TY - THES A1 - Grotz, Michael T1 - Synthese und Charakterisierung abiotischer Foldamere und ihrer Bausteine für die Nutzung in biologischen Systemen T1 - Synthesis and characterization of abiotic foldamers and their components for use in biological systems N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese, Charakterisierung und Untersuchung von Foldameren und ihren Untereinheiten im Rahmen des FOLDAPPI-Projekts (Foldamers against Protein-Protein Interaction). Des Weiteren wurden neuartig substituierte Chinoline dargestellt, um sie im Rahmen des SFB 630 auf ihre Hemmwirkung gegen Leishmanien und Trypanosomen zu untersuchen. Im ersten Projekt wurde ein neuartiges Monomer entwickelt, welches die Wasserlöslichkeit der Foldamere verbessern sollte. Zu diesem Zweck wurde eine zusätzliche, hoch polare Seitenkette in den Chinolingrundkörper eingeführt. Dieses modifizierte Monomer konnte erfolgreich synthetisiert werden. Um die Verbesserung der Wasserlöslichkeit gegenüber dem zuvor verwendeten Monomer zu testen, wurde erfolgreich ein Tetramer daraus aufgebaut. Das entschützte Tetramer konnte jedoch aufgrund seiner hohen Polarität nicht ausreichend gereinigt werden, um die abschließenden Löslichkeitsuntersuchungen durchzuführen. Um dieses Problem zu umgehen, wurde von der Umsetzung in Lösung auf Reaktionen an der Festphase gewechselt, was die Reinigung der Produkte wesentlich erleichtern sollte. Dabei wurde eine vom Arbeitskreis von I. Huc neu entwickelte mikrowellengestützte Methode verwendet. Das Referenzmolekül mit den bisher verwendeten Seitenketten konnte so ohne Probleme synthetisiert und seine Löslichkeit in Wasser bestimmt werden. Beim neu entwickelten Monomer kam es allerdings beim Aufbau des Tetrameres zu einer Zersetzungsreaktion, weshalb das abschließende Ziel nicht erreicht werden konnte. Im zweiten Projekt wurden zwei Ziele angestrebt: Zunächst sollte ein Weg gefunden werden, die Einführung der Seitenketten an den Chinolinen erst an der festen Phase vorzunehmen, wodurch viele Syntheseschritte bei der Vorbereitung der Monomere gespart werden könnten. Zusätzlich sollte eine neue Kupplungsreaktion entwickelt werden, wodurch der Entschützungsschritt des zu kuppelnden Amins an der Festphase eingespart werden kann. Dadurch würde vor allem bei großen Foldameren das Harz geschont und die Gefahr einer Degenerierung wesentlich verringert. Für die Kupplungsreaktion vorgesehen war ein azidfunktionalisiertes Monomer, das mittels Staudinger-Reaktion verknüpft werden sollte. Das entsprechende Monomer konnte erfolgreich synthetisiert werden. Auch das erste Ziel, die Einführung der Seitenkette an der Festphase, konnte erfolgreich durchgeführt werden. Leider war die Verwirklichung beider Ziele über die gleiche Syntheseroute nicht ohne weiteres möglich. Da das Monomer ohne die Seitenkette deutlich hydrophiler wurde, wäre eine Trocknungsmethode bei erhöhter Temperatur von Vorteil gewesen, um gebundenes Wasser vollständig zu entfernen. Da das Monomer allerdings auch eine Azidfunktion trägt und sich bei 130 °C explosionsartig zersetzt, war dies nicht möglich. Allerdings genügen bereits geringe Spuren von Feuchtigkeit, um die Staudinger-Reaktion zu beeinträchtigten. Deshalb konnte das zweite Projektziel nicht verwirklicht werden. Im dritten Projekt wurde die Herstellung einer großen Foldamer-Bibliothek für die Untersuchung der Bindungsaffinität gegenüber IL-4 angestrebt. Sie sollte aus 48 Hexameren bestehen, wobei an drei Monomeren die Seitenketten variiert werden sollten, um ein breites Spektum an verschiedenen Kombinationen von Wechselwirkungen abzudecken. Dazu wurden zunächst vier verschiedene Monomere synthetisiert, welche eine aromatisch, eine unpolare, eine anionische bzw. eine kationische Seitenkette enthielten. Für die Kupplung der Foldamere wurde eine an die Synthese von Aminosäuresequenzen angelehnte Methode entwickelt und erfolgreich angewandt. So konnten alle 48 Foldamere erfolgreich synthetisiert und 46 von ihnen in ausreichenden Mengen für die Untersuchung an IL-4 gereinigt werden. Leider liegen für diese Bibliothek bisher keine abschließenden Ergebnisse über die Inhibitionseigenschaften gegenüber IL-4 vor. Strukturell sehr ähnliche Foldamere zeigten jedoch in ersten Experimenten eine Inhibition von IL-4 was eine Wirksamkeit der neu erstellten Bibliothek vermuten lässt. Das vierte Projekt wurde im Rahmen des SFB 630 durchgeführt. Hierzu wurden einige der ursprünglich für andere Projekte