TY - THES A1 - Ryser, Christoph T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelligen marinen Riesenalgen T1 - Electro-physiological studies on giant-celled marine algae N2 - Die kombinierte Mikroperfusions-/Ladungspulstechnik an einzelligen marinen Riesenalgen ermöglicht die getrennte Darstellung der elektrischen Eigenschaften von Plasmalemma und Tonoplast durch gezielte Manipulation des vakuolären und externen Mediums. Dabei kann der für die Physiologie der Zellen wichtige hydrostatische Innendruck (Turgor) ständig kontrolliert werden. Die Applikation eines Ladungspulses resultierte bei Valonia utricularis und Ventricaria ventricosa in einer biphasischen Relaxation des Gesamt-membranpotentials, die durch die Summe zweier Exponentialfunktionen beschrieben werden konnte. Die Zeitkonstanten dieser beiden Relaxationen lagen dabei im Bereich von 0.1 ms und 1 ms (V. utricularis), bzw. 0.1 ms und 10 ms (V. ventricosa). Addition von Nystatin (einem membranimpermeablen und porenbildenden Antibiotikum) zu der vakuolären Perfusionslösung führte bei beiden Spezies zu einem Verschwinden der langsamen Relaxation des Spektrums, während über das Badmedium (extern) dotiertes Nystatin die Zeitkonstante der schnellen Komponente dramatisch verringerte. Die jeweils andere Relaxation blieb dabei unbeeinflusst. Folglich muss die schnelle Relaxation den RC-Eigenschaften des Plasmalemmas und die langsame den Eigenschaften des Tonoplasten zugeordnet werden. Dies ist ein klarer Beweis für das sog. "Zwei-Membranen Modell". In Übereinstimmung damit beeinflussten externe Ionentauschexperimente sowie externe Zugabe von Kanal/Carrier-Inhibitoren wie TEA (Tetraethylammonium), Ba2+ und DIDS (4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-Disulfonsäure), nur die schnelle Relaxation des Ladungspulsspektrums, nicht aber die langsame. Dagegen hatte die Zugabe dieser Inhibitoren zu der vakuolären Perfusionslösung keinen signifikanten Einfluss auf das Relaxationspektrum der marinen Algen. Bei der Berechnung der passiven Membranparameter fiel eine ungewöhnlich hohe flächenspezifische Kapazität des Tonoplasten auf, die nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit einer etwa 9-fachen Oberflächenvergrößerung erklärt werden konnte. Diese resultierte aus tubulären Ausstülpungen des Tonoplasten, die in das Zytosol hineinreichen. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass - entgegen der Lehrmeinung - der Widerstand des Tonoplasten mariner Algen hoch ist (0.3 bis 1.1 Ohm m²) und somit Werte aufweist, die mit Messungen an Vakuolen höherer Pflanzen vergleichbar sind. Darüber hinaus ergaben Nystatin-Experimente, dass das Zytoplasma von V. ventricosa stark negativ geladen ist (bis zu -70 mV). Neben vielen Gemeinsamkeiten existieren auch klare Unterschiede in der Physiologie dieser Algen. Während bei V. ventricosa die Plasmalemmaleitfähigkeit durch Kalium dominiert wurde, war das Plasmalemma von V. utricularis deutlich permeabler für Chlorid als für Kalium. Variation des externen pH-Wertes wirkte sich nur bei V. utricularis, nicht aber bei V. ventricosa, im Relaxationsspektrum in einer drastischen Erhöhung der schnellen Zeitkonstante aus. Für die Analyse turgorgesteuerter Membrantransportprozesse an marinen Algen bedeuten diese Arbeiten einen methodischen Durchbruch, so dass die vollständige Aufklärung der biophysikalischen Prozesse, die mit der Turgorregulation assoziiert werden, unmittelbar bevorsteht. N2 - The intergrated perfusion/charge-pulse technique allows the separated determination of the electrical properties of the tonoplast and the plasmalemma of giant-celled marine algae with exact manipulation of the vacuolar and external solution. The hydrostatic pressure in the cells (the so-called turgor-pressure), which is one of the most important parameters for the physiology of the cell, can easily be regulated during the experiments. The charge-pulse relaxation spectrum of Valonia utricularis and Ventricaria ventricosa showed a biphasic shape that could be described by the sum of two exponentials decays. The time constants of the two relaxations were calculated to be around 0.1 ms and 1 ms (V. utricularis), and 0.1 ms and 10 ms (V. ventricosa), respectively. Addition of nystatin (a membrane-impermeable and pore-forming antibiotic) to the the vacuolar perfusion-solution of both species resulted in the disappearance of the slow exponential of the spectrum, wheras the presence of nystatin in the bath decreased dramatically the time constant of the fast component. The other relaxation remained unaffected. Consequently, the fast relaxation process must be assigned to the RC-properties of the plasmalemma and the slow one to those of the tonoplast. This is a clear proof for the so-called "two-membrane model". Consistent with this, external variation of the major ions as well as external addition of channel/carrier inhibitors like TEA (tetraethyammonium), Ba2+ and DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid) affected only the fast relaxation, but not the slow one. In contrast, addition of these blockers to the vacuolar perfusion solution showed no measurable effect on the charge-pulse relaxation spectrum of the marine algae. Calculating the individual passive electrical parameters of the membranes, an unusually high area-specific capacitance of the tonoplast was detected. According to electronmicroscopic studies this could be explained by a approximately 9-fold enlargement of the tonoplast surface showing tubular "fingers" invading the cytoplasm. Above that it could be demonstrated that the area-specific resistance of the tonoplast of V. utricularis and V. ventricosa is high (0.3 to 1.1 ohm m²) and thus comparable with data observed on vacuoles of higher plants. Furthermore, the nystatin-studies indicated that the cytoplasm is negatively charged (up to -70 mV). Although they have a lot in common, the two species exhibit some clear differences in their physiology. With V. ventricosa, the conductance of the plasmalemma was dominated by K+, whereas the plasmalemma of V. utricularis was more permeable to Cl- than to K+. Variation of the external pH had a significant effect on the charge-pulse relaxation spectrum only of V. utricularis but not of V. ventricosa. The presented studies can be seen as a technical breakthrough in the analysis of turgor-regulated transport processes of marine algae. A complete elucidation of the biophysical properties which contribute to the turgorregulation can now be achieved. KW - Algen KW - Plasmamembran KW - Tonoplast KW - Elektrische Eigenschaft KW - Valonia utricularis KW - Ventricaria ventricosa KW - elektrische Messungen KW - Tonoplast KW - Plasmalemma KW - Membranbarriere KW - Turgordruck KW - vakuoläre Perfusion KW - Valonia utricularis KW - Ventricaria ventricosa KW - electrical measurements KW - tonoplast KW - plasmalemma KW - membrane barrier KW - turgor pressure Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1922 ER - TY - THES A1 - Kühlkamp, Thomas T1 - Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern T1 - The plasma membrane associated transport modifier RS1binds ubiquitin und migrates into the nucleus N2 - Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist. N2 - This work discribes investigations about the subcellular distribution and function of the plasma membrane-associated protein RS1, an regulator of plasma membrane transporters like the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 or the organic cation transporter OCT2 (Vehyl et al., 1993; Reinhardt et al., 1999; Valentin et al., 2000). The green fluorescent protein (GFP) was fused to RS1 from pig (pRS1) and expressed in LLC-PK1 cells. The GFP-pRS1 protein could be detected at the plasma membrane, in the cytoplasma and in the nucleus. Expression of various truncated forms