturexperimente weisen darauf hin, dass TERT für die Proliferation und die Entwicklung essentiell ist. TERT ist daher ein potentiell interessantes Wirkstofftarget für die chemotherapeutische Behandlung der alveolären Echinokokkose. Zu den keimzellspezifischen Genen in E. multilocularis gehören auch Gene densoviralen Ursprungs. Es wurden mehr als 20 Densovirusloci mit Informationen für nicht-strukturelle und strukturelle Densovirusproteine im E. multilocularis-Genom identifiziert. Densovirale Elemente wurden auch in vielen anderen Zestodengenomen detektiert. Die genomische Integration dieser Elemente deutet darauf hin, dass densovirus-basierte Vektoren zur genetischen Manipulation von Zestoden geeignet sein könnten. Interessanterweise sind nur drei von mehr als 20 Densovirusloci im E. multilocularis-Genom exprimiert. Da es in Zestoden keinen kanonischen piRNA-Signalweg gibt, stellt sich die Frage nach möglichen Genabschaltungsmechanismen. Die Analyse der RNA-Sequenzierdaten ergab Hinweise auf natürliche Antisense-Transkripte als einen möglichen Genregulationsmechanismus in E. multilocularis. Vorläufige Experimente und bisherige Studien deuten weiterhin darauf hin, dass DNA-Methylierung ein Mechanismus der Genregulation und -abschaltung in Zestoden sein könnte. Die Transkriptionsdaten enthalten auch Informationen zu Genen, die in differenzierten Zellen exprimiert werden, wie zum Beispiel das Serotonintransportergen, das in Nervenzellen exprimiert wird. Zellkulturversuche weisen darauf hin, dass Serotonin und Serotonintransport eine wichtige Rolle bei der Proliferation, der Entwicklung und dem überleben von E. multilocularis spielen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen umfassenden Transkriptionsdatenatlas über die Stadien des Lebenszyklus von E. multilocularis. Die Identifizierung von keimzellspezifischen Genen und Genen, die für die Interaktion zwischen Wirt und Parasit wichtig sind, wird die zukünftige Forschung erheblich erleichtern. Ein globaler Überblick über die Genexpressionsprofile wird zudem hilfreich sein bei der Entdeckung geeigneter Wirkstofftargets und bei der Entwicklung neuer Chemotherapeutika gegen die alveoläre Echinokokkose. KW - Fuchsbandwurm KW - Serotonin KW - Telomerase KW - Stammzelle KW - Transkriptomanalyse KW - foxtapeworm KW - transcriptome data analysis KW - germinative cell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203802 ER - TY - THES A1 - Mika-Gospodorz, Bozena T1 - Development and application of bioinformatics tools for analysis of dual RNA-seq experiments T1 - Entwicklung und Anwendung von Bioinformatikwerkzeugen für die Analyse von dualen RNA-seq Experimenten N2 - Dual RNA-seq captures both host and pathogen transcriptomes at the site of infection, facilitating an exploration of processes that play an essential role in pathogenesis and the host defense. This work presents an application of this technique to explore processes occurring during the infection of the human endothelial cells with two clinical isolates of Orientia tsutsugamushi (Ot) — the causative agent of scrub typhus. Combining comparative genomics, transcriptomics, and proteomics, we investigated the transcriptional architecture of Ot and identified non-coding RNAs, operon structures, and widespread antisense transcription, that may have a role in regulation of repetitive genes that are abundant in the Ot genome. In addition, the comparative analysis of bacterial and eukaryotic transcriptomes allowed us to investigate factors that drive the difference in virulence between Karp and UT176 and the host response to these two Ot strains. The host and pathogen transcriptional profiles in each dual RNA-seq study are obtained in‑silico by adopting tools developed for RNA-seq data analysis. The Dualrnaseq pipeline presented in the second part of this work is the first publicly available, highly reproducible, scalable, and user‑friendly workflow developed for processing dual RNA‑seq data of any eukaryotic and bacterial organisms with a reference genome and annotation. It provides three mapping and quantification strategies: (i) alignment-based mapping of reads onto the chimeric genome with STAR followed by counting of uniquely mapped reads