TY - THES A1 - Held, Helena T1 - The effectiveness of non-occlusal therapies in relation to the chronicity of temporomandibular disorders: a systematic review with meta-analysis T1 - Die Effektivität von nicht-okklusalen Therapien in Bezug auf die Chronifizierung von Craniomandibulärer Dysfunktionen: eine Systematische Übersichtsarbeit mit Metaanalyse N2 - Background: That a differentiated treatment of subjects with low and high levels of disabling pain might be necessarily has only been suspected but not sufficiently confirmed so far. Furthermore, the effectiveness of extraoral therapy methods for TMD is still controversial in the literature. The present work could make an important contribution to this. Objectives: Five systematic reviews with meta-analysis were conducted to investigate the efficacy of extraoral therapies (acupuncture, laser, medication, psychosocial interventions, and physiotherapy) in the treatment of TMD in relation to the degree of chronicity of pain. Literature sources: With this objective, the databases Pubmed/MEDLINE, EMBASE, Cochrane Library, Livivo, OpenGrey, drks.de, Clinicaltrials.gov. were searched. Criteria for the selection of suitable studies: Adults suffering from painful TMD and treated with either acupuncture, laser, medication, psychosocial interventions, or physiotherapy. The studies were then examined for evidence in the subjects' characteristics suggesting that they were suffering from chronic TMD in terms of pain dysfunction. These included a high score on the GCPS, resistance to undergone treatments, multilocular pain, depression, and regular use of pain medication. The effectiveness of the five interventions was then differentiated according to the suspected degree of chronicity. Effectiveness was assessed by the following outcomes: patient- related current pain intensity, MMO, pain on palpation, temporomandibular joint sounds, depression, and somatization. Study evaluation: After the assessment of the studies, the quality assessment (Risk of Bias Tool of the Cochrane Institute) and the extraction of the data were conducted. After that five meta-analyses were carried out for each of the five interventions using the Review Manager of the Cochrane Institute (RevMan 5.3) Results: Acupuncture and dry needling were statistically significantly more effective in providing short-term pain relief compared to the control group in patients with low disability pain (p=0.04) and (p=0.02), respectively. Acupuncture or dry needling did not show a significant result in the improvement of MMO in the short-term period. Laser therapy is more effective in relieving pain (p<0.0001) and functional outcomes (p=0.03) in the short term compared to placebo for low disability pain. Botulinum toxin (p=0.003) and NSAIDs (p=0.03) showed significantly better short-term improvement in pain intensity for high disability pain. Low disability pain is significantly better treated by psychosocial interventions than by other treatments in terms of long-term pain relief (more than 12 months) (p=0.02). Patients with high disability pain had significantly lower depression scores after psychosocial interventions than after other treatments (p=0.008). Physiotherapy showed a statistically significant short-term analgesic effect in patients with high disability pain compared to placebo (p=0.04). Manual Therapy (MT) showed a statistically significant short-term analgesic effect in high disability pain compared to the control group (p=0.01). Patients with low disability pain showed a statistically significant short-term pain-relieving effect with the single intervention of MT in combination with exercise compared to the control groups (p=0.003). A statistically significant result in the improvement of MMO was found in the short-term period in low disability pain for the single interventions of physiotherapy (p=0.008) and physiotherapy in combination with another treatment compared to other treatments (p=0.03), MT compared to the control group (p=0.03) and physiotherapy compared to splint therapy (p=0.03). Clinical conclusion: Individual interventions of the five extraoral therapies confirm the hypothesis that painful TMDs respond differently to established therapies depending on the degree of chronic pain-related disability and that the prognosis of therapy is significantly influenced by the degree of chronic pain- related disability of the condition, according to the GCPS. Registration number of the review at PROSPERO: CRD42020202558 Keywords: meta-analysis, systematic review, temporomandibular disorders, extra oral therapy, acupuncture, laser, medication, psychosocial interventions, physiotherapy, low disability, high disability, pain, chronification N2 - Hintergrund: Das eine differenzierte Behandlung von Probanden mit funktionalem (fS) und dysfunktionalem Schmerz (dS) notwendig sein könnte, wurde bisher nur vermutet, aber nicht ausreichend bestätigt. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit extraoraler Therapiemethoden bei CMD in der Literatur noch umstritten. Die vorliegende Arbeit könnte hierzu einen wichtigen Beitrag leisten. Ziele: Fünf systematische Übersichten mit Metaanalyse wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit extraoraler Therapien (Akupunktur, Laser, Medikamente, psychosoziale Interventionen und Physiotherapie) bei der Behandlung von einer schmerzhaften CMD in Abhängigkeit von dem Chronifizierungsgrad zu untersuchen. Literaturquellen: Die Datenbanken Pubmed/MEDLINE, EMBASE, Cochrane Library, Livivo, OpenGrey, drks.de und Clinicaltrials.gov wurden durchsucht. Auswahlkriterien: Erwachsene PatientInnen, die an schmerzhaften CMD leiden und entweder mit Akupunktur, Laser, Medikamenten, psychosoziale Interventionen oder Physiotherapie behandelt wurden. Die Studien wurden dann auf Hinweise in den Probandenmerkmalen untersucht, die darauf schließen lassen, dass die ProbandInnen unter chronischer CMD im Sinne einer Schmerzdysfunktion leiden. Dazu gehörten ein hoher Wert im GCPS, Behandlungen, die die Probanden bereits erfolglos durchgeführt hatten, multilokuläre Schmerzen, Depressionen und regelmäßige Einnahme von Schmerzmitteln. Anschließend wurde die Wirksamkeit der fünf Interventionen nach dem vermuteten Grad der Chronifizierung differenziert. Die Wirksamkeit wurde anhand der folgenden Ergebnisse untersucht: patientenbezogene aktuelle Schmerzintensität, MMO, Schmerz bei Palpation, Kiefergelenkgeräusche, Depression und Somatisierung. Studienbewertung: Nach der Bewertung der Studien, der Qualitätsbeurteilung (Risk of Bias Tool des Cochrane-Instituts) und der Extraktion der Daten wurden für jede der fünf Interventionen fünf Meta-Analysen mit dem Review Manager des Cochrane-Instituts (RevMan 5.3) durchgeführt Ergebnisse: Akupunktur und Dry Needling waren statistisch signifikant wirksamer bei der kurzfristigen Schmerzlinderung im Vergleich zur Kontrollgruppe bei Patienten mit geringem Grad an beeinträchtigendem Schmerz (p=0,04) bzw. (p=0,02). Akupunktur oder Dry-Needling zeigten im kurzfristigen Zeitraum kein statistisch signifikantes Ergebnis in der Verbesserung der Kieferöffnung. Die Lasertherapie ist im Vergleich zu Placebo bei funktionalem Schmerz kurzfristig wirksamer bei der Reduktion der Schmerzintensität (p<0,0001) und funktionellen Ergebnissen (p=0,03). Botulinumtoxin (p=0,003) und NSARs (p=0,03) zeigten eine signifikant bessere kurzfristige Verbesserung der Schmerzintensität bei dS. FS werden durch die psychosozialen Interventionen signifikant besser behandelt als durch andere Behandlungen, was die langfristige Schmerzlinderung (mehr als 12 Monate) betrifft (p=0,02). PatientInnen mit dS wiesen nach psychosozialen Interventionen signifikant niedrigere Depressionswerte auf als nach anderen Behandlungen (p=0.008). Physiotherapie zeigte eine statistisch signifikante kurzfristige schmerzlindernde Wirkung bei PatientInnen mit dS im Vergleich zu Placebo (p=0,04). Manuelle Therapie (MT) zeigte eine statistisch signifikante kurzfristige schmerzlindernde Wirkung bei dS im Vergleich zur Kontrollgruppe (p=0,01). Bei PatientInnen mit fS zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine statistisch signifikante kurzfristige schmerzlindernde Wirkung bei der Einzelintervention von MT in Kombination mit Bewegung (p=0,003). Ein statistisch signifikantes Ergebnis bei der Verbesserung der MMO wurde im Kurzzeitzeitraum bei fS für die Einzelinterventionen der Physiotherapie (p=0,008) und der Physiotherapie in Kombination mit einer anderen Behandlung im Vergleich zu anderen Behandlungen (p=0,03), der MT im Vergleich zur Kontrollgruppe (p=0,03) und der Physiotherapie im Vergleich zur Schienentherapie festgestellt (p=0,03). Schlussfolgerung: Einzelne Interventionen der fünf extraoralen Therapien bestätigen die Hypothese, dass schmerzhafte CMD je nach Grad der Schmerz Chronifizierung unterschiedlich auf etablierte Therapien ansprechen und dass die Prognose der Therapie signifikant durch den Grad der Chronifizierung der Erkrankung beeinflusst wird. Registrierungsnummer der Review bei PROSPERO: CRD42020202558. KW - Metaanalyse KW - Gesichtsschmerz KW - Lasertherapie KW - Akupunktur KW - systematic review KW - TMD KW - chronic pain KW - extraoral intervention Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347990 N1 - Appendix VII bis X fehlen in der gedr. Ausgabe ER - TY - THES A1 - Scherz, Jan T1 - Weak Solutions to Mathematical Models of the Interaction between Fluids, Solids and Electromagnetic Fields T1 - Schwache Lösungen für mathematische Modelle der Wechselwirkung zwischen Flüssigkeiten, Festkörpern und elektromagnetischen Feldern N2 - We analyze the mathematical models of two classes of physical phenomena. The first class of phenomena we consider is the interaction between one or more insulating rigid bodies and an electrically conducting fluid, inside of which the bodies are contained, as well as the electromagnetic fields trespassing both of the materials. We take into account both the cases of incompressible and compressible fluids. In both cases our main result yields the existence of weak solutions to the associated system of partial differential equations, respectively. The proofs of these results are built upon hybrid discrete-continuous approximation schemes: Parts of the systems are discretized with respect to time in order to deal with the solution-dependent test functions in the induction equation. The remaining parts are treated as continuous equations on the small intervals between consecutive discrete time points, allowing us to employ techniques which do not transfer to the discretized setting. Moreover, the solution-dependent test functions in the momentum equation are handled via the use of classical penalization methods. The second class of phenomena we consider is the evolution of a magnetoelastic material. Here too, our main result proves the existence of weak solutions to the corresponding system of partial differential equations. Its proof is based on De Giorgi's minimizing movements method, in which the system is discretized in time and, at each discrete time point, a minimization problem is solved, the associated Euler-Lagrange equations of which constitute a suitable approximation of the original equation of motion and magnetic force balance. The construction of such a minimization problem is made possible by the realization that, already on the continuous level, both of these equations can be written in