of GFP-pRS1 showed that the N-terminal half of pRS1 (amino acids 1-328) is not necessary for the migration of pRS1 into the nucleus. In contrast, truncations of the C-terminus inhibited translocation into the nucleus. The C-terminus of pRS1 contains a conserved ubiquitin associated domain (UBA) at amino acids 579 to 616. Affinity chromatography with ubiquitin-conjungated Sepharose beads showed a noncovalent binding of pRS1 to immobilized ubiquitin, which was abolished in the presence of an excess of free ubiquitin. Further analysis schowed that the C-terminal 111 amino acids were indispensable for ubiquitin binding. A conserved di-leucine signal (pRS1 336/337) is a well known endocytosis motif and points to an involvement of pRS1 in the internalisation of plasma membrane proteins. This hypothesis was supported by the finding of an increased uptake of the intercalating membrane dye RH 414 in a pRS1-overexpressing LLC-PK1 cell line. Based on this findings together with previous data, a model for the physiological role of RS1 was proposed. In this model, RS1 serves as an adaptor which links ubiquitinated plasma membrane transporters such as SGLT1 to the endocytosis machinery. Moreover RS1 migrates into the nucleus and is involved in the transcriptional suppression of SGLT1. KW - Ubiquitin KW - Carrier-Proteine KW - Plasmamembran KW - Zellkern KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - Ubiquitin KW - Plasmamembrane KW - Zellkern KW - Endocytose KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - ubiquitin KW - plasma membrane KW - nucleus KW - endocytosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179507 ER - TY - THES A1 - Demir, Fatih T1 - Lipid rafts in Arabidopsis thaliana leaves T1 - Lipid Rafts in Arabidopsis thaliana Blättern N2 - Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling & transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 %) which remains the ”golden” standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 %). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible – almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 & Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 %) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 & 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 & CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 & 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 & 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions. N2 - Mesophyllzellen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung der Trockenstress-Antwort in der Pflanze Arabidopsis thaliana (A.th.). Um die an der Trockenstress-Antwort beteiligten Signaltransduktions- und Transportproteine zu identifizieren, die sich in Lipid Rafts der pflanzlichen Plasmamembran befinden, wurden Detergent-Resistant Membranes (DRMs) aus hochreinen Arabidopsis Plasmamembran-Präparationen isoliert. Behandlung dieser hochreinen Plasmamembran mit den Detergentien Brij-98 und Triton X-100 führte zur Identifikation von 246 DRM Proteinen, die mittels der nano HPLC-MS/MS Technologie detektiert wurden. Hierbei war festzustellen, dass das Detergens Triton X-100 eindeutig den Standard für die Isolierung von DRMs darstellt. Die große Mehrheit (78,5 %) der identifizierten DRM Proteine konnte nämlich mit Triton X-100 aufgereinigt werden. Vergleichende Anwendung verschiedener Verdaumethoden (In-Gel & In-Lösung Verdau) zeigte auf, dass jede Methode einen unterschiedlichen Pool an Proteinen identifiziert. Das Gros der analysierten Proteine (81,8 %) konnte jedoch auch alleine durch In-Gel Verdau ermittelt werden. Unter den identifizierten DRM Proteinen stellten Proteine, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, fast 1/3 dar. Diese Proteingruppe wurde hauptsächlich durch Kinasen und Phosphatasen vertreten. Insbesondere Leucin-reiche rezeptor-artige and Calcium-abhängige Proteinkinasen waren in Brij-98 & Triton X-100 DRMs zu beobachten, z.B. die Calcium-abhängige Proteinkinase CPK21. Ebenso in Triton X-100 DRMs wurde die Proteinphosphatase 2C 56 (ABI1) lokalisiert, die eine zentrale Rolle bei der ABA-vermittelten Antwort auf Trockenstress in A.th. inne hat. Zur Bestätigung der Lipid Raft Lokalisation der identifizierten DRM Proteine wurden Sterole aus der Plasmamembran mittels der Chemikalie Methyl-ß-D-cyclodextrin entfernt. Besonders Proteine, die an der Signalweiterleitung beteiligt sind, zeigten eine starke Abhängigkeit von der Präsenz der Sterole. Sie waren besonders betroffen: 41,5 % der Proteine, die nach MCD Behandlung nicht mehr in DRMs identifiziert wurden, gehörten zur Gruppe der Signaltransduktionsproteine. Beispiele waren sowohl die Calcium-abhängigen Proteinkinasen CPK10 & CPK21, als auch die Proteinphosphatase ABI1. Die A.th. Remorine AtRem 1.2 & 1.3 stellen ideale Kandidaten für pflanzliche Lipid Raft Markerproteine dar, da beide sowohl ziemlich stark in Triton X-100 DRMs vertreten, als auch im besonderen Maße auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen sind. Fluoreszenzmarkierte AtRem 1.2 & 1.3 Fusionskonstrukte lokalisierten bei transienter Expression in A.th. Blättern in kleinen, punktförmigen Strukturen an der Plasmamembran. Diese Strukturen zeigten frappierende Ähnlichkeit zu bereits bekannten Mustern von Lipid Raft Proteinen in Hefen und Säugetieren. CPK21 stellte ein besonderes Mitglied der Triton X-100 DRMs dar, welches ebenfalls stark auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen war. Dies konnte durch immunologische and massenspektrometrische Experimente nachgewiesen werden. Calcium-abhängige Proteinkinasen (CPKs) sind an der Regulierung der Trockenstress-Antwort in Pflanzen beteiligt, z.B. bei der Aktivierung von S-typ Anionenkanälen in Schließzellen von A.th. Aufgrund dieser Beteiligung an der Trockenstress-Antwort, wurden transiente Co-Expressionsstudien des Anionenkanals SLAH3, der Proteinkinase CPK21 und ihrem Gegenspieler, der Proteinphosphatase ABI1 in Nicotiana benthamiana Blättern durchgeführt. Transiente Co-Expression von CPK21 und SLAH3, einem zum schließzell-spezifischen Anionenkanal SLAC1 homologen Protein in Mesophyllzellen, resultierte in einer sterol-abhängigen Co-Lokalisation beider Proteine in DRMs. Zusätzliche Gabe vom Gegenspieler ABI1 führte zum Verschwinden von SLAH3 aus DRMs, was möglicherweise auf die Inaktivierung der Proteinkinase CPK21 durch ABI1 zurückzuführen ist. Für CPK21 konnte schon aufgezeigt werden, dass es den Anionenkanal SLAH3 durch Phosphorylierung aktiviert. ABI1 hingegen dephosphoryliert die Proteinkinase CPK21 und führt zur Deaktivierung vom Anionenkanal SLAH3, welcher dann auch nicht mehr in DRMs lokalisierbar ist. Diese streng regulierten Prozesse im Rahmen der Trockenstress-Antwort spielen sich in DRMs von A.th. Mesophyllzellen ab. Die vorliegende Arbeit ist der erste Bericht eines Lipid Raft-lokalisierten Proteinkomplexes, der Signalweiterleitung und Transportprozesse in Arabidopsis Lipid Rafts vereint. Zukünftige Lipid Raft Studien könnten sich mit der Lokalisation von putativen DRM Proteinen nach Anwendung von abiotischen und biotischen Stressfaktoren befassen. So könnte man sich die Frage stellen, inwiefern sich die Proteinzusammensetzung in DRMs von der Zugabe des pflanzlichen Hormons Abscisinsäure (ABA) beeinflussen läßt. Insbesondere quantitative Proteomstudien werden in Zukunft mit Sicherheit unser Wissen über die posttranskriptionelle Regulation der Genaktivität bei Trockenstress erweitern. KW - Ackerschmalwand KW - Abscisinsäure KW - Plasmamembran KW - Stressreaktion KW - Mesophyll KW - ABA KW - DRMs KW - Membrandomänen KW - Trockenstress KW - Anionenkanal KW - Biomembran KW - Blatt KW - Membran KW - ABA KW - DRMs KW - Membrane domains KW - Drought stress KW - Anion channel Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53223 ER - TY - THES A1 - Stange, Annette T1 - Beziehung zwischen Ca2+-Homöostase und Aktivität der S-Typ Anionenkanäle in Schließzellen T1 - Relation of Ca2+-homeostasis and activity of S-type anion channels in guard cells N2 - Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosphäre, indem sie die Öffnungsweite von Poren in der Epidermis von Blättern, sog. Stomata, verändern. Bei Wassermangel werden die stomatären Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgelöst, welches eine Aktivierung von Anionenkanälen in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkanäle ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkanäle führt, nur lückenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkanäle untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration für eine Aktivierung der Anionenkanäle ausreicht. Für diese Studien wurde hauptsächlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die Möglichkeit Anionenkanäle durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgelöst wurden und gleichzeitig die Ströme, die über die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei führte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erhöhung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration während des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zunächst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration auslöste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden Fällen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kanäle beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgelöst wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivität der Schließzellen während einer langen Depolarisation findet möglicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kanäle und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkanäle durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorgänge über die Plasmamembran wurde auch in Drüsenzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale nötig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszulösen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Drüsen nicht direkt mit Ca2+-Flüssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abhängigen Aktivierung scheinen Anionenkanäle in Drüsen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabhängigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabhängige Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abhängigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivität zeigten. Die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkanäle vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden könnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenströme waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivität gegenüber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollständige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatidsäure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollständigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatidsäure im ABA-Signalweg hinweisen könnte. N2 - Plants regulate gas exchange with the atmosphere by changing the aperture of pores in the epidermis of leaves, which are called stomata. Upon water deficiency, stomatal pores close to minimize water loss. This process is initiated by the phytohormone ABA, which induces activation of anion channels in the plasma membrane of guard cells. Even though activation of anion channels is a central element in the response to ABA, the signalling pathway, leading to the activation of anion channels, is still not understood. This work focuses on the role of signalling intermediates like protein kinases, protein phosphatases, lipid-based messengers and Ca2+ in the activation of anion channels. With regard to Ca2+, the generation of Ca2+-signals and the extent to which a rise in the cytosolic free Ca2+-concentration is sufficient for the activation of anion channels was studied. For this purpose, especially the double electrode voltage clamp (DEVC) technique was used in combination with FURA-2 based Ca2+-imaging. The ability of Ca2+ to activate anion channels was tested by evoking Ca2+-signals in guard cells of intact Nicotiana tabacum plants by either clamping the plasma membrane to hyperpolarized or depolarized voltages and simultaneously measuring plasma membrane currents. Thereby a transient elevation of the cytosolic free Ca2+-concentration directly followed the hyperpolarization, whereas depolarization initially induced lowering of the cytosolic free Ca2+-concentration, followed by a transient Ca2+-increase after returning to the holding potential. This suggests that hyperpolarization-activated Ca2+-channels are involved in both Ca2+-responses and that the threshold potential of the guard cell at which a Ca2+-signal is generated shifts to more positive values after a prolonged depolarization. Modulation of the voltage sensitivity of the guard cell during a prolonged depolarization might be due to activation of Ca2+-channels and/or inhibition of Ca2+-transport proteins by a low cytosolic free Ca2+-concentration. The transient elevation of the cytosolic free Ca2+-concentration, induced by hyperpolarization or prolonged depolarization, correlated with a transient activation of S-type anion channels. Analysis of the Ca2+-concentration and time dependence showed that S-type anion channels are activated by Ca2+ in a fast signalling pathway with a half maximal cytosolic free Ca2+-concentration of 515 nM (SE=235, n=33). The mean saturated S-type anion current was -349 pA (SE=107, n=33) at -100 mV. The effect of Ca2+ on plasma membrane transport processes was also studied in gland cells of Dionaea muscipula. In this cell type, a mechanical stimulation of trigger hairs induced a Ca2+-signal, whereby more than two action potentials were needed for a transient increase in the cytosolic free Ca2+-concentration. This data indicates that that the depolarization-phase of the action potential is not directly coupled to Ca2+-fluxes. Instead of a Ca2+-dependent activation, anion channels in glands of Dionaea muscipula thus seem to be activated by a Ca2+-independent signalling pathway. This type of activation mechanism can also be found in ABA-signalling in guard cells. There, a Ca2+-independent activation of S-type anion channels involves protein kinases like OST1 and CPK23, a process that is negatively regulated by the protein phosphatase ABI1. In this work, the redundancy between OST1 and CPK23 as well as components of the Ca2+-dependent signalling pathway could be shown in DEVC experiments with ost1-2 and cpk23-mutants of Arabidopsis thaliana, which still showed S-type anion channel activity. Furthermore, the activity of S-type anion channels in Arabidopsis thaliana mutants lacking the S-type anion channel SLAC1 indicates that redundant S-type anion channels exist, which might be activated by other protein kinases as well. ABA-induced S-type anion currents could also be measured in abi1-transformed Nicotiana tabacum plants, although these plants showed a reduced sensitivity to ABA compared to wildtype plants, suggesting an incomplete inhibition of the ABA-signalling pathway. The redundancy of intermediates in the ABA-signalling pathway could also be seen in studies with the lipid-based messenger phosphatidic acid, which only induced a slow and incomplete stomatal closure. However, this could point at a minor role for phosphatidic acid in the ABA-signalling pathway, as well. KW - Schließzelle KW - Plasmamembran KW - Schmalwand KW - Abscisinsäure KW - Venusfliegenfalle KW - Aktionspotenzial KW - S-Typ Anionenkanal KW - Ca2+-Signal KW - FURA KW - Tabak KW - S-typ anionchannel KW - Ca2+-signal KW - FURA Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52131 ER - TY - THES A1 - Blachutzik, Jörg O. T1 - Visualisierung von Plasmamembran-Domänen in