TY - THES A1 - Rother, Tobias T1 - Die Plasmamembran-Kalzium-ATPase im Myokard T1 - The plasma membrane calcium ATPase in the myocardium N2 - Die Plasmamembran Kalzium-ATPase (PMCA) ist ein in den meisten eukaryontischen Zellen exprimiertes Enzym. Sie katalysiert den Transport von Kalziumionen aus der Zelle und besitzt gegenüber Kalzium eine hohe Affinität jedoch geringe Transportkapazität. Trotz der guten biochemischen Charakterisierung der Pumpe ist ihre Funktion in Zellen wie Kardiomyozyten, die zusätzlich über andere Kalzium-Transportsysteme wie den Natrium/Kalzium-Austauscher verfügen, weiterhin unklar. Erste Ergebnisse aus dem eigenen Labor an PMCA-überexprimierenden L6-Myoblasten zeigten einen Einfluss des Enzyms auf deren Wachstum und Differenzierung. Um diese Erkenntnisse auf den Herzmuskel zu übertragen war im Vorfeld ein transgenes Rattenmodel generiert worden, welches die hPMCA4CI unter einem myokardspezifischen Promotor überexprimierte. Dieses Modell stand für die vorliegende Arbeit zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung. Untersucht wurde zunächst das Wachstumsverhalten von Primärkulturen neonataler Kardiomyozyten unter Stimulation mit fetalem Kälberserum, Noradrenalin und dem Platelet Derived Growth Factor BB, jeweils im Vergleich zwischen transgenen und Wildtyp-Kardiomyozyten. Dabei zeigte sich ein beschleunigtes Wachstum der PMCA-überexprimierenden Zellen. In einem zweiten Ansatz wurden Untersuchungen angestellt, um die subzelluläre Lokalisation der PMCA innerhalb der Herzmuskelzelle aufzudecken. Dabei wurden im Speziellen die Caveolae als Ort der möglichen Lokalisation untersucht, kleine, ca. 50-100 nm große Einstülpungen der Plasmamembran, mit charakteristischer Lipid- und Proteinzusammensetzung, darunter auch viele Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle. Insgesamt konnte mit den Methoden der Detergenzextraktion, Doppelimmunfluoreszenz, Präparation Caveolae-reicher Membranen und Immunpräzipitation gezeigt werden, dass die PMCA zu einem großen Teil in Caveolae lokalisiert ist. Zusätzlich konnte in der Immunpräzipitation eine Interaktion der PMCA mit dem Caveolae-assoziierten Zytoskelettprotein Dystrophin dargestellt werden. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die PMCA über eine Steuerung der lokalen Kalziumkonzentration im Bereich der Caveolae modulierend in wachstumsregulierende Signaltransduktionswege von Kardiomyozyten eingreifen kann. N2 - The plasma membrane calcium ATPase (PMCA) is an enzyme expressed in most eucariotic cells. It catalyses the transport of calcium ions out of the cell and has a high calcium affinity but only a low transportation capacity. Despite the good biochemical characterization of the pump, its function remains unclear in cells like cardiomyocytes that have other calcium transporting systems like the sodium-calcium-exchanger. First results from the own laboratory examining PMCA overexpressing L6-myoblasts showed an influence of the enzyme on cellular growth and differentiation. To transfer these results to the heart muscle, a transgene rat model, overexpressing the hPMCA4CI under the control of a myocardium specific promoter, had been generated in advance. This model was now available for further characterization. First the growth pattern of primary cultures of neonatal cardiomyocytes was studied under stimulation with fetal calf serum, norepinephrine and the platelet derives growth factor BB in comparison of transgene and wildtype cardiomyocytes. These experiments showed an accelerated growth of the PMCA-overexpressing cells. Additionally to these experiments further tests were done to unravel the PMCA’s subcellular localization within the cardiomyocyte. The caveolae were especially examined as places of the potential localization, small invaginations of the plama membrane, about 50-100 nm in diameter, with a characteristic lipid and protein pattern, among them many receptors and signal transduction molecules. With the methods of detergent extraction, double immunofluorescence staining, preparation of caveolae-rich membranes and immunoprecipitation it was shown, that a high percentage of the PMCA is localized in caveolae. In addition to that an interaction of the PMCA with the caveolae associated cytoskeletal protein dystrophin could be shown. In conclusion these results