terms of the same energy and dissipation potentials. The functional for the discrete minimization problem can then be constructed on the basis of these potentials. N2 - Wir analysieren die mathematischen Modelle von zwei Arten physikalischer Phänomene. Die erste Art von Phänomenen, die wir betrachten, ist die Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren isolierenden starren Körpern und einem elektrisch leitenden Fluid, das die Körper umgibt, sowie den elektromagnetischen Feldern in beiden Materialien. Wir untersuchen sowohl den Fall inkompressibler als auch kompressibler Fluide. In beiden Fällen liefert unser Hauptresultat die Existenz von schwachen Lösungen für das zugehörige System partieller Differentialgleichungen. Die Beweise dieser Resultate beruhen auf hybriden diskret-kontinuierlichen Approximationsmethoden: Teile der Systeme werden in der Zeit diskretisiert, um das Problem der lösungsabhängigen Testfunktionen in der Induktionsgleichung zu bewältigen. Die verbleibenden Gleichungen werden als kontinuierliche Gleichungen auf den kleinen Intervallen zwischen aufeinanderfolgenden diskreten Zeitpunkten behandelt, sodass wir Techniken anwenden können, die sich nicht auf das diskretisierte System übertragen lassen. Darüber hinaus wird das Problem der lösungsabhängigen Testfunktionen in der Impulsgleichung durch die Verwendung klassischer Penalisierungsmethoden gelöst. Die zweite Art von Phänomenen, die wir betrachten, ist die Entwicklung eines magnetoelastischen Materials. Auch hier beweist unser Hauptresultat die Existenz schwacher Lösungen für das zugehörige System partieller Differentialgleichungen. Der Beweis basiert auf der Methode von De Giorgi, bei der das System in der Zeit diskretisiert und in jedem diskreten Zeitpunkt ein Minimierungsproblem gelöst wird, dessen zugehörige Euler-Lagrange-Gleichungen eine geeignete Approximation an die ursprüngliche Bewegungsgleichung und mikromagnetische Gleichung darstellen. Die Konstruktion eines solchen Minimierungsproblems wird durch die Erkenntnis ermöglicht, dass diese beiden Gleichungen bereits im kontinuierlichen System mithilfe derselben Energie- und Dissipationspotenziale ausgedrückt werden können. Das Funktional für das diskrete Minimierungsproblem kann dann auf Grundlage dieser Potenziale konstruiert werden. KW - Fluid-Struktur-Wechselwirkung KW - Magnetoelastizität KW - Magnetohydrodynamik KW - Navier-Stokes-Gleichung KW - Zeitdiskrete Approximation KW - Fluid-structure interaction KW - Magnetoelasticity KW - Magnetohydrodynamics KW - Minimizing movements KW - Navier-Stokes equations KW - Rothe method Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349205 ER - TY - THES A1 - Behne, Robert Stefan Friedrich T1 - Development Of A Human iPSC-Derived Cortical Neuron Model Of Adaptor- Protein-Complex-4-Deficiency T1 - Entwicklung eines humanen iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronenmodells der Adaptor-Protein-Komplex-4-Defizienz N2 - Adaptor-protein-4-deficiency (AP-4-deficiency) is an autosomal-recessive childhood- onset form of complicated hereditary spastic paraplegia (HSP) caused by bi-allelic loss- of-function mutations in one of the four subunits of the AP-4-complex. These four conditions are named SPG47 (AP4B1, OMIM #614066), SPG50 (AP4M1, OMIM #612936), SPG51 (AP4E1, OMIM #613744) and SPG52 (AP4S1, OMIM #614067), respectively and all present with global developmental delay, progressive spasticity and seizures. Imaging features include a thinning of the corpus callosum, ventriculomegaly and white matter changes. AP-4 is a highly conserved heterotetrameric complex, which is responsible for polarized sorting of transmembrane cargo including the autophagy- related protein 9 A (ATG9A). Loss of any of the four subunits leads to an instable complex and defective sorting of AP-4-cargo. ATG9A is implicated in autophagosome formation and neurite outgrowth. It is missorted in AP-4-deficient cells and CNS-specific knockout of Atg9a in mice results in a phenotype reminiscent of AP-4-deficiency. However, the AP-4-related cellular phenotypes including ATG9A missorting have not been investigated in human neurons. Thus, the aim of this study is to provide the first human induced pluripotent stem cell- derived (iPSC) cortical neuron model of AP-4-deficiency to explore AP-4-related phenotypes in preparation for a high-content screening. Under the hypothesis that AP-4- deficiency leads to ATG9A missorting, elevated ATG9A levels, impaired autophagy and neurite outgrowth in human iPSC-derived cortical neurons, in vitro biochemical and imaging assays including automated high-content imaging and analysis were applied. First, these phenotypes were investigated in fibroblasts from three patients with compound heterozygous mutations in the AP4B1 gene and their sex-matched parental controls. The same cell lines were used to generate iPSCs and differentiate them into human excitatory cortical neurons. This work shows that ATG9A is accumulating in the trans-Golgi-network in AP-4- deficient human fibroblasts and that ATG9A levels are increased compared to parental controls and wild type cells suggesting a compensatory mechanism. Protein levels of the AP4E1-subunit were used as a surrogate marker for the AP-4-complex and were decreased in AP-4-deficient fibroblasts with co-immunoprecipitation confirming the instability of the complex. Lentiviral re-expression of the AP4B1-subunit rescues this corroborating the fact that a stable AP-4-complex is needed for ATG9A trafficking. Surprisingly, autophagic flux was present in AP-4-deficient fibroblasts under nutrient- rich and starvation conditions. These phenotypic markers were evaluated in iPSC-derived cortical neurons and here, a