Arabidopsis thaliana T1 - Visualization of plasma membrane domains in Arabidopsis thaliana N2 - Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen. N2 - In this work, membrane nanodomains have been visualized in planta via confocal microscopy of group 1b Remorin proteins fused to fluorescent proteins. Within these nanodomains, sterol-dependent Remorins originating from different plant species accumulated as shown by multiple color colocalization microscopy, and through which it was statistically verified by high Spearman and Pearson correlation coefficients. Thus, group 1b Remorins were established here as reliable marker proteins for plasma membrane (PM) nanodomains in plants. Since individual domains did not exhibit any kind of lateral movement within the plane of the membrane, a stabilization of them from cytoskeletal components as well as from components of the cell wall was presumed. Other proteins such as trans-membrane Tetraspanins and GPI-anchored proteins like SKU5 were ruled out as possible candidates being involved in the maintenance of domains´ lateral stability. For two Remorins originating from Arabidopsis thaliana, sites of posttranslational lipid modifications, which allow the proteins to anchor to the plasma membrane, were revealed. In experiments using truncated Remorins with these modification sites deleted, the mutant Remorins appeared to be no longer located at the PM but rather within the cytosol. Truncated Remorins re-appeared at the PM as soon as the full length Remorin proteins were co-expressed. In close proximity to the sites of lipid modifications a highly conserved C-terminal region, whose likely role is to facilitate homo-Remorin protein interactions, was uncovered. Therefore Remorins could possibly be involved in the molecular organization of a filamentous protein structure that could help mediate the stability and maintenance of individual domains. As well, the sizes of individual nanodomains were empirically measured in Arabidopsis thaliana mesophyll cells with STED microscopy, which allowed for optical measurements of domains with 60nm resolution, and were narrowly distributed in a histogram of domain diameters with an average diameter of 97 ± 4nm. One possible physiological role of PM-based nanodomains was demonstrated to be the ABA-mediated, calcium-dependent regulation of the SLAH3 anion channel. At the inception of the regulation, SLAH3 becomes activated upon phosphorylation by calcium-dependent protein kinases of the CDPK-family, CPK21 and CPK23. Both CPK´s in turn are regulated by the ABA-dependent phosphatases ABI1 and ABI2. As visualized by fluorescence colocalization microscopy for the first time, the interactions between SLAH3 and CPK21, as well as interactions between CPK21 and ABI1 were restricted to PM compartments. As well, these protein interactions were corroborated by also imaging them in planta using the bimolecular fluorescence complementation technique - involving group 1b Remorins as the established marker proteins for PM nanodomains. KW - Plasmamembran KW - Fluoreszmikroskopie KW - Ackerschmalwand KW - plasma membrane KW - fluorescence microscopy KW - Remorin KW - protoplasts KW - Protoplasten Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71925 ER - TY - THES A1 - Horntrich, Claudia T1 - Die Funktion von Membranlipidnanodomänen für Signaltransduktionsprozesse in Pflanzen T1 - Analysis of signalling processes in Lipid Membrane domains N2 - In vielen tierischen Zellen und in Hefe wurden Membrandomänen als Plattformen für die Etablierung von Signalkomplexen bereits gut beschrieben (Foster et al., 2003) und entsprechend ihrer Resistenz gegenüber nicht-ionischen Detergenzien charakterisiert (Shogomori et al., 2003). Die Behandlung von Membranen mit solchen Detergenzien kann zu Artefakten führen und die Anwesenheit eines Proteins in diesen so genannten „DRMs“ bedeutet noch nicht, dass es auch in nativen Membrandomänen lokalisiert ist. Allerdings muss man sich, mangels besserer Methoden zur Aufreinigung von Membrandomänen, heute noch der Methode der DRM-Aufreinigung durch Detergenzien bedienen, um eine erste Vorstellung von der Proteinzusammensetzung dieser bestimmten Membranbereiche zu erhalten. Mittels Sterolreduktion der DRMs durch die Behandlung der isolierten Membranfraktionen mit MCD und anschließender HPLC-ESI-Massenspektrometrie, konnten 80 Proteine identifiziert werden, die somit als potentiell in Membrandomänen lokalisiert gelten können. Unter diesen befanden sich die beiden Arabidopsis-Remorine AtRem1.2 und AtRem1.3, die Ca2+-abhängige Proteinkinase CPK21 und die Proteinphosphatase 2C ABI1. Dieses Phosphatase-Kinase-Paar reguliert den membranständigen, im Mesophyll exprimierten, Anionenkanal SLAH3 in ABA-abhängiger Weise (Geiger et al., 2011). Mit Hilfe biochemischer, massenspektrometrischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die Phosphatase ABI1 in Abwesenheit von ABA die Interaktion zwischen der Kinase CPK21 und dem Anionenkanal SLAH3 unterbindet. Dies geschieht indem SLAH3 und CPK21 aus den Membrandomänen in die umgebenden Membranbereiche verlagert werden und somit eine phosphorylierungsabhängige Aktivierung des Anionenkanals verhindert wird (Demir et al., 2013). Unter den in Nanodomänen lokalisiert Proteinen, konnte auch die NADPH-Oxidase AtrbohD als schwach sterolabhängig identifiziert werden. Diese zeigte im Gegensatz zu der homologen Oxidase AtrbohF, nach transienter Koexpression in Arabidopsis-Epidermiszellen zwar eine Lokalisation in distinkten Membrandomänen, aber keine Kolokalisation mit dem zuvor etablierten Membrandomänenmarker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). Dieses Ergebnis impliziert, dass es verschiedene Arten von Membrandomänen geben könnte und dass die beiden Oxidasen (zumindest zeitweise) in unterschiedlichen Membrankompartimenten lokalisiert und dadurch womöglich auch unterschiedlich reguliert sein können. Nach Koexpression der Oxidase AtrbohD mit den weiteren 12 der insgesamt 16 Arabidopsis-Remorinen, konnte eine Kolokalisation der Oxidase mit AtRem1.4 bestätigt werden. Das Remorin AtRem1.4 zeigt in weiteren Versuchen nicht nur eine deutliche Lokalisierung in anderen sterolreichen Membrandomänen als AtRem1.3, es zeigt auch eine eindeutige laterale Immobilität und kann somit als ein Marker für Membrandomänen etabliert werden. Somit bestätigt sich die Annahme, dass es auch in Pflanzen unterschiedliche Arten von Membrankompartimenten gibt. Zu diesem Zeitpunkt war noch kein, die Funktion der Oxidase regulierender Interaktionspartner von AtrbohD bekannt, um die Frage des Zusammenhangs zwischen Lokalisation und Funktion der Oxidase beantworten zu können. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Techniken (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, konnte aus einer Auswahl von fünf Mesophyll-lokalisierten und Ca2+-unabhängigen Snrk2-Kinasen, zwei potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Genau wie mit der homologen Oxidase AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), interagiert die ABA-abhängige Kinase OST1/Snrk2.6 auch mit AtrbohD. Bei dem zweiten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um Snrk2.7. Die Behandlung der transfizierten und in den Interaktionsmessungen eingesetzten Zellen mit der sterolreduzierenden Reagenz MCD resultierte in einem signifikanten Anstieg der zuvor gemessenen Interaktionseffizienzen (EFRET) aller fünf ausgewählten Snrk2-Kinasen mit AtrbohD. Eine Interaktion zwischen zwei Proteinen muss nicht zwingend bedeuten, dass sie eine funktionelle Einheit in einem Signalweg darstellen. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der identifizierten potentiellen Interaktionspartner auf die ROS-Produktionsaktivität der NADPH-Oxidase AtrbohD untersucht. Es zeigt sich, dass Snrk2.7 die ROS-Produktion durch die Oxidase auf ein vergleichbar hohes Niveau steigern kann, wie die zu diesem Zeitpunkt als Interaktionspartner der Oxidase AtrbohD identifizierte Ca2+-abhängige Kinase CPK5 (Dubiella et al., 2013). Die Kinase Snrk2.7 interagiert also nicht nur mit AtrbohD, sondern kann die Oxidase auch phosphorylieren (wahrscheinlich an einer der beiden für die Phosphorylierung von AtrbohD als essentiell beschriebenen Positionen S343 oder S347 (Nühse et al., 2007) und nicht an der untersuchten Position S39) und somit aktivieren. Dem hingegen zeigt OST1, trotz einer zuvor bestätigten Interaktion mit AtrbohD, nicht die Fähigkeit diese Oxidase auch aktivieren zu können. Die Snrk2.7-vermittelte Aktivität von AtrbohD ist ebenfalls deutlich durch eine Behandlung der transfizierten Zellen mit MCD induzierbar. Die NADPH-Oxidase AtrbohD wird also in Abhängigkeit ihrer Lokalisierung in spezifischen Membrandomänen reguliert. Wenn die zwei essentiellen Phosphorylierungsstellen durch eine Punktmutation ausgeschaltet werden und die Oxidase nicht mehr als Antwort auf Pathogene aktiviert werden kann, lokalisiert diese nicht mehr in den AtRem1.4-markierten Membrandomänen. Auch zeigt sich, dass die Aktivität der Oxidase, induziert durch eine Interaktion mit der nicht in Membrandomänen lokalisierten Snrk2-Kinase Snrk2.7, gesteigert werden kann, wenn durch MCD die sterolreichen Membrandomänen abgereichert werden. Eventuell dienen Membrandomänen, zumindest im pflanzlichen System, nicht nur der Etablierung von Signalkomplexen, sondern in einigen Fällen auch der Negativregulierung von bestimmten Proteinaktivitäten, wie zum Beispiel in diesem Fall, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N2 - In animal cells and yeast, membrane domains have been extensively characterized as signalling platforms (Foster et al., 2003) and characterized upon their resistance to treatment with non-ionic detergents (Shogomori et al., 2003). Such treatment of membranes can result in formation of artefacts and the appearance of a protein in these so-called “DRMs” is not necessarly related with its localization in native membrane domains. The lack of improved preparative methods, results in further use of DRM preparation to get a first insight into the protein composition of special membrane areas. The protein composition of isolated and MCD-treated detergent resistant membrane (DRM) fractions from purified plasma membrane of Arabidopsis thaliana was investigated by HPLC-ESI mass spectrometry. Eighty proteins could be identified which are thought to be localized in sterol rich membrane domains. Among these sterol-dependent proteins the two Remorins AtRem1.2 and AtRem1.3 and two essential ABA signalling components, namely the protein phosphatase 2C ABI1 and the kinase CPK21, could be identified. This phosphatase-kinase pair was very recently demonstrated to regulate the stomatal aperture via SLAH3-mediated anion release in an ABA-dependent manner (Geiger et al., 2011). Using biochemical, mass spectrometrical and microscopic approaches it could be shown that, in absence of ABA, the phosphatase ABI1 prevents the interaction between CPK21 and SLAH3 by dislocation of both proteins from membrane domains to surrounding membrane areas, which inhibits the phosphorylation and the activation of the channel (Demir et al., 2013). Among the potentially membrane domain localized proteins, the NADPH-oxidase AtrbohD could be identified to be weakly dependent upon a sterol rich environment. In contrast to the homologous AtrbohF, the isoform D shows no colocalization upon coexpression with the established membrane domain marker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). This result implies that there must be co-residing membrane domains and that both oxidases are (at least temporarily) located in different membrane compartments. This could imply functionally different membrane platformes to regulate specific signalling cascades. After Coexpression of AtrbohD with 12 of the altogether 16 Remorin proteins, a colocalization with AtRem1.4 could be confirmed. In further experiments not only a clear localization in other membrane domains than the ones marked by AtRem1.3, but also a clear lateral immobility could be proofed for AtRem1.4, which therefore can be accepted as a marker for another kind of membrane domains. Regarding these results, the existence of diverse Types of membrane compartments, also in plants, can be accepted. At this time point of the investigations, no interaction partner of AtrbohD was known to regulate the function of the oxidase. Therefore, the relationship between localization and function of the oxidase was still an open question. Using different microscopic techniques (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) to study protein-protein interactions, two potential interaction partners out of a set of five mesophyll expressed Ca2+-independent Snrk2-kinases, could be identified. The ABA-dependent kinase OST1/Snrk2.6, which also interacts with AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), was demonstrated to be a potential interaction partner of AtrbohD as well as Snrk2.7. The treatment of transfected cells with MCD leads to a significant induction of the measured interaction efficiencies (EFRET) of all the five analysed Snrk2-kinases with AtrbohD. An interaction between two proteins does not automatically mean a functional regulation of a signalling pathway, therefore the influence of the identified potential interacting partners of AtrbohD on the ROS-producing activity was analysed. At this time point the Ca2+-dependent kinase CPK5 was identified to be an interacting and phosphorylating partner of AtrbohD. The kinase Snrk2.7 can induce the ROS-producing activity of AtrbohD to a similar level than CPK5, which means Snrk2.7 is not only interacting with AtrbohD, but also regulating its activity. The phosphorylation and activation of AtrbohD by Snrk2.7 is probably mediated by one of the two essential phosphorylation sites S343 and S347 (Nühse et al., 2007), but not on the analysed S39. In contrast, the kinase OST1 is indeed interacting with AtrbohD, but obviously not regulating its activity. The Snrk2.7-mediated ROS-producing activity of AtrbohD is also inducible upon treatment of the transfected cells with MCD. The NADPH-oxidase AtrbohD is regulated in dependency to its localization in specific membrane domains. Mutation oft the two essential phosphorylation sites leads to a dislocation from AtRem1.4-marked membrane domains. Treatment with MCD, that means disruption of the sterol rich membrane environment, resulted in significantly increased ROS-producing activity of AtrbohD upon interaction with the non-domain located kinase Snrk2.7. Probably the membrane domains do not only function as signalling platforms in plants, but in some cases also for negative regulation of certain protein activity, such as the production of reactive oxygen species (ROS). KW - Membrandomänen KW - AtrbohD KW - ROS KW - Ackerschmalwand KW - Plasmamembran KW - Signalpeptide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107362 ER - TY - THES A1 - Schneider, Johannes T1 - Functional diversification of membrane microdomains in Bacillus subtilis T1 - Funktionale Diversifizierung von Membran-Mikrodomänen in Bacillus subtilis N2 - Eukaryotic cells are considered as evolutionary complex organisms because they possess organelles that enable them to regulate the spatio-temporal organization of cellular processes. Spatio-temporal organization of signal transduction cascades occurs in eukaryotic cells via organization of membrane-associated microdomains or lipid rafts. Lipid rafts are nanoscale-sized domains in the plasma membrane that are constituted by a specific set of lipids and proteins and harbor a number of proteins related