with HTSeq; (ii) a fast transcriptome quantification method handling multi‑mapped reads (Salmon with Selective Alignment); (iii) and Salmon alignment-based mode which uses a STAR‑derived alignment combined with Salmon quantification. Performing an initial benchmark analysis of the employed methods we provided recommendations ensuring accurate estimation of host and pathogen transcript expression. N2 - Duale RNA-seq erfasst sowohl das Transkriptom des Wirts als auch das des Erregers am Ort der Infektion und ermöglicht so die Erforschung von Prozessen, die eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese und der Abwehr des Wirts spielen. In dieser Arbeit wird eine Anwendung dieser Technik zur Untersuchung von Prozessen vorgestellt, die während der Infektion menschlicher Endothelzellen mit zwei klinischen Isolaten von Orientia tsutsugamushi (Ot) - dem Erreger von Scrub-Typhus - ablaufen. Durch die Kombination von vergleichender Genomik, Transkriptomik und Proteomik untersuchten wir die Transkriptionsarchitektur von Ot und identifizierten nicht-kodierende RNAs, Operon-Strukturen und weit verbreitete Antisense-Transkription, die möglicherweise eine Rolle bei der Regulierung repetitiver Gene spielen, die im Ot-Genom reichlich vorhanden sind. Darüber hinaus ermöglichte uns die vergleichende Analyse der bakteriellen und eukaryotischen Transkriptome die Untersuchung der Faktoren, die für die unterschiedliche Virulenz von Karp und UT176 und die Reaktion des Wirts auf diese beiden Ot-Stämme verantwortlich sind. Die Wirts- und Erreger-Transkriptionsprofile in jeder dualen RNA-seq-Studie werden in-silico mit Hilfe von Tools erstellt, die für die RNA-seq-Datenanalyse entwickelt wurden. Die im zweiten Teil dieser Arbeit vorgestellte Dualrnaseq-Pipeline ist der erste öffentlich verfügbare, hochgradig reproduzierbare, skalierbare und benutzerfreundliche Arbeitsablauf, der für die Verarbeitung dualer RNA-seq-Daten beliebiger eukaryotischer und bakterieller Organismen mit einem Referenzgenom und einer Annotation entwickelt wurde. Er bietet drei Mapping- und Quantifizierungsstrategien: (i) Alignment-basiertes Mapping von Reads auf das chimäre Genom mit STAR, gefolgt von der Zählung eindeutig gemappter Reads mit HTSeq; (ii) eine schnelle Transkriptom-Quantifizierungsmethode, die mit mehrfach gemappten Reads arbeitet (Salmon mit selektivem Alignment); (iii) und einen Salmon-Alignment-basierten Modus. In einer ersten Benchmark-Analyse der verwendeten Methoden haben wir Empfehlungen ausgesprochen, die eine genaue Schätzung der Expression von Wirts- und Pathogentranskripten gewährleisten. KW - Transkriptomanalyse KW - Dual RNA-seq data analysis KW - Orientia tsutsugamushi Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281264 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Ruth Magdalena T1 - Molekular- und zellbiologische Untersuchung zur Rolle des kanonischen Wnt-Signalwegs bei der Entwicklung von \(Echinococcus\) \(multilocularis\) T1 - Molecular and cell biological investigations on the role of canonical Wnt signaling in \(E.\) \(multilocularis\) development N2 - Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet. Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt. Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen. N2 - Alveolar echinococcosis (AE) is a life-threatening human disease caused by the infiltrative growth of the metacestode larval stage of the fox tapeworm (Echinococcus multilocularis) within the host liver. According to previous research, the tumor-like growth of the metacestode is due to an Echinococcus-specific modification of the anterior-posterior (AP)-body axis formation. It is thus assumed that the invading oncosphere larva transiently represses the anterior pole, giving rise to metacestode vesicles which proliferate within the host as posteriorized tissue. Upon massive proliferation, the anterior pole is re-established at numerous sites within the metacestode tissue, yielding large numbers of tapeworm heads (protoscoleces). Since the formation of the AP-body axis is evolutionarily conserved and regulated by canonical wingless-related (Wnt) signaling, the present work investigated in detail the role of the Wnt-pathway in