TY - THES A1 - Bundschu, Karin T1 - Generation and characterization of spred-2 knockout mice T1 - Generierung und Charakterisierung von Spred-2 Knockout Mäusen N2 - Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable. N2 - Spreds gehören zu einer neuen Sprouty-verwandten Familie Membran-assoziierter Proteine, welche den MAPK Signalweg hemmen, indem sie mit Ras und Raf-1 interagieren. In Zellkultur-Systemen haben mehrere Studien bereits die hemmende Funktion von Spred gezeigt, aber die in vivo Funktion im Gesamtorganismus blieb bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurden deshalb Spred-2 Knockout Mäuse mithilfe eines Gene-trap Ansatzes generiert. Die Spred-2 Eliminierung konnte auf RNA- und Protein-Ebene bestätigt werden, und der Verlust des funktionsfähigen Spred-2 Proteins führte zu einem Achondroplasie-ähnlichen Zwergenwuchs, der häufigsten Form des menschlichen Zwergenwuchses. Die Spred-2-/- Mäuse waren insgesamt kleiner und hatten ein vermindertes Körpergewicht. Im Vergleich zu Wildtyp Mäusen war die Tibia-Länge verkürzt und die Wachstumsfugen verschmälert. In Knorpelzellen wurde sowohl die Aktivität des Spred-2 Promoters, als auch eine Spred-2 Proteinexpression detektiert, was auf eine wichtige Funktion in Knorpelzellen und bei der Knochenentwicklung schließen lässt. Im Vergleich zu Spred-2+/+ Knorpelzellen zeigte die Stimulierung von Spred-2-/- Knorpelzellen mit verschiedenen FGF-Konzentrationen eine frühere und verstärkte ERK-Phosphorylierung. Diese Beobachtungen deuten auf einen Mechanismus hin, bei dem der Verlust von Spred-2 das Knochenwachstum hemmt, indem die Knorpel-Differenzierung durch eine Hochregulation des MAPK Signalweges gehemmt wird. Spred-2-/- Mäuse zeigten nach Verletzungen eine erhöhte Blutungsneigung, wobei das verlorene Blutvolumen extrem vergrößert und die Blutungszeit signifikant verlängert war. Bislang konnte Bluthochdruck als Ursache ausgeschlossen werden, aber die verschiedenen Stufen der Blutstillung und Gerinnungskaskade müssen noch weiter untersucht werden, um die physiologischen Ursachen dieses Phänotyps ausfindig machen zu können. Untersuchungen der Spred-2 Promotoraktivität zeigten eine starke und spezifische Expression von Spred-2 in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigten vorhergehende Studien eine Interaktion von Spreds mit RhoA, einem Hauptregulator der Kontraktion glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Beobachtungen zufolge scheint die Regulation der Kontraktilität glatter Gefäßmuskelzellen ein guter Kandidat für dieses Phänomen zu sein. Weiterhin wurden Spred-1 und Spred-2 spezifische Antikörper hergestellt, die als elementares Werkzeug zur Untersuchung der Proteinexpression in der Maus notwendig waren. Bisher gab es noch keine Informationen über die Region und Regulation des Spred-2 Promotors. In dieser Arbeit wurde eine detaillierte in situ Analyse des physiologischen Promotoraktivitätsprofils in der Spred-2 defizienten Mauslinie gezeigt, die mit Hilfe des Gene-trap Vektors generiert wurde. In diesen Mäusen wurde das beta-Galaktosidase/Neomycin-Resistenz Fusionsgen (β-geo) des Gene-trap Vektors unter die Kontrolle des endogenen Spred-2 Promotors gebracht, und lieferte damit die Möglichkeit, die Spred-2 Promotoraktivität in praktisch jedem Organ und den zugehörigen Teilstrukturen beobachten zu können. X-Gal Färbungen von Gewebeschnitten neugeborener und erwachsener Mäuse zeigten 1) eine sehr starke Spred-2 Promotoraktivität in Nervengeweben und verschiedenen Drüsen; 2) eine starke Aktivität in glatten Muskelzellen des Uterus und Verdauungstraktes, sowie der Nieren; 3) eine geringe Aktivität in Herz, Hoden, Lunge und Leber; 4) eine fast fehlende Aktivität in Skelettmuskeln und Milz; und 5) interessanterweise eine starke und eindeutige Aktivität in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem zeigte der Vergleich zwischen Organen von neugeborenen und erwachsenen Mäusen ein fast identisches Aktivitätsmuster. Diese detaillierten Daten liefern hilfreiche Informationen für weitere Untersuchungen der physiologischen Funktionen von Spred-2 vor allem in Organen mit starker Spred-2 Promotoraktivität, die in den meisten dieser Organe bisher noch immer ungeklärt sind. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch Gene-targeting Vektoren für Spred-1 und Spred-2 kloniert, die zur Generierung von embryonalen Stammzellen mit gefloxtem Exon 2 des Spred-1 bzw. Spred-2 Gens genutzt wurden. Diese embryonalen Stammzellen stehen nun als wertvolle Grundlage zur Etablierung von konditionalen Knockout Mäusen zur Verfügung. Dies ist von großem Interesse, um die physiologischen gewebespezifischen Funktionen von Spred-1 und Spred-2 zu untersuchen, vor allem wenn die Doppel-Knockout Mäuse nicht lebensfähig sein sollten. KW - Spred Protein KW - Knockout KW - Maus KW - Spred KW - Knockout Mäuse KW - Zwergenwuchs KW - EVH-1 KW - MAP Kinase KW - Spred KW - knockout mice KW - dwarfism KW - EVH-1 KW - MAP kinase Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14333 ER - TY - THES A1 - Danzer, Claus-Peter T1 - Generierung von chimären Mäusen mit Mutationen in der Signalleitungs-Domäne von CD22 und Untersuchungen zur Funktion von CD22 in Knockout-Mäusen T1 - Generation of Chimaeric mice with mutations in the signaling domain of CD22 and analysis of the function of CD22 in knockout mice N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialinsäure-bindende Immunglobulin-ähnliche Lectine). Mit der äußersten der 7 extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialinsäure interagieren. In der cytoplasmatischen Domäne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungeklärt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerstörte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Domäne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren für CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. Für beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingeführten Mutationen vollständig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chimäre Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank ermöglichte die Verlängerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch öffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Veränderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerstörten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalität des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig für die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialinsäure auf der selben Zelloberfläche (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellulären Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialinsäure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-Mäusen, aber nur ca. 4,5% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- Mäusen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialinsäure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zurückzuführen. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In Übereinstimmung damit führte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abhängiger Demaskierung. 4. FACS-Färbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- Mäusen um ca. 70-80% gegenüber wt-Mäusen verkleinert ist. In Bestätigung früherer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabhängige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- Mäusen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant stärker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- Mäusen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zurückzuführen ist. N2 - Aim of this thesis was to investigate aspects of the function of CD22, a B-cell specific member of the Siglec-family (sialic acid binding immunoglobulin–like lectins). CD22 can specifically bind a2,6-sialic acid with the outermost of its 7 extracellular Ig-domains. There are 6 conserved tyrosine residues in the cytoplasmic domain, 3 of which lie within ITIMs (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs). Following BCR engagement, CD22 becomes tyrosine-phosphorylated. Consecutively, the cytosolic tyrosin-phosphatase SHP-1 binds to the phosphorylated ITIMs, becomes activated and inhibits the BCR-signal. There are also some positive modulators of the BCR-signal which bind to CD22 (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2). The role of these molecules in the context of CD22 remains to be elucidated. 