robust accumulation of ATG9A in the juxtanuclear area was seen together with elevated ATG9A protein levels. Strikingly, assessment of autophagy markers under nutrient-rich conditions showed alterations in AP-4-deficient iPSC- derived cortical neurons indicating dysfunctional autophagosome formation. These findings point towards a neuron-specific impairment of autophagy and need further investigation. Adding to the range of AP-4-related phenotypes, neurite outgrowth and branching are impaired in AP-4-deficient iPSC-derived cortical neurons as early as 24h after plating and together with recent studies point towards a distinct role of ATG9A in neurodevelopment independent of autophagy. Together, this work provides the first patient-derived neuron model of AP-4-deficiency and shows that ATG9A is sorted in an AP-4-dependent manner. It establishes ATG9A- related phenotypes and impaired neurite outgrowth as robust markers for a high-content screening. This disease model holds the promise of providing a platform to further study AP-4-deficiency and to search for novel therapeutic targets. N2 - Die Adaptor-Protein-4-Defizienz (AP-4-Defizienz) ist eine autosomal-rezessiv vererbte, komplizierte Form hereditären spastischen Paraplegien (HSPs), welche durch biallelische Mutationen in einer der vier Untereinheiten des AP-4-Gens verursacht wird. Die vier resultierenden Erkrankungen werden SPG47 (AP4B1, OMIM #614066), SPG50 (AP4M1, OMIM #612936), SPG51 (AP4E1, OMIM #613744) und SPG52 (AP4S1, OMIM #614067) genannt und präsentieren sich mit globaler Entwicklungsverzögerung im frühen Säuglingsalter, progressiver Spastik sowie Krampfanfällen. Radiologische Zeichen beinhalten ein verschmälertes Corpus callosum, Ventrikulomegalie und Veränderungen der weißen Substanz. AP-4 ist ein hoch konservierter, heterotetramerer Proteinkomplex, welcher für die polarisierte Verteilung von Transmembranproteinen einschließlich des „autophagy-related protein 9 A“ (ATG9A) zuständig ist. Eine „lossof- function“ Mutation in einer der vier Untereinheiten führt zur Instabilität des gesamten Komplexes und zur Beeinträchtigung des AP-4-abhängigen Proteintransportes. ATG9A ist notwendig für die Bildung von Autophagosomen und das Neuritenwachstum. In AP- 4-defizienten Zellen ist der ATG9A-Transport beeinträchtigt und ein ZNS-spezifischer Knockout von ATG9A erzeugt in Mäusen einen Phenotyp, der große Überschneidungen mit dem der AP-4-Defizienz aufweist. Bisher sind diese AP-4-abhängigen zellulären Phenotypen nicht in humanen Neuronen untersucht worden. Daher ist die Entwicklung des ersten humanen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten kortikalen Neuronenmodells der AP-4-Defizienz und die Identifikation AP-4-abhängiger Phenotypen für die Anwendung in einem Hochdurchsatzscreening das Ziel dieser Arbeit. Unter der Hypothese, dass AP-4- Defizienz in humanen iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen zu ATG9A Fehltransport, erhöhtem ATG9A Protein, beeinträchtigter Autophagie und vermindertem Neuritenwachstum führt, wurden biochemische und automatisierte, Mikroskopie-basierte in vitro Assays entwickelt. Zunächst wurden primäre humane Fibroblasten von Patienten mit compound-heterozygoten Mutationen im AB4B1-Gen und geschlechtsangepasste, elterliche Kontrollzellen auf die genannten Phenotypen hin untersucht. Dieselben Zelllinien wurden anschließend für die Generierung von iPSCs und die Differenzierung in exzitatorische kortikale Neurone verwendet. 90 Diese Arbeit zeigt, dass ATG9A in AP-4-defizienten Fibroblasten im Bereich des Trans- Golgi-Netzwerkes akkumuliert und das ATG9A Proteinlevel erhöht sind, was auf eine kompensatorische Hochregulierung hindeutet. Die Proteinlevel der AP4E1-Untereinheit wurden als Surrogatparameter für einen stabilen AP-4-Komplex genutzt und waren in AP-4-defizienten Fibroblasten vermindert. In der Co-Immunpräzipitation konnte eine Instabilität des AP-4-Komplexes bestätigt werden. Die lentivirale Reexpression der AB4B1-Untereinheit führte zu einer Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps und zeigt damit, dass ein stabiler AP-4-Komplex für die korrekte Verteilung von ATG9A notwendig ist. Trotz der bekannten Beteiligung von ATG9A an der Bildung von Autophagosomen, zeigte sich eine intakte Autophagosomenbildung und Degradation in AP-4-defizienten Fibroblasten. Die beschriebenen phänotypischen Marker wurden in iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen evaluiert und auch hier konnten eine juxtanukleäre Akkumulation von ATG9A sowie erhöhte ATG9A Proteinlevel demonstriert werden. Im Gegensatz zu den Fibroblasten, zeigten AP-4-defiziente iPSCabgeleitete kortikale Neurone bereits unter nährstoffreichen Bedingungen eine Konstellation von Autophagiemarkern, die auf eine gestörte Autophagosomenbildung und damit auf eine Neuronen-spezifische Störung von Autophagie hindeuten und der weiteren Untersuchung bedürfen. Zusätzlich fand sich bei AP-4-defizienten kortikalen Neuronen bereits in den ersten 24 Stunden im Inkubator eine Störung des Neuritenwachstums und der -verzweigung, welche in Zusammenschau mit kürzlich erschienenen Arbeiten auf eine zusätzliche Autophagie-unabhängige Funktion von ATG9A hinweisen. Diese Arbeit stellt zusammenfassend die Entwicklung des ersten Patienten-abgeleiteten Neuronenmodells der AP-4-Defizienz dar und zeigt das ATG9A in einer AP-4-abhänigen Weise in der Zelle verteilt wird. Weiterhin etabliert diese Arbeit ATG9A-abhängige zelluläre Phänotypen und gestörtes Neuritenwachstum als robuste phänotypische Marker für ein High-Content Screening. Dieses zelluläre Krankheitsmodell trägt das Potential als Plattform für weitere Studien der AP-4-Defizienz zu dienen und damit neue therapeutische