Echinococcus metacestode formation via molecular and cell biological studies. Methodologically, this work focussed on an Echinococcus stem cell cultivation system, called the primary cell system, which allows the in-vitro generation of mature metacestode vesicles through proliferation and differentiation of germinative cells (stem cells). By genome-wide RNA-Seq transcriptomics it is shown that primary cell cultures express marker genes for both posterior development towards the metacestode as well as anterior development of head organizers. By RNA interference (RNAi), successful knockdown of the presumed central regulator of canonical Wnt-signaling, β-catenin (em-bcat1), was achieved, yielding a striking phenotype ('red dot'), the first RNAi phenotype described for E. multilocularis primary cells. Primary cell cultures after em-bcat1 RNAi showed a greatly reduced ability to form metacestode vesicles as well as an overproliferation of germinative cells. Additional RNA-Seq analysis of the transcriptome of RNAi(em-bcat1) cultures indicated significantly decreased expression of posterior and metacestode markers whereas anterior and protoscolex markers were markedly overexpressed. These data were verified using whole-mount-in-situ-hybridization (WMISH) for several selected marker genes for posterior (metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) and for anterior development (protoscolex; em-sfrp, em-nou-darake, em npp36, em frizzled10). In all cases, a change in polarity showed decreased gene expression of posterior markers whereas anterior markers were significantly increased in expression. Similar to the situation in related planarians, knockdown of β Catenin in E. multilocularis lead in anteriorized, anterior- and protoscolex marker-dominated gene expression and antagonized the formation of the posteriorized metacestode. In addition to marker genes for AP-axis formation, this work also established marker genes for the medio-lateral (ML)-body axis in cestodes for the first time. In particular, a slit orthologue (em slit) was shown to be expressed in the E. multilocularis protoscolex at the body midline and provided evidence that, similar to the situation in planarians, the ML-axis of E. multilocularis is defined by morphogen gradients consisting of slit (midline) and wnt5 (lateral). In contrast, only em-slit is expressed in the metacestode. Thus, the metacestode tissue is indeed posterior-medianized and the AP- and ML-axes are established only with formation of protoscoleces. Finally, the results of this work suggest that Hedgehog (Hh) signaling plays a critical role in the reestablishment of body axes during protoscoleces development. In conclusion, this work identified the central regulator of the canonical Wnt-signaling pathway, β-catenin, as a master regulator of E. multilocularis metacestode development. Furthermore, it is herein established that metacestode formation not only involves Echinococcus-specific modification of the AP-axis but also of the ML-axis. In human malignant tumors, the Wnt, Slit-Robo, and Hh-pathway are well-studied drug targets and may similarly serve for AE targeted therapy in the future. KW - Fuchsbandwurm KW - Transkriptomanalyse KW - foxtapeworm KW - Echinococcus KW - Wnt-Signalweg KW - Körperachsen KW - Germinative Zellen KW - beta-Catenin KW - Wnt-pathway KW - body axis KW - Stammzelle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-271937 ER - TY - THES A1 - Reuter, Christian Steffen T1 - Development of a tissue-engineered primary human skin infection model to study the pathogenesis of tsetse fly-transmitted African trypanosomes in mammalian skin T1 - Entwicklung eines primären humanen Hautinfektionsmodells basierend auf Gewebezüchtung zur Erforschung der Pathogenese von Tsetsefliegen-übertragenen Afrikanischen Trypanosomen in der Säugetierhaut N2 - Many arthropods such as mosquitoes, ticks, bugs, and flies are vectors for the transmission of pathogenic parasites, bacteria, and viruses. Among these, the unicellular parasite Trypanosoma brucei (T. brucei) causes human and animal African trypanosomiases and is transmitted to the vertebrate host by the tsetse fly. In the fly, the parasite goes through a complex