hergestellten Foldamere ausgewählt, teilweise entschützt bzw. an der Nitrogruppe reduziert und anschließend auf Ihre Aktivität gegen Leishmanien und Trypanosomen getestet. Es zeigte sich, dass das verwendete Substitutionsmuster, in den gestesteten Konzentrationen nicht gegen Leishmanien und Trypanosomen wirksam ist. Es eignet sich also nicht für die Erstellung einer neuen Leitstruktur gegen diese beiden Erreger. Allerdings trat im untersuchten Konzentrationsbereich auch keine Zytotoxizität auf, was eine interessante Information für die Verwendung der Foldamere und ihrer Bausteine in biologischen Systemen darstellt. N2 - The present work deals with the synthesis, characterization and testing of foldamers and their sub-units within the FOLDAPPI-project (foldamer against protein-protein interaction). Furthermore, novel substituted quinolines were constructed to be tested in the SFB 630 for their inhibitory activity against Leishmania and Trypanosoma. Within the first project, a novel monomer was developed, in order to improve the water-solubility of the foldamers. For this purpose, an additional, highly polar side chain was introduced into the quinoline core-structure. This modified monomer was successfully synthesized. To test the improvement in water solubility compared to the previously used monomers, a tetramer was successfully constructed. However, the deprotected tetramer could not be sufficiently purified due to its high polarity; thus the final solubility studies could not be performed. In order to avoid this problem, the reaction-path was changed from reactions in solution to the solid phase, which should facilitate the purification of the products significantly. Here, a newly developed (group of I. Huc) microwave-assisted method was used. The reference molecule having the previously used side chains was synthesized without any problems and its solubility in water could be determined. The newly developed monomer, however, shows a decomposition reaction when forming the tetramere. Hence the final goal could not be achieved. In the second project, two objectives were pursued: first, it was aimed to find a method to introduce the side chains of the quinolines on solid phase, which could save many synthetic steps in the preparation of the monomers. Additionally, a new coupling reaction should be developed in order to save the deprotection-step of the amine at the coupling on solid phase. As a result, especially for large foldamers, this would substantially reduce the risk of degeneration of the resin. For this coupling-reaction the azid-funtionalized monomer should be linked via a Staudingerreaction. The corresponding monomer was successfully synthesized. Also the first goal, the introduction of the side chain on the solid phase was successfully performed. Unfortunately, the achievement of both goals on the same synthetic route was not readily available. The monomer having no side chain is much more hydrophilic, a method of drying at an elevated temperature would be beneficial, in order to remove bound water. However, since the monomer also carries an azide, it would explosively decomposes at 130 °C, so this was not possible. However, even small traces of moisture would affect the Staudinger-Reaction. Therefore, the second objective of the project could not be realized. In the third project, the preparation of a large foldamer library, for analysis of the binding affinity for IL-4 was performed. It should consist of 48 hexamers, wherein three monomers on the side chains should be varied to accommodate a wide variety of interactions. For this purpose, four different monomers were synthesized, which contained an aromatic, a polar, an anionic or a cationic sidechain. Similar to the synthesis of amino acid sequences a method has been developed and successfully applied for the coupling of the foldamers. Thus all 48 foldamers were successfully synthesized and 46 of them could be purified in sufficient quantities for the study on IL-4. However, no results on the inhibitory properties compared to IL -4 were known currently. Since structurally very similar foldamers have shown inhibition of IL -4, the newly created library is likely to be active. The fourth project was carried out within the framework of the SFB 630. Therefore some of the foldamers originally produced for other projects were selected, partially deprotected or reduced at the nitro group and then tested for their activity against Leishmania and