Möglichkeiten aufzudecken. KW - Adaptorproteine KW - hereditary spastic paraplegia KW - iPSC Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351390 ER - TY - THES A1 - Pekárek, Lukáš T1 - Single-Molecule Approaches To Study Frameshifting Mechanisms T1 - Einzelmolekülansätze zur Untersuchung von Frameshifting-Mechanismen N2 - The RNAs of many viruses contain a frameshift stimulatory element (FSE) that grants access to an alternate reading frame via −1 programmed ribosomal frameshifting (PRF). This −1PRF is essential for effective viral replication. The −1PRF efficiency relies on the presence of conserved RNA elements within the FSE, such as a slippery sequence, spacer, and a downstream secondary structure – often a hairpin or a pseudoknot. The PRF efficiency is also affected by trans-acting factors such as proteins, miRNAs and metabolites. The interactions of these factors with the RNA and the translation machinery have not yet been completely understood. Traditional ensemble methods used previously to study these events focus on the whole population of molecular species. This results in innate averaging of the molecular behavior and a loss of heterogeneity information. Here, we first established the experimental workflow to study the RNA structures and the effect of potential trans-acting factors using single-molecule force spectroscopy technique, optical tweezers. Additionally, to streamline the data analysis, we developed an algorithm for automatized data processing. Next, we harnessed this knowledge to study viral RNA elements responsible for stimulation of PRF and how the presence of trans-acting factors affects the RNA behavior. We further complemented these single-molecule structural data with ensemble functional assays to gain a complex view on the dynamics behind the programmed ribosomal frameshifting. Specifically, two different viral RNA elements have been studied in the presented work. First, the dynamics of SARS-CoV-2 FSE and the role of extended sequences have been explored. Then, the mode of action of the host-encoded trans-acting factor ZAP-S inhibition of SARS-CoV-2 PRF has been examined. Finally, the mechanism of the trans-acting viral factor induced PRF in Encephalomyocarditis virus (EMCV) has been uncovered. N2 - Die RNAs vieler Viren enthalten ein Lese-Rasterverschiebung-stimulierendes Element (FSE), das über die −1 programmierte ribosomale Rasterverschiebung (PRF) Zugriff auf einen alternativen Leserahmen gewährt. Dieser −1PRF ist für eine effektive Virusreplikation unerlässlich. Die −1PRF-Effizienz beruht auf dem Vorhandensein konservierter RNA-Elemente innerhalb des FSE, wie z.B. einer Slippery-Sequenz, einem Platzhalter und einer nachgelagerten Sekundärstruktur – oft eine Haarnadel oder ein Pseudoknoten. Die −1PRF-Effizienz wird auch durch trans-aktive Faktoren wie Proteine, miRNAs und Metaboliten beeinflusst. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren mit der RNA und der Translationsmaschinerie sind noch nicht vollständig verstanden. Traditionelle Ensemble-Methoden, die früher zur Untersuchung dieser Ereignisse verwendet wurden, konzentrieren sich auf die gesamte Population molekularer Spezies. Dies führt zu einer inhärenten Durchschnittsbildung des molekularen Verhaltens und einem Verlust von Heterogenitätsinformationen. Hier haben wir zunächst den experimentellen Arbeitsablauf zur Untersuchung der RNA-Strukturen und der Wirkung potenzieller trans-aktiver Faktoren mithilfe der Einzelmolekül-Kraftspektroskopietechnik Optischer Pinzetten etabliert. Um die Datenanalyse zu optimieren, haben wir außerdem einen Algorithmus zur automatisierten Datenverarbeitung entwickelt. Als nächstes nutzten wir dieses Wissen, um virale RNA-Elemente zu untersuchen, die für die Stimulierung von −1PRF verantwortlich sind, und wie sich das Vorhandensein trans-aktiver Faktoren auf das Verhalten der RNA auswirkt. Wir haben diese Einzelmolekülstrukturdaten weiter durch Ensemble-Funktionsassays ergänzt, um einen komplexen Überblick über die Dynamik hinter der programmierten ribosomalen Rasterverschiebung zu erhalten. Konkret wurden in der vorgestellten Arbeit zwei verschiedene virale RNA-Elemente untersucht. Zunächst wurden die Dynamik des SARS-CoV-2-FSE und die Rolle erweiterter Sequenzen untersucht. Anschließend wurde die hemmende Wirkungsweise des vom Wirt kodierten trans-wirkenden Faktors ZAP-S auf SARS-CoV-2-PRF untersucht. Schließlich wurde der Mechanismus der, durch den trans-aktiven Virusfaktor induzierten PRF beim Enzephalomyokarditis-Virus (EMCV), entschlüsselt KW - translation KW - infection KW - frameshifting Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346112 ER - TY - THES A1 - Cronjé, Johrine T1 - Trust towards Virtual Humans in Immersive Virtual Reality and Influencing Factors T1 - Vertrauen gegenüber virtuellen Menschen in immersiver virtueller Realität und beeinflussende Faktoren N2 - Virtual humans (VHs) hold immense potential for collaboration in social virtual reality (VR). As VR technology advances, it's vital to assess the psychological effects on VH trust and user privacy to build meaningful social interactions in VR. In social VR, users must be able to trust the VHs they interact with as they navigate through socio-cultural activities. The evaluation of trustworthiness in VHs profoundly impacts interaction quality and user willingness to engage. Conversely, untrustworthy VHs can harm user experiences, privacy, and VR engagement. To address this, we conducted immersive VR studies, exploring how psychological factors influence user's VH trust evaluation under various psychological conditions. This research is pivotal for developing strategies to enhance user privacy, establish secure VR