developmental cycle in the alimentary tract and salivary glands ending with the cellular differentiation into the metacyclic life cycle stage. An infection in the mammalian host begins when the fly takes a bloodmeal, thereby depositing the metacyclic form into the dermal skin layer. Within the dermis, the cell cycle-arrested metacyclic forms are activated, re-enter the cell cycle, and differentiate into proliferative trypanosomes, prior to dissemination throughout the host. Although T. brucei has been studied for decades, very little is known about the early events in the skin prior to systemic dissemination. The precise timing and the mechanisms controlling differentiation of the parasite in the skin continue to be elusive, as does the characterization of the proliferative skin-residing trypanosomes. Understanding the first steps of an infection is crucial for developing novel strategies to prevent disease establishment and its progression. A major shortcoming in the study of human African trypanosomiasis is the lack of suitable infection models that authentically mimic disease progression. In addition, the production of infectious metacyclic parasites requires tsetse flies, which are challenging to keep. Thus, although animal models - typically murine - have produced many insights into the pathogenicity of trypanosomes in the mammalian host, they were usually infected by needle injection into the peritoneal cavity or tail vein, bypassing the skin as the first entry point. Furthermore, animal models are not always predictive for the infection outcome in human patients. In addition, the relatively small number of metacyclic parasites deposited by the tsetse flies makes them difficult to trace, isolate, and study in animal hosts. The focus of this thesis was to develop and validate a reconstructed human skin equivalent as an infection model to study the development of naturally-transmitted metacyclic parasites of T. brucei in mammalian skin. The first part of this work describes the development and characterization of a primary human skin equivalent with improved mechanical properties. To achieve this, a computer-assisted compression system was designed and established. This system allowed the improvement of the mechanical stability of twelve collagen-based dermal equivalents in parallel through plastic compression, as evaluated by rheology. The improved dermal equivalents provided the basis for the generation of the skin equivalents and reduced their contraction and weight loss during tissue formation, achieving a high degree of standardization and reproducibility. The skin equivalents were characterized using immunohistochemical and histological techniques and recapitulated key anatomical, cellular, and functional aspects of native human skin. Furthermore, their cellular heterogeneity was examined using single-cell RNA sequencing - an approach which led to the identification of a remarkable repertoire of extracellular matrix-associated genes expressed by different cell subpopulations in the artificial skin. In addition, experimental conditions were established to allow tsetse flies to naturally infect the skin equivalents with trypanosomes. In the second part of the project, the development of the trypanosomes in the artificial skin was investigated in detail. This included the establishment of methods to successfully isolate skin-dwelling trypanosomes to determine their protein synthesis rate, cell cycle and metabolic status, morphology, and transcriptome. Microscopy techniques to study trypanosome motility and migration in the skin were also optimized. Upon deposition in the artificial skin by feeding tsetse, the metacyclic parasites were rapidly activated and established a proliferative population within one day. This process was accompanied by: (I) reactivation of protein synthesis; (II) re-entry into the cell cycle; (III) change in morphology; (IV) increased motility. Furthermore, these observations were linked to potentially underlying developmental mechanisms by applying single-cell parasite RNA sequencing at five different timepoints post-infection. After the initial proliferative phase, the tsetse-transmitted trypanosomes appeared to enter