indicate, that the PMCA can modulate growth regulating signal transduction pathways of cardiomyocytes by controlling the local caveolar calcium concentration. KW - Plasmamembran-Kalzium-ATPase KW - PMCA KW - Kalzium KW - Myocard KW - Caveolae KW - Wachstum KW - transgene Ratten KW - plasma membrane calcium ATPase KW - PMCA KW - calcium KW - myocardium KW - caveolae KW - growth KW - transgene rats Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-916 ER - TY - THES A1 - Hartung, Anke T1 - Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling T1 - Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Plasmamembrandomänen und deren Auswirkung auf den BMP Signalweg N2 - Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs. N2 - Endozytose von Wachstumsfaktor-Rezeptoren spielt eine entscheidende Rolle bei Aktivierung und Übertragung wie auch bei der Schwächung von Signalen. Störungen der Endozytose können schwere Krankheitsbilder hervorrufen, z.B. durch ihren Einfluss auf die Regulation der Rezeptormenge an der Zelloberfläche. BMPs sind Mitglieder der TGF-ß Superfamilie und sind involviert in die Regulation von Proliferation, Differenzierung, Chemotaxis und Apoptose. Zwei Arten von Transmembranproteinen, die Serin/Threonin-Kinase Aktivität besitzen, sind bedeutend für den BMP Signalweg – die BMP Rezeptoren BRI und BRII. Die Aktivierung von BRI und BRII erfolgt durch Ligandenbindung an präformierte Komplexe (PFCs) oder BMP2-induzierte Signalkomplexe (BISCs), die aus beiden Rezeptorarten bestehen. Wenn BMP2 an PFCs bindet, wird die Smad-Signalkaskade initiiert, wohingegen BISCs Smad-unabhängige Signale über p38 weiterleiten, was schließlich zur Produktion von alkalischer Phosphatase (ALP) führt. Das Feld der BMP Rezeptor Endozytose wurde noch nicht sehr ausführlich untersucht, genauso wenig wie die potentielle Rolle, die unterschiedliche Rezeptorlokalisierungen in verschiedenen Plasmamembran-Regionen bei der Initiierung der Signalwege, die durch PFCs bzw. BISCs aktiviert werden, spielen könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Membrandomänen sowie deren Einfluss auf die BMP Signalkaskade untersucht. Mittels Reinigung von Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus Zelllysaten und anschließender Gradientenultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass BRI und BRII mit dem caveolären Markerprotein cav-1 kofraktionieren. Darüber hinaus interagieren beide Rezeptorarten mit cav-1 und kolokalisieren auch teilweise mit cav-1 an der Plasmamembran. Obwohl diese Ergebnisse auf ein eindeutiges Vorkommen der Rezeptoren in Caveolae schließen lassen, kofraktionieren sie auch mit DRMs in Zellen, die von Natur aus keine Caveolae ausbilden, woraus man eine zusätzliche nichtcaveoläre Raft-Lokalisierung schlussfolgern kann. Des Weiteren konnte BRII mittels Immun- Elektronenmikroskopie in „clathrin-coated pits“ (CCPs) lokalisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass beide untersuchten Membranregionen die BMP Signalkaskade auf unterschiedliche Art und Weise beeinflussen. Es wurde bewiesen, dass Smad1/5 unabhängig von endozytotischen Vorgängen an der Plasmamembran phosphoryliert wird. Einerseits führte die Zerstörung von DRM-Regionen durch Cholesterindepletion zur spezifischen Inhibierung der BMP2-vermittelten ALP Produktion, ohne gleichzeitig die BMP Signalkaskade über Smads zu beeinflussen. Andererseits bewirkte eine spezifische Blockierung der Clathrin-vermittelten Endozytose eine Inhibition des BMP2-induzierten Smad-Signalwegs und auch der ALP Produktion, was auf ein Zusammenspiel von Smad-unabhängigen und Smad-abhängigen Signalwegen bei der ALP-Induzierung schließen lässt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen die Schlussfolgerung zu, dass verschiedene endozytotische Wege und Membranregionen einen bedeutenden, regulatorischen Einfluss auf die BMP Signalkaskade ausüben. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Membranlokalisierung von BMP Rezeptoren für das Einschlagen verschiedener Signalwege ausgehend von PFCs und BISCs verantwortlich ist. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Endocytose KW - BMP KW - Rezeptoren KW - Endozytose KW - Lipid Raft KW - Caveolae KW - BMP KW - receptors KW - endocytosis KW - lipid raft KW - caveolae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18360 ER -