environments, and create a foundation of trust that supports immersive socio-cultural experiences in VR. To date, there are no established interpersonal trust measurement tools specifically for VHs in VR. In study 1 (the familiarity study) of the current thesis the VR-adjusted version of the social conditioned place preference paradigm (SCPP) by Kiser et al., (2022) was identified as a potential trust measurement tool. We tested whether the familiarity of a VH influenced trust as measured with the SCPP paradigm and other self-defined outcome measures, in a Computer Augmented Virtual Environment (CAVE). The CAVE is a VR system that combines immersive VR with real-world elements. It consists of a room-sized space where the walls are used as projection screens to display virtual scenes and objects. In this within - subject design (n = 20), half of the participants were familiarized with one VH and tasked to explore and interact in a realistic looking virtual art museum environment. The participant’s evaluation of the VH’s trustworthiness was measured as well as their subsequent trust behaviours. Results revealed no significant differences in the evaluation of the VH’s trustworthiness nor any behavioural differences between conditions. The findings of the impact of a VH’s familiarity on trust is inconclusive due to the major limitations of the paradigm. We concluded that the SCPP paradigm needs further validation and the proposed proxies of trust need to be re-evaluated. The findings were considered in the following study. The virtual maze paradigm design of Hale, (2018) was identified as a potential trust measurement tool, however several limitations are associated with its use to measure trust in VR. In study 2 (a validation study), improvements were made to the virtual maze paradigm of Hale, (2018) and a variant of this paradigm was implemented. We conducted a validation study with 70 participants in a between-subject design with VH trustworthiness as the between-subject factor. Participants wore a head-mounted display (HMD), to deliver an immersive VR experience. In our version of the virtual maze, it was the task of the users (the trustors) to navigate through a maze in VR, where they could interact with a VH (the trustee). They could choose to ask for advice and follow the advice from the VH if they wanted to. The number of times participants asked and followed advice and the time it took to respond to the given advice served as behavioural proxies/measures of trust. The two conditions (trustworthy vs. untrustworthy) did not differ in the content of the advice but in the appearance, tone of voice and engagement of the trustees (allegedly an avatar controlled by other participants). Results indicated that the experimental manipulation was successful, as participants rated the VH as more trustworthy in the trustworthy condition compared with the VH in the untrustworthy condition. Importantly, this manipulation affected the trust behaviour of participants, who, in the trustworthy condition, asked for advice and followed advice more often, indicating that the paradigm is sensitive to differences in VH’s trustworthiness. Thus, our paradigm can be used to measure differences in interpersonal trust towards VHs and may serve as a valuable research tool for researchers who study trust in VR. Therefore, study 2 fills the gap in the literature, for an interpersonal trust measurement tool specifically for VHs in VR. Two experimental studies, with a sample size of 50 participants each, utilized the virtual maze paradigm where participants entered 12 rooms under different conditions. We examined the influence of cognitive load (CL) on trust towards VH in VR in study 3 (Cognitive load study), and the influence of emotional affect (Emotional affect study) on trust towards VH in VR in study 4 (EA study). In both studies, we assessed participant’s evaluation of a VH’s trustworthiness, along with three behavioural indicators of trust in the maze task: 1) frequency of advice asked, 2) frequency of advice followed, and 3) the time taken by participants to execute the received advice. In study 3, the CL was manipulated with the auditory 1-back task in the high cognitive load condition (HCL). In study 4, the Autobiographical Emotional Memory Task (AEMT) was used to manipulate the EA of participants in the negative emotional affect (NEA) condition. As an additional manipulation, while participants were immersed in VR, they were exposed to 12 negative pictures and sounds that was presented simultaneously to strengthen the initial manipulation. The manipulation of the within-subject factors (CL and EA) was successful in both studies, as significant differences between conditions were observed in both studies (higher CL in the HCL condition and a more negative EA in the NEA condition). However, only CL influenced participant’s evaluation of the VH’s trustworthiness. The VH were evaluated as significantly more trustworthy after the HCL condition. Despite the difference in trust evaluation, there was no difference in advice asking or following. Participants in study 4 asked and followed advice due to their trust in the VH and asked and followed advice equally often in both conditions. Importantly, significant differences were observed in the participants response times in both studies. In study 3 during the HCL condition participants followed advice quicker. The order in which the conditions were presented influenced the experience of CL. Participants experienced higher levels of CL and responded to advice significantly faster when low cognitive load (LCL) was presented as the first condition compared with LCL as the second condition. In study 4 participants in