a reversible quiescence program in the skin. These quiescent skin-residing trypanosomes were characterized by very slow replication, a strongly reduced metabolism, and a transcriptome markedly different from that of the deposited metacyclic forms and the early proliferative trypanosomes. By mimicking the migration from the skin to the bloodstream, the quiescent phenotype could be reversed and the parasites returned to an active proliferating state. Given that previous work has identified the skin as an anatomical reservoir for T. brucei during disease, it is reasonable to assume that the quiescence program is an authentic facet of the parasite's behavior in an infected host. In summary, this work demonstrates that primary human skin equivalents offer a new and promising way to study vector-borne parasites under close-to-natural conditions as an alternative to animal experimentation. By choosing the natural transmission route - the bite of an infected tsetse fly - the early events of trypanosome infection have been detailed with unprecedented resolution. In addition, the evidence here for a quiescent, skin-residing trypanosome population may explain the persistence of T. brucei in the skin of aparasitemic and asymptomatic individuals. This could play an important role in maintaining an infection over long time periods. N2 - Zahlreiche Arthropoden wie Stechmücken, Zecken, Wanzen und Fliegen sind Überträger für krankheitserregende Parasiten, Bakterien und Viren. Hierzu gehört der einzellige Parasit Trypanosoma brucei (T. brucei), welcher durch Tsetsefliegen übertragen wird und die Afrikanische Trypanosomiasis bei Menschen und Tieren verursacht. Der Entwicklungszyklus des Parasiten in der Fliege ist komplex und endet in der Speicheldrüse mit der Differenzierung in das metazyklische Lebensstadium. Diese metazyklischen Formen werden durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege in die dermale Hautschicht des Säugetierwirts injiziert. Die zellzyklusarretierten metazyklischen Formen werden in der Dermis aktiviert und der Widereintritt in den Zellzyklus sowie die Differenzierung zu proliferativen Trypanosomen eingeleitet. Anschließend breitet sich der Parasit systemisch im Säugetierwirt aus. Obwohl T. brucei bereits seit Jahrzehnten erforscht wird, ist nur sehr wenig über das frühe Infektionsgeschehen in der Haut bekannt. Der genaue Zeitpunkt und die Mechanismen, die der Differenzierung des Parasiten in der Haut zugrunde liegen, sind unbekannt. Ebenso wurden die proliferativen Trypanosomen in der Haut bisher nur unzureichend charakterisiert. Das Verständnis über die ersten Schritte einer Infektion ist jedoch von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von neuen Strategien, die die Krankheitsentstehung und deren Fortschreiten verhindern sollen. Ein großes Hindernis bei der Erforschung der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis ist der Mangel an geeigneten Infektionsmodellen, die den Krankheitsverlauf authentisch nachbilden. Außerdem werden für die Erzeugung der infektiösen metazyklischen Parasiten Tsetsefliegen benötigt, die aufwändig zu züchten sind. Tiermodelle haben es ermöglicht - hauptsächlich Mäuse -, viele Erkenntnisse über die Pathogenese von Trypanosomen im Säugetierwirt zu erlangen. Allerdings wurden diese überwiegend durch Nadelinjektion in den Bauchraum oder die Kaudalvene infiziert, wodurch die Haut als erste Eintrittspforte umgangen wurde. Darüber hinaus lassen Tiermodelle nicht immer Rückschlüsse auf den Infektionsverlauf beim Menschen zu. Zusätzlich erschwert die geringe Anzahl von metazyklischen Parasiten, die von Tsetsefliegen injiziert werden, die Isolation, Nachweis und Untersuchung im tierischen Wirt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein rekonstruiertes menschliches Hautäquivalent zu entwickeln und als Infektionsmodell zu validieren, um die Entwicklung von natürlich übertragenen metazyklischen Parasiten von T. brucei in der Säugetierhaut zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines primären menschlichen Hautäquivalents mit verbesserten mechanischen Eigenschaften. Zu diesem Zweck wurde ein computergesteuertes Kompressionssystem entworfen und hergestellt. Dieses System