Trypanosoma. These compounds were not effective against Leishmania and Trypanosoma which might be due to the substitution pattern of the quinolines. However, in the investigated concentration range, no cytotoxicity occurred, which is an interesting piece of information for the use of foldamers and their components in biological systems. KW - Foldamere KW - Interleukin KW - Foldamers KW - Foldamer KW - abiotische Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96486 ER - TY - THES A1 - Gjorgjevikj, Maja T1 - IL-4 analogues with site-specific chemical modification as screening tools for foldamers T1 - IL-4-Muteine mit ortsspezifische chemische Modifikation als Screening-Tools für Foldamere N2 - The cytokine Interleukin-4 (IL-4) plays a crucial role in the pathophysiology and progression of asthma and other atopic diseases. Its activities are signaled into the cells upon binding to and signaling through a shared receptor complex composed of the subunits IL-4Rα and common γc. Another cytokine, Interleukin-13 shares many functions with IL-4. This can be explained by the fact that both, IL-4 and IL-13, can signal via a shared receptor complex comprising the IL-4R and the IL-13R1 subunit. Therefore, the IL-4Rα receptor subunit has become a highly promising drug target, since it mediates IL-4 and IL-13 responses and blocking IL-4Rα will abrogate IL-4 as well as IL-13 effector functions. Currently, an IL-4 based mutein (Pitrakinra), acting as a dual IL-4/IL-13 receptor antagonist is in clinical development. This work describes the generation and production of biologically active IL-4 muteins, which contain a single additional engineered cysteine. The introduction of a free thiol group allows site-specific chemical modification. The muteins were expressed in E. coli in insoluble form, refolded and purified. The thiol group of the mutein was protected as mixed disulfide with the tripeptide glutathione. A first attempt to chemically reduce the engineered cysteine residue failed, because the three native disulfide bonds of IL-4 exhibit a similar reactivity and chemical reduction of the native disulfide resulted in full deactivation and precipitation of the IL-4 protein. Therefore, an enzymatic approach was developed which specifically reduces the mixed disulfide bonds with an attached glutathion moiety and thus leaves the native structurally essential disulfide bonds unaltered. For optimization, four different IL-4 cysteine muteins with four cysteine residues introduced at positions close to the IL-4Rα binding site were tested and their reduction rates by glutaredoxin was determined. The enzymatic reduction occured at different rates for all four muteins indicating that accessibility is an important influence and must be determined individually for each mutant protein. After optimization of the pH value and particularly the reaction time, all muteins could be prepared with the engineered thiol group being released in reasonable yield. The proteins exhibiting the free thiol group were then modified by N-ethylmaleimide (NEM) or maleimido-PEG. The effects of these modifications at different positions on binding to IL-4R were measured employing SPR biosensor technology. In the second project of this study, foldamers, which represent a new class of stable, compactly folded biomolecules and can specifically interact with proteins and nucleic acids, were examined to identify their potential as new drugs to interfere with IL-4 activities. Fragment-based drug discovery offers great promise for providing new starting points for drug discovery and facilitates the lead optimization. As foldamers equipped with a thiol-group for tethering could not to be produced; only the effect of foldamers present in a synthesized foldamer library on the binding to IL-4R could be tested. Two libraries containing different foldamers based on aromatic amide were synthesized by Michael Grotz and Dr. Michael Deligny and tested in our lab for their capability to disrupt the ligand-receptor interaction of IL-4 and its receptor IL-4Rα [ECD] using surface plasmon resonance technology. None of the studied foldamers could specifically inhibit the IL-4/IL-4Rα interaction. Some foldamers showed non-specific binding. The study presented here shows the design and production of a potentially new type of IL-4 antagonists, which employ site-specific chemical modification to exert their antagonistic function. N2 - Das Zytokin Interleukin-4 (IL-4) spielt eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Pathophysiologie von Asthma und anderen atopischen Krankheiten. Seine Aktivitäten können in die Zelle durch die Bindung an einen Rezeptorkomplex übertragen werden, welcher aus den Untereinheiten IL-4Rα und γc besteht. Interleukin-13 (IL-13), ein verwandtes Zytokin, und IL-4 besitzen viele gemeinsame Funktionen. Das kann dadurch erklärt werden, dass IL-4 wie auch IL-13 ihre Signale über einen gemeinsamen Rezeptorkomplex übertragen können, der aus der IL-4R und der IL-13R1 Untereinheit besteht. Die IL-4R Untereinheit ist ein vielversprechendes Zielmolekül für die Entwicklung von Pharmaka, da sie IL-4 und IL-13 Reaktionen vermittelt. Durch Blockieren von IL-4R werden die Aktivitäten von IL-4 sowie IL-13 unterdrückt. Ein IL-4 basiertes Doppelmutein (Pitrakinra), welches als Gegenspieler zu IL-4 und IL-13 Rezeptoren fungiert, befindet sich derzeit in der klinischen Entwicklung. In dieser Arbeit wird die Bildung und Produktion von biologisch aktiven IL-4 Muteinen mit einem einzelnen zusätzlich eingefügten Cysteinrest beschrieben. Die Einführung einer freien Thiol-Gruppe ermöglicht ortsspezifische chemische Modifizierungen. Ein „Tethering“ Ansatz sollte dann auch eine sehr schwach Bindung von thiol-reaktiven Verbindungen an IL-4 messbar machen. Die Muteine wurden in unlöslicher Form in E. coli exprimiert, zurückgefaltet und auf gereinigt. Dabei wurde die Thiolgruppe des Muteins als Disulfid mit dem Tripeptid Glutathion geschützt. Erste Versuche gezielt den eingeführten Cysteinrest selektiv chemisch zu reduzieren schlugen fehl, da die drei proteineigenen Disulfidbrücken von IL-4 eine ähnliche Reaktivität zeigten, und die Reduktion zur vollständigen Desaktivierung und Fällung des IL-4 Proteins führte. Daher wurde ein enzymatischer Ansatz entwickelt, der gezielt die Disulfidbrücke zum Glutathionrest reduziert und die proteineigenen strukturell essentiellen Disulfidbrücken unverändert lässt. Zur Optimierung wurden vier verschiedene IL-4 Cystein-Muteine mit Cysteinresten an verschiedenen Positionen nahe der IL-4Rα Bindungsstelle getestet und die Reduktionsgeschwindigkeit in Gegenwart von Glutaredoxin bestimmt. Die enzymatische Reduktion verlief für alle vier Muteine mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Dies deutet darauf hin, dass die Zugänglichkeit der Disulfidgruppe einen wichtigen Einfluss besitzt. Die Reduktionsbedingungen mussten daher für jedes Mutein neu bestimmt werden. Nach Optimierung des pH Wertes und insbesondere der Reaktionszeit konnten alle Muteine mit einer freien Thiolgruppe in angemessener Ausbeute erhalten werden. Die Proteine mit jeweils einer freien Thiolgruppe wurden daraufhin mit N-Ethylmaleinimid (NEM) oder Maleimido-PEG modifiziert. Die Effekte der Modifizierung an verschiedenen Positionen des IL-4 auf die Bindung an IL-4R wurden mit Hilfe der SPR-Spektroskopie (Oberflächen Plasmon Resonanz Spektroskopie) gemessen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion von Foldameren mit der IL-4Ra Rezeptorkette untersucht. Foldamere stellen eine neue Klasse von stabilen, kompakt gefalteten Biomolekülen dar, die möglicherweise spezifisch mit Proteinen und Nukleinsäuren wechselwirken können. Es sollten Vorversuche durchgeführt werden um zu sondieren, ob aus Foldameren Hemmstoffe für IL-4 und IL-13 entwickelt werden können. Da Foldamere mit einer Thiolgruppe zur Anbindung (Tethering) an IL-4 nicht hergestellt werden konnten, wurden zunächst nur nichtreaktive Foldamare aus einer synthetisierten Foldamer-Bibliothek getestet. Zwei Bibliotheken mit verschiedenen auf aromatischen Amiden basierenden Foldameren wurden von Michael Grotz und Dr. Michael Deligny synthetisiert und von mir mit Hilfe der SPR Spektroskopie auf ihre Fähigkeit getestet, die Ligand-Rezeptor Wechselwirkung von IL-4 und derIL-4Rα Rezeptoruntereinheit zu unterbinden. Keines der untersuchten Foldamere konnte die IL-4/IL-4Rα Wechselwirkung spezifisch hemmen. Einige Foldamere zeigten eine unspezifische Bindung. Die hier dargestellten Studien zeigen das Design und die Herstellung eines potentiell neuen Typs von Gegenspieler zu IL-4, welcher ortsspezifische chemische Modifikationen ausnutzt um seine antagonistische Funktion zu erfüllen. KW - Il 4 KW - Foldamere KW - Modifizierung KW - Foldamers KW - PEG chemical modification KW - Zutokin KW - chemische Modifizierung KW - SPR-Spektroskopie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113531 ER -