1. One main goal of this work was the generation of two new knockin mouse lines. In the first line (CD22-ITIM-KO), the ITIMs of CD22 were to be destroyed. A second line in which CD22 lacks its cytoplasmic tail was to be generated (CD22-Tailless). Both models were supposed to serve the in vivo investigation of the role of the positive modulators of the BCR-signal and the interrelation of CD22 signaling and ligand binding. Cloning of the targeting vectors pCD22-ITIM-KO and pCD22-tailless was completed. Using control vectors, which were also cloned, screening-PCRs for the identification of homologous recombined ES-cell clones were established. C57BL/6 ES-cells were transfected with the targeting constructs, and homologous recombinants were identified with PCR and Southern blot. The introduced mutations were confirmed by sequencing. Following cre/lox-mediated deletion of the selection cassette, fully characterised CD22-ITIM-KO clones were injected into BALB/c-blastocysts. Five chimaeras were obtained, none of which transmitted the mutations through the germline. No homologous recombinants were obtained upon injection of the C57BL/6 targeting constructs into other, non-isogenic ES-cell lines. Finding of the genomic sequence of murine CD22 in a database made it possible to extend pCD22-ITIM-KO by 4 kb with DNA from a 129/ola mouse strain. The new construct was used to transfect 129/ola ES-cells, which are generally known to be kariotypically more stable than C57BL/6 ES-cells. No homologous recombinants were obtained. The now known sequence of the CD22 gene will make it possible to reconstruct pCD22-ITIM-KO based on 129-DNA or to modify and improve the already existing C57BL/6-constructs. 2. To investigate the consequences of the destroyed ITIMs on tyrosine-phosphorylation and SHP-1 association of CD22 in vitro, a CD22-ITIM-KO expression-vector was constructed and sialyl-transferase/CD22-ITIM-KO double-transfectants of the murine plasmocytoma-line J558L were generated. CD22 tyrosine-phosphorylation after BCR-stimulation was completely abolished in CD22-ITIM-KO transfectants. Accordingly, SHP-1 couldnt associate with CD22-ITIM-KO. The results prove the funcionality of the CD22-ITIM-KO construct with respect to ITIM-phosphorylation and binding of SHP-1. Furthermore the results show that the ITIM-tyrosines are also important for the phosphorylation of the non-ITIM-tyrosines. 3. Interaction of CD22 with its ligand a2,6-sialic acid on the surface of the same cell (in cis) plays an important role in cell-cell-interaction and intracellular signal transduction. In this work B-cells on which the ligand binding site of CD22 is not occupied by endogenous a2,6-sialic acid (demasked CD22) were identified by FACS for the first time. 10,5% of all B220+ spleen cells from wild type mice, in contrast to only 4,5% B220+ spleen cells from CD22-/- mice were able to bind exogenous a2,6-sialic acid. This effect is mainly due to the presence or absence of CD22, respectively. Detailed FACS-analyses revealed that cells with demasked CD22 are enriched in the fraction of the transitional B-cells type 2 (T2 cells) and show signs of activation. Accordingly, in vitro activation of B-cells with LPS or IL4 resulted in CD22-dependent demasking. 4. FACS-analyses showed that the marginal zone (MZ) B-cell compartment in CD22-/- mice is strongly reduced (by about 70-80%). Earlier results showing that the immune response against i.p.-injected TI2-antigens is about 2-fold reduced in CD22-/- mice could be confirmed. However, the response was significantly more impaired (3-4-fold) when the same dose of antigen was applied i.v., a situation where preferentially the MZ B-cells of the spleen come in contact with antigen carried along with the blood flow. The known deficiency in TI2-responses in CD22-/- mice is likely due to non-sufficient MZ B-cell numbers in these animals. KW - B-Lymphozyt KW - Signaltransduktion KW - Knockout KW - Antigen CD22 KW - B-Zellen KW - Signaltransduktion KW - Knockout Mäuse KW - CD22 KW - B-Cells KW - Signaltransduction KW - Knockout Mice KW - CD22 Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4966 ER -