ermöglichte die gleichzeitige Verbesserung der mechanischen Stabilität von zwölf kollagenbasierten dermalen Äquivalenten durch plastische Kompression, die mittels Rheologie evaluiert wurden. Die verbesserten dermalen Äquivalente dienten als Fundament für die Erzeugung der Hautäquivalente und reduzierten deren Kontraktion und Gewichtsverlust während der Gewebebildung. Dadurch wurde ein hohes Maß an Standardisierung und Reproduzierbarkeit erreicht. Die Hautäquivalente wurden durch immunhistochemische und histologische Techniken charakterisiert und bildeten wichtige anatomische, zelluläre und funktionelle Aspekte der nativen menschlichen Haut nach. Des Weiteren wurde die zelluläre Heterogenität durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung untersucht. Mit dieser Technik wurde ein umfangreiches Spektrum an extrazellulären Matrix-assoziierten Genen identifiziert, die von verschiedenen Zellsubpopulationen in der künstlichen Haut exprimiert werden. Zusätzlich wurden experimentelle Bedingungen etabliert, damit Tsetsefliegen eingesetzt werden konnten, um die Hautäquivalente auf natürlichem Weg mit Trypanosomen zu infizieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Entwicklung der Trypanosomen in der künstlichen Haut im Detail untersucht. Dies umfasste die Etablierung von Methoden zur erfolgreichen Isolierung der Trypanosomen aus der Haut, um deren Proteinsyntheserate, Zellzyklus- und Stoffwechselstatus, sowie Morphologie und Transkriptom zu bestimmen. Zusätzlich wurden Mikroskopietechniken zur Untersuchung der Trypanosomenmotilität und migration in der Haut optimiert. Nach der Injektion in die künstliche Haut durch Tsetsefliegen wurden die metazyklischen Parasiten schnell aktiviert und etablierten innerhalb eines Tages eine proliferative Population. Dieser Entwicklungsprozess wurde begleitet von (I) einer Reaktivierung der Proteinsynthese, (II) einem Wiedereintritt in den Zellzyklus, (III) einer Veränderung der Morphologie und (IV) einer erhöhten Motilität. Des Weiteren wurden diese Beobachtungen mit potentiell zugrundeliegenden entwicklungsbiologischen Mechanismen in Verbindung gebracht, indem eine Einzelzell RNA-Sequenzierung der Trypanosomen zu fünf verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt wurde. Nach der ersten proliferativen Phase traten die Tsetse-übertragenen Trypanosomen in der Haut in ein reversibles Ruhestadium ein. Diese ruhenden Trypanosomen waren durch eine sehr langsame Zellteilung, einen stark reduzierten Stoffwechsel und ein Transkriptom gekennzeichnet, dass sich deutlich von dem der injizierten metazyklischen Formen und der ersten proliferativen Trypanosomen unterschied. Durch Nachahmung der Migration von der Haut in den Blutkreislauf konnte dieser Phänotyp reaktiviert werden und die Parasiten kehrten in einen aktiven, proliferierenden Zustand zurück. Unter Berücksichtigung, dass vorangegangene Forschungsarbeiten die Haut als anatomisches Reservoir für T. brucei während des Krankheitsverlaufs identifiziert haben, ist anzunehmen, dass das Ruheprogramm eine authentische Facette im Verhalten des Parasiten in einem infizierten Wirt darstellt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, das primäre menschliche Hautäquivalente eine neue und vielversprechende Möglichkeit bieten, vektorübertragene Parasiten unter naturnahen Bedingungen als Alternative zu Tierversuchen zu untersuchen. Durch die Verwendung des natürlichen Infektionsweges - dem Biss einer infizierten Tsetsefliege -, konnten die frühen Prozesse einer Trypanosomen-Infektion mit noch nie dagewesener Detailtiefe nachvollzogen werden. Des Weiteren könnte der hier erbrachte Nachweis einer ruhenden, hautresidenten Trypanosomen-Population die Persistenz von T. brucei in der Haut von aparasitämischen und asymptomatischen Personen erklären. Dies könnte eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer Infektion über lange Zeiträume spielen. KW - Trypanosoma brucei KW - Tissue Engineering KW - Trypanosomiasis KW - 3D-Zellkultur KW - Transkriptomanalyse KW - developmental differentiation KW - skin equivalent KW - artificial human skin KW - single-cell RNA sequencing KW - quiescence Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251147 ER -