the NEA condition followed advice slower similar to the findings of study 3. The order in which the conditions were presented had a significant effect on the EA. Participants asked and followed advice less when the NEA condition was presented first compared with when it is presented second. Possible explanations for the findings are discussed in the thesis. Overall, this thesis offers a novel tool for trust measurement (the virtual maze paradigm) and contributes to understanding the role of psychological factors in trust towards virtual humans in virtual reality. N2 - Die Darstellung virtueller Menschen (VHs) birgt ein enormes Potenzial für die Zusammenarbeit in der sozialen virtuellen Realität (VR). Da die VR-Technologie voranschreitet, ist es wichtig, die psychologischen Auswirkungen auf das Vertrauen in VHs und die Privatsphäre der Benutzer zu bewerten, um sinnvolle soziale Interaktionen in VR aufzubauen. In der sozialen VR müssen Benutzer:innen den VHs, mit denen sie interagieren, vertrauen können, während sie durch soziokulturelle Aktivitäten navigieren. Die Bewertung der Vertrauenswürdigkeit in VHs hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Interaktionsqualität und die Bereitschaft der Benutzer:innen, sich zu engagieren. Umgekehrt können nicht vertrauenswürdige VHs das Benutzererlebnis, die Privatsphäre und das VR-Engagement beeinträchtigen. Um dieses Problem zu adressieren, wurden immersive VR-Studien durchgeführt und dabei wurde untersucht, welche psychologische Faktoren die VH-Vertrauensbewertung des Benutzers unter verschiedenen psychologischen Bedingungen beeinflussen. Diese Forschung ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Strategien zur Verbesserung der Privatsphäre der Benutzer, zur Einrichtung sicherer VR-Umgebungen und zur Schaffung einer Vertrauensbasis, die immersive soziokulturelle Erfahrungen in VR unterstützt. Bisher gibt es keine etablierten Tools zur Messung des zwischenmenschlichen Vertrauens speziell für VHs in VR. In Studie 1 (der Vertrautheitsstudie) der aktuellen Dissertation wurde die VR-adjustierte Version des Social Conditioned Place Preference Paradigm (SCPP) von Kiser et al. (2022) als potenzielles Vertrauensmessinstrument identifiziert. In einer Computer Augmented Virtual Environment (CAVE) wurde getestet, ob die Vertrautheit eines VH das Vertrauen beeinflusst, gemessen mit dem SCPP-Paradigma und anderen selbstdefinierten Ergebnismaßen. Das CAVE ist ein VR-System, das immersive VR mit realen Elementen kombiniert. Es handelt sich um einen raumgroßen Raum, dessen Wände als Projektionsflächen für die Darstellung virtueller Szenen und Objekte dienen. Bei diesem fächerübergreifenden Design (n = 20) wurde die Hälfte der Teilnehmer mit einem VH vertraut gemacht und erhielt die Aufgabe, eine realistisch aussehende virtuelle Kunstmuseumsumgebung zu erkunden und darin zu interagieren. Es wurde die Einschätzung der Vertrauenswürdigkeit des VH durch die Teilnehmer sowie ihr anschließendes Verhalten gemessen. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Bewertung der Vertrauenswürdigkeit des VH und auch keine Verhaltensunterschiede zwischen den Bedingungen. Die Ergebnisse zum Einfluss der Vertrautheit eines VH auf das Vertrauen sind aufgrund der großen Einschränkungen des Paradigmas nicht schlüssig. Daraus wurde der Schluss gezogen, dass das SCPP-Paradigma einer weiteren Validierung bedarf und die vorgeschlagenen Vertrauensparameter neu bewertet werden müssen. Die Ergebnisse wurden in der folgenden Studie berücksichtigt. Das Virtual-Labyrinth-Paradigma-Design von Hale (2018) wurde als potenzielles Instrument zur Vertrauensmessung identifiziert, wobei seine Verwendung zur Messung des Vertrauens in VR jedoch mit mehreren Einschränkungen verbunden ist. In Studie 2 (einer Validierungsstudie) wurden Verbesserungen am virtuellen Labyrinth-Paradigma von Hale (2018) vorgenommen und eine Variante dieses Paradigmas implementiert. Es wurde eine Validierungsstudie mit 70 Teilnehmern in einem Inter-Subjekt-Design mit VH-Vertrauenswürdigkeit als Zwischen-Subjekt-Faktor durchgeführt. Die Teilnehmer:innen trugen ein Head-Mounted-Display (HMD), um ein immersives VR-Erlebnis zu bieten. In unserer Version des virtuellen Labyrinths war es die Aufgabe der Benutzer:innen („Treugeber“), durch ein Labyrinth in VR zu navigieren, wo sie mit einem VH (dem „Treuhänder“) interagieren konnten. Sie könnten sich entscheiden, um Rat zu fragen und den Ratschlägen des VH zu folgen, wenn sie wollten. Als Verhaltensindikatoren/Maßstäbe für das Vertrauen dienten die Häufigkeit, mit der die Teilnehmer:innen nach Ratschlägen fragten und diese befolgten, sowie die Zeit, die sie brauchten, um auf den gegebenen Rat zu reagieren. Die beiden Bedingungen (vertrauenswürdig vs. nicht vertrauenswürdig) unterschieden sich nicht im Inhalt der Beratung, sondern im Aussehen, Tonfall und Engagement des Treuhänders (angeblich ein von anderen Teilnehmer:inne:n kontrollierter Avatar). Die Ergebnisse zeigten, dass die experimentelle Manipulation erfolgreich war, da die Teilnehmer:innen den VH in der vertrauenswürdigen Bedingung als vertrauenswürdiger einschätzten als den VH in der nicht vertrauenswürdigen Bedingung. Wichtig ist, dass sich diese Manipulation auf das Verhalten der Teilnehmer:innen auswirkte, da diese in der vertrauenswürdigen Bedingung häufiger um Rat fragten und Ratschläge befolgten, was darauf hindeutet, dass das Paradigma empfindlich auf Unterschiede in der Vertrauenswürdigkeit von VH reagiert. Somit kann das entwickelte Paradigma verwendet werden, um Unterschiede im zwischenmenschlichen Vertrauen gegenüber VHs zu messen und als wertvolles Forschungsinstrument für Forscher:innen dienen, die Vertrauen in VR untersuchen. Daher