to signal transduction and trafficking. The integrity of lipid rafts is important for the assembly and functional coordination of a plethora of signaling networks and associated processes. This integrity is partially mediated by a chaperone protein called flotillin. Disruption of lipid raft integrity, for example via depletion or overproduction of flotillin, alters raft-associated signal transduction cascades and causes severe diseases like Alzheimer’s, Parkinson’s disease or cardiovascular disease. It was traditionally assumed that a sophisticated compartmentalization of cellular processes like the one exhibited in lipid rafts was exclusive to eukaryotic cells and therefore, lipid rafts have been considered as a hallmark in the evolution of cellular complexity, suggesting that prokaryotic cells were too simple organisms to organize such sophisticated membrane platforms. However, it was recently discovered that bacteria are also able to organize Functional Membrane Microdomains (FMMs) in their cellular membrane that are able to organize and catalyze the functionality of many diverse cellular processes. These FMMs of bacterial membranes contain flotillin-like proteins which play important roles in the organization of FMM-associated cellular processes. In this dissertation I describe the structural and biological significance of the existence of two distinct flotillin proteins, FloA and FloT, in the FMMs of the bacterial model Bacillus subtilis. Localization studies, proteomic data and transcriptomic analyses show that FloA and FloT are individual scaffold proteins that activate different regulatory programs during bacterial growth. Using the tractable bacterial model system, I show that the functionality of important regulatory proteins, like the protease FtsH or the signaling kinases KinC, PhoR and ResE, is linked to the activity of FMMs and that this is a direct consequence of the scaffold activity of the bacterial flotillins. FloA and FloT distribute heterogeneously along the FMMs of B. subtilis thereby generating a heterogeneous population of FMMs that compartmentalize different signal transduction cascades. Interestingly, diversification of FMMs does not occur randomly, but rather in a controlled spatio-temporal program to ensure the activation of given signaling networks at the right place and time during cell growth. N2 - Eukaryotische Zellen werden als evolutionär komplexe Organismen betrachtet, weil sie Organellen besitzen, mit denen sie die raum-zeitliche Organisation von zellulären Prozessen steuern können. Die räumliche und zeitliche Organisation von Signalwegen in eukaryotischen Zellen erfolgt durch die Abgrenzung von membran-assoziierten Mikrodomänen oder Lipid Rafts. Lipid Rafts sind wenige Nanometer große Felder in der Plasmamembran, die aus einem spezifischen Set von Lipiden und Proteinen zusammengesetzt sind und eine Reihe von für die Signaltransduktion und den Proteintransfer erforderlichen Proteine enthalten. Die Integrität der Lipid Rafts ist wichtig um zahlreiche Signalwege und damit assoziierte Prozesse zu verbinden und funktional zu koordinieren. Diese Integrität wird zum Teil von einem Chaperon-Protein namens Flotillin vermittelt. Eine Beeinträchtigung der Integrität der Lipid Rafts, z.B. aufgrund eines Mangels an Flotillin oder einer Überproduktion von Flotillin, verändert Raft-assoziierte Signalwege und verursacht schwere Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson oder kardiovaskuläre Erkrankungen. Bislang wurde angenommen, dass eine so anspruchsvolle Kompartimentierung zellulärer Prozesse wie im Falle der Lipid Rafts ausschließlich in eukaryotischen Zellen vorkommt. Lipid Rafts galten daher als Meilenstein in der Evolution der zellulären Komplexität und prokaryotische Zellen als zu einfache Organismen, um solch komplexe Plattformen in der Membran einzurichten. Vor kurzem wurde jedoch herausgefunden, dass Bakterien ebenfalls in der Lage sind, Funktionale Mikrodomänen in der Membran (FMMs) zu formen, die viele verschiedene zelluläre Prozesse organisieren und katalysieren können. Diese FMMs in bakteriellen Membranen enthalten Flotillin-ähnliche Proteine, die wichtige Aufgaben bei der Organisation von FMM-assoziierten Prozessen übernehmen. In dieser Dissertation beschreibe ich die strukturelle und biologische Signifikanz des Vorkommens der beiden verschiedenen Flotillin-Proteine FloA und FloT in den FMMs des bakteriellen Modellorganismus Bacillus subtilis. Lokalisationsstudien, proteomische Daten und transkriptomische Analysen demonstrieren, dass FloA und FloT individuelle Gerüstproteine sind, die während des Bakterienwachstums verschiedene regulatorische Programme aktivieren. Mit Hilfe des zugänglichen bakteriellen Modellorganismus zeige ich, dass die Funktionsweise von wichtigen regulatorischen Proteinen, wie z.B. der Protease FtsH oder der Signalwegskinasen KinC, PhoR und ResE, an die Aktivität der FMMs gebunden ist, und dass dies eine direkte Folge der stützenden Tätigkeit der bakteriellen Flotilline ist. FloA und FloT sind unterschiedlich in den FMMs von B. subtilis verteilt, wodurch sie eine heterogene Population von FMMs erzeugen, die verschiedene Signalwege abgrenzen kann. Interessanterweise erfolgt die Diversifizierung der FMMs nicht zufällig, sondern durch ein räumlich und zeitlich kontrolliertes Programm, um die Aktivierung von bestimmten Signalwegen am richtigen Ort und zur richtigen Zeit während des Zellwachstums sicherzustellen. KW - Heubacillus KW - Plasmamembran KW - Diversifikation KW - FMMs KW - Bacillus subtilis KW - Flotillin KW - Lipid Rafts Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127569 ER - TY - THES A1 - Burgert, Anne T1 - Untersuchung von Sphingolipiden und anderen Membrankonjugaten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie T1 - Analysis of sphingolipids and other membrane conjugates with super-resolution fluorescence microscopy N2 - Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren. Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff. Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%. Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden. Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen. Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen. Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern. Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen. Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten. In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden. In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann. N2 - With single molecule localization microscopy (SMLM) quantification of molecules and the analysis of their distribution becomes possible. In this work various plasma membrane molecules of different eukaryotic and prokaryotic cells were imaged with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) or PALM (photoactivated localization microscopy) and quantified. To use these super-resolution fluorescence microscopy techniques and answer elaborate biological questions, potential sources of artifacts were identified and strategies to circumvent them developed. A possible source of artifacts is an insufficient number of photons emitted by fluorophores. If less photons are detected, determining the localization of one fluorophore is less precise. This can cause a wrong reconstruction of structures or might lead to false conclusions about the distribution of molecules. One possibility to increase the number of photons is to use chemical additives which quench the triplet state of fluorophores. They ensure that the fluorophores relax into the ground state allowing them to become excited again. Different additives, described in literature as triplet quenchers, were tested. The effects of these additives on the triplet state of different fluorophores (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) were analyzed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Cyclooctatetraene (COT) resulted in a decrease of triplet state yield of Al488, Al532 and Al647 by ~ 40-60%, yet the triplet state of Atto655 was unaffected. FCS measurements indicated that COT results in an increased number of emitted photons, but dSTORM measurements could not confirm this finding. Here, COT only revealed a positive effect on the intensity of Al647 (increase by ~ 60%). An explanation for this inconsistency with the FCS results might be the presence of the switching buffer in dSTORM measurements. The buffer is designed to cause a transition of the fluorophores to and stabilize the off-state by removing oxygen from the sample, counteracting the effect of COT. On addition of 5 mM potassium iodide (KI) only Al488 fluorophores showed a decreased triplet state rate (~ 80%) in FCS measurements. This finding was confirmed by dSTORM measurements with low concentrations (~ 0.5 mM) of KI which resulted in a slight intensity increase (~ 10%) of Al488. Higher KI concentration (5 mM) on the other hand showed a reversed effect, resulting in a drop in intensity by ~ 40%. Deuterium oxide (D2O) isn’t a triplet quencher but should minimize non-radiative processes. DSTORM measurements with Atto665 and Al647 revealed, that D2O does not affect the total number of emitted photons per fluorophore. Instead, D2O increased the amount of emitted photons per time. In a nutshell, these results show that dSTORM measurements with Al647 can be improved using COT, and measurements with Al488 by using very low concentrations of KI. If needed, D2O can speed up dSTORM acquisition time considerably, e.g. for life cell measurements. In addition to an insufficient number of collected photons, inappropriate photoswitching rates can induce artifacts in dSTORM measurements as well. This was shown using various biological reference structures. Especially the imaging of plasma membranes is prone to generate artifacts. Plasma membranes exhibit a lot of intrinsically three-dimensional structures with high local emitter densities. In these regions of higher fluorophore densities the likelihood of two close fluorophores emitting at the same time is increased. This in turn can result in large artificial clusters due to misinterpretation by the reconstruction software. Taken together, the performed experiments show how important it is to prove dSTORM images and minimize possibility image artifacts. Thus, raw data movies need to be examined carefully and, if necessary, measurements must be repeated with adapted imaging conditions. Since dSTORM is increasingly used for quantification and cluster analysis it is recommended to publish raw data in the Supporting information of the manuscript. Another source of artifacts when imaging molecules with SMLM is the staining procedure. Usually antibodies are used to label biological structures for dSTORM. In the interest of resolution, small antibodies or just fragments of antibodies should be used, especially if cluster analysis is performed. Otherwise reduced resolution or an increase in cross-linking of molecules might occur. In the second part of this study plasma membrane ceramides were investigated. Sphingolipid ceramides regulate various cellular processes. Different stimuli initiate activation of sphingomyelinases (SMase) which synthesize ceramides at the plasma membrane. A rise in ceramide concentration leads to a condensation of them in ceramide-rich platforms (CRPs). So far, only little is known about the distribution and the size of CRPs. Here, plasma membrane ceramides of Jurkat-, U2OS-, HBME- and primary T-cells were stained with an IgG-antibody, imaged using dSTORM and their distribution quantitatively analyzed. Independent of the analyzed cell line, ~ 50% of all ceramides detected in the plasma membrane formed CRPs with a size of ~ 75 nm. On average one CRP consisted of ~ 20 ceramide molecules. Using a titration series the possibility of artificial cluster generation due to antibody staining was ruled out. Treatment of cells with Bacillus cereus sphingomyelinase (bSMase) increased the overall ceramide concentration in the plasma membrane, the number of ceramides in the CRPs as well as the quantity and the size of CRPs. This might result in a higher solubility of membrane components in CRPs which in turn could facilitate accumulation or compartmentation of certain proteins. Accumulation of ceramides in the CRPs could also enable local interaction with other molecules and possibly change the reactivity of some receptors. To investigate plasma membrane ceramides in living cells azido-modified ceramides and copper-free click chemistry were used for labeling. Imaging was performed using confocal laser-scanning microscopy (LSM) and structured illumination microscopy. It was shown that the length of fatty acid chains and the position of the azido group of ceramide analogues play a decisive role in the magnitude of the detected signal in the plasma membrane. These results demonstrate that azido-functionalized ceramides are live-cell compatible, making them an excellent tool to follow cellular reactions. In this study, ceramides were not only analyzed in eukaryotic cells but in bacteria as well. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) are gram-negative bacteria triggering sepsis or meningitis in humans. Using both immunolabeling with anti-ceramide IgG-antibodies and azido-modified ceramides, ceramides were detected for the first time in the membrane of N. meningitidis by dSTORM. Although sphingolipids were reported to exist in various bacterial membranes, studies about ceramides in N. meningitidis have not yet been published. The results obtained here suggest the presence of ceramides in N. meningitidis. The third part of this thesis addresses the interaction between NK cells and Aspergillus fumigatus. The mold can cause invasive aspergillosis in immunocompromised patients which can lead to death. Various studies have already shown that NK cells play a crucial role in the clearance of the fungal infection. Still, the exact mechanism remains unknown. As part of this work the NK cell marker CD56 was identified as a decisive receptor in recognition of the mold. Using LSM and dSTORM measurements in combination with immunocytochemical staining an active transport of the usually homogenous distributed CD56 receptors to the interaction site of NK cells and fungus was detected. Over time CD56 proteins accumulate at these interaction sites while the signal in the rest of the membrane continuously decreases. For the first time this study was able to identify CD56 as an important recognition receptor for A. fumigatus. In the last project binding of anti-N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor encephalitis autoantibodies were investigated in neurons. Patients with this form of encephalitis generate autoantibodies against the NR1 subunit of their own postsynaptic NMDA receptors. Since NMDA receptor encephalitis is often diagnosed too late and treatment options are limited the disease often proves to be fatal. Anti-NMDA receptor encephalitis was described quite recently, explaining why the exact mechanism remains still unknown. For this study purified antibodies from anti-NMDA receptor encephalitis patients were used to stain NMDA receptor transfected HEK cells and hippocampal mouse neurons. These samples were subsequently imaged with dSTORM and analyzed. Measurements on HEK cells confirmed that the autoantibodies bind to the NR1 subunit. Using dSTORM, the binding sites of these antibodies at the neurons were imaged for the first time with super-resolution microscopy. The receptors are densely localized in synapses and more equally distributed at lower density in extrasynaptic regions. Based on Ripley’s H function synaptic clusters with a diameter of ~ 90 nm and ~ 500 localizations were determined while the extrasynaptic smaller clusters have a median diameter of ~ 70 nm and ~ 100 localizations per cluster. These first results form the basis for further investigations on the mechanism of anti-NMDA receptor encephalitis. KW - Ceramide KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - NMDA KW - Neisseria meningitidis KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - Plasmamembran Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145725 ER - TY - THES A1 - Wagner, Rabea Marie T1 - The Bacterial Exo- and Endo-Cytoskeleton Spatially Confines Functional Membrane Microdomain Dynamics in \(Bacillus\) \(subtilis\) T1 - Das bakterielle Außen- und Innenskelett begrenzt die Mobilität funktionaler Membranmikrodomänen in \(Bacillus\) \(subtilis\) räumlich N2 - Cellular membranes form a boundary to shield the inside of a cell from the outside. This is of special importance for bacteria, unicellular organisms whose membranes are in direct contact with the environment. The membrane needs to allow the reception of information about beneficial and harmful environmental conditions for the cell to evoke an appropriate response. Information gathering is mediated by proteins that need to be correctly organized in the membrane to be able to transmit information. Several principles of membrane organization are known that show a heterogeneous distribution of membrane lipids and proteins. One of them is functional membrane microdomains (FMM) which are platforms with a distinct lipid and protein composition. FMM move within the membrane and their integrity is important for several cellular processes like signal transduction, membrane trafficking and cellular differentiation. FMM harbor the marker proteins flotillins which are scaffolding proteins that act as chaperones in tethering protein cargo to FMM. This enhances the efficiency of cargo protein oligomerization or complex formation which in turn is important for their functionality. The bacterium Bacillus subtilis contains two flotillin proteins, FloA and FloT. They form different FMM assemblies which are structurally similar, but differ in the protein cargo and thus in the specific function. In this work, the mobility of FloA and FloT assemblies in the membrane was dissected using live-cell fluorescence microscopy techniques coupled to genetic, biochemical and molecular biological methods. A characteristic mobility pattern was observed which revealed that the mobility of both flotillins was spatially restricted. Restrictions were bigger for FloT resulting in a decreased diffusion coefficient compared to FloA. Flotillin mobility depends on the interplay of several factors. Firstly, the intrinsic properties of flotillins determine the binding of different protein interaction partners. These proteins directly affect the mobility of flotillins. Additionally, binding of interaction partners determines the assembly size of FloA and FloT. This indirectly affects the mobility, as the endo-cytoskeleton spatially restricts flotillin mobility in a size-dependent manner. Furthermore, the extracellular cell wall plays a dual role in flotillin mobility: its synthesis stimulates flotillin mobility, while at the same time its presence restricts flotillin mobility. As the intracellular flotillins do not have spatial access to the exo-cytoskeleton, this connection is likely mediated indirectly by their cell wall-associated protein interaction partners. Together the exo- and the endo-cytoskeleton restrict the mobility of FloA and FloT. Similar structural restrictions of flotillin mobility have been reported for plant cells as well, where the actin cytoskeleton and the cell wall restrict flotillin mobility. These similarities between eukaryotic and prokaryotic cells indicate that the restriction of flotillin mobility might be a conserved mechanism. N2 - Zelluläre Membranen bilden eine Barriere um das Zellinnere von dem -äußeren abzuschirmen. Das ist insbesondere bei Bakterien wichtig, einzellige Organismen, deren Membranen in direktem Kontakt zu ihrer Umgebung stehen. Die Membran muss es ermöglichen, Informationen über mögliche vorteilhafte oder schädliche Einflüsse in der Umgebung wahrzunehmen, damit die Zelle dementsprechend eine Reaktion initiieren kann. Die Informationsaufnahme und die resultierenden Reaktionen werden von Membranproteinen in Gang gesetzt, deren Organisation in der Membran Voraussetzung für ihre Funktionalität ist. Mehrere Prinzipien zur Membranorganisation sind bekannt, die alle eine heterogene Verteilung von Proteinen und Lipiden zu Grunde legen. Ein Beispiel für ein solches Prinzip sind funktionelle Membranmikrodomänen (FMM), Plattformen mit einer besonderen Lipid- und Proteinzusammensetzung. FMM bewegen sich in der Membran und ihre Integrität ist für viele zelluläre Prozesse wichtig, zum Beispiel für Signaltransduktion, Membrantransport oder zur zellulären Differenzierung. Flotilline sind Markerproteine für FMM. Sie bilden eine Art Gerüst und funktionieren als Chaperone, indem sie die sogenannten Frachtproteine in den FMM binden. Dort wird die Effizienz der Oligomerisierung oder Komplexbildung der Frachtproteine gesteigert, was für ihre Funktionalität und die ihrer assoziierten Prozesse von Bedeutung ist. In dem Bakterium Bacillus subtilis gibt es zwei Flotilline, FloA und FloT. Diese formen FMM Plattformen, die zwar strukturell ähnlich sind, sich aber in ihren Frachtproteinen und somit auch in ihren spezifischen Funktionen unterscheiden. In dieser Arbeit wurde die Mobilität der FloA- und FloT-abhängigen Plattformen in der Membran untersucht. Dafür wurden Technologien der Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen, biochemischen und molekularbiologischen Ansätzen kombiniert. Charakteristische Bewegungsmuster wurden beobachtet, die zeigten, dass die Beweglichkeit beider Flotilline räumlich begrenzt war. Dabei war die Einschränkung für FloT größer, und dementsprechend der Diffusionskoeffizient kleiner verglichen mit FloA. Die Mobilität von FloA und FloT hängt von dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren ab. Zum einen bestimmen intrinsische Eigenschaften der Flotillinproteine ihre Fähigkeit verschiedene Interaktionspartner zu binden. Diese wirken sich dann direkt auf die Mobilität von Flotillinen aus. Des Weiteren bestimmt die Bindung verschiedener Interaktionspartner auch die Größe der FloA- und FloT- abhängigen Plattformen. Die resultierenden Größen beeinflussen die Mobilität indirekt, da das zelluläre Innenskelett die Flotillinmobilität räumlich in größenabhängiger Weise begrenzt. Außerdem spielt das Außenskelett der Zelle, die Zellwand, eine zweifache Rolle: die Zellwandsynthese fördert die Mobilität der Flotilline, während die Zellwand an sich gleichzeitig die Mobilität der Flotilline einschränkt. Da Flotilline räumlich keine Verbindung zum Außenskelett haben, wird diese Verbindung wahrscheinlich durch ihre Zellwand-assoziierten Interaktionspartner übermittelt. Zusammenfassend beschränken das Außen- und das Innenskelett die Mobilität von FloA und FloT. In Pflanzen wurden ähnliche strukturelle Beschränkungen der Mobilität von Flotillinen durch das Aktin- Zytoskelett und die Zellwand beschrieben. Diese Ähnlichkeit zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen deutet darauf hin, dass die Beschränkung der Mobilität der Flotillin-Plattformen ein konservierter Mechanismus sein könnte. KW - Heubacillus KW - Bakterienzellwand KW - Plasmamembran KW - Zellskelett KW - Bacillus subtilis KW - functional membrane microdomains KW - membrane dynamics KW - bacterial lipid rafts KW - cytoskeleton KW - cell wall Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217458 ER -