füllt Studie 2 die Lücke in der Literatur für ein Tool zur Messung des zwischenmenschlichen Vertrauens speziell für VHs in VR. Zwei experimentelle Studien mit einer Stichprobengröße von jeweils 50 Teilnehmern nutzten das Paradigma des virtuellen Labyrinths, bei dem die Teilnehmer 12 Räume unter unterschiedlichen Bedingungen betraten. Anschließend wurde der Einfluss der kognitiven Belastung (CL) auf das Vertrauen gegenüber VH in VR in Studie 3 (Studie zur kognitiven Belastung) und der Einfluss emotionaler Affekte in Studie 4 (Studie zum emotionalen Affekt, EA-Studie) auf das Vertrauen gegenüber VH in VR untersucht. In beiden Studien wurde die Einschätzung der Vertrauenswürdigkeit eines VH durch die Teilnehmer:innen mit drei Verhaltensindikatoren für Vertrauen in der Labyrinthaufgabe bewertet: 1) Häufigkeit der erfragten Ratschläge, 2) Häufigkeit der befolgten Ratschläge und 3) die Zeit, die die Teilnehmer:innen zur Ausführung der Aufgabe nach einem Rat benötigten. In Studie 3 wurde die CL mit der auditiven 1-Rücken-Aufgabe im Zustand hoher kognitiver Belastung (HCL) manipuliert. In Studie 4 wurde die Autobiographical Emotional Memory Task (AEMT) verwendet, um den EA von Teilnehmer:inne:n im Zustand des negativen emotionalen Affekts (NEA) zu manipulieren. Als zusätzliche Manipulation wurden die Teilnehmer:innen, während sie in die VR eintauchten, 12 negativen Bildern und Tönen ausgesetzt, die gleichzeitig präsentiert wurden, um die anfängliche Manipulation zu verstärken. Die Manipulation der subjektiven Faktoren (CL und EA) war in beiden Studien erfolgreich, da in beiden Studien signifikante Unterschiede zwischen den Bedingungen beobachtet wurden (höhere CL im HCL-Zustand und ein negativerer EA im NEA-Zustand). Allerdings beeinflusste nur die CL die Bewertung der Vertrauenswürdigkeit des VH durch die Teilnehmer. Die VH wurden nach der HCL-Bedingung als deutlich vertrauenswürdiger bewertet. Trotz der unterschiedlichen Vertrauensbewertung gab es keinen Unterschied darin, Ratschläge zu erfragen oder zu befolgen. Die Teilnehmer:innen in Studie 4 fragten und befolgten Ratschläge aufgrund ihres Vertrauens in die VH und in beiden Bedingungen gleich oft. Wichtig ist, dass in beiden Studien signifikante Unterschiede in den Reaktionszeiten der Teilnehmer:innen beobachtet wurden. In Studie 3 folgten die Teilnehmer:innen in der HCL-Bedingung den Ratschlägen schneller. Die Reihenfolge, in der die Bedingungen dargestellt wurden, beeinflusste die Erfahrung von CL. Die Teilnehmer:innen erlebten höhere CL-Werte und reagierten deutlich schneller auf Ratschläge, wenn eine niedrige kognitive Belastung (LCL) als erste Bedingung genutzt wurde, verglichen mit LCL als zweite Bedingung. In Studie 4 folgten die Teilnehmer:innen in der NEA-Bedingung den Ratschlägen langsamer, ähnlich wie in Studie 3. Die Reihenfolge der Bedingungen, hatte einen signifikanten Einfluss auf die EA. Wenn die NEA-Bedingung zuerst genutzt wurde, fragten und befolgten die Teilnehmer:innen weniger Ratschläge als wenn sie als zweites vorgestellt wurde. Mögliche Erklärungen für die Ergebnisse werden in der Arbeit diskutiert. Insgesamt bietet diese Arbeit ein neuartiges Werkzeug zur Vertrauensmessung (das virtuelle Labyrinth-Paradigma) und trägt zum Verständnis der Rolle psychologischer Faktoren beim Vertrauen gegenüber virtuellen Menschen in der virtuellen Realität bei. KW - Virtual Human KW - Virtual Reality KW - Trust KW - Cognitive Load KW - Emotional Affect KW - Trust Measurement KW - Virtuelle Realität KW - Psychological factors KW - Vertrauen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348143 ER - TY - THES A1 - Lu, Jinping T1 - The vacuolar TPC1 channel and its luminal calcium sensing site in the luminal pore entrance T1 - Der vakuoläre TPC1-Kanal und seine luminale Kalzium-Sensorstelle im luminalen Porenbereich N2 - The slowly activating vacuolar SV/TPC1 channel is ubiquitously expressed in plants and provides a large cation conductance in the vacuolar membrane. Thereby, monovalent (K+, Na+) and in principle also divalent cations, such as Ca2+, can pass through the channel. The SV/TPC1 channel is activated upon membrane depolarization and cytosolic Ca2+ but inhibited by luminal calcium. With respect to the latter, two luminal Ca2+ binding sites (site 1 Asp240/Asp454/Glu528, site 2 Glu239/Asp240/Glu457) were identified to coordinate luminal Ca2+. In this work, the characteristics of the SV/TPC1 channels in terms of regulation and function were further elucidated, focusing on the TPC1s of Arabidopsis thaliana and Vicia faba. For electrophysiological analysis of the role of distinct pore residues for channel gating and luminal Ca2+ sensing, TPC1 channel variants were generated by site-directed mutagenesis and transiently expressed as eGFP/eYFP-fusion constructs in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant attpc1-2. 1. As visualized by confocal fluorescence laser-scanning microscopy, all AtTPC1 (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) and VfTPC1 channel variants (WT, N458E/A607E/ N608D) were correctly targeted to the vacuole membrane. 2. Patch-clamp studies revealed that removal of one of the negative charges at position Glu605 or Asp606 was already sufficient to promote voltage-dependent channel activation with higher voltage sensitivity. The combined neutralization of these residues (E605A/D606N), however, was required to additionally reduce the luminal Ca2+ sensitivity of the AtTPC1 channel, leading to hyperactive AtTPC1 channels. Thus, the residues Glu605/Asp606 are functionally coupled with the voltage sensor of AtTPC1 channel, thereby modulating channel gating, and form a novel luminal Ca2+ sensing site 3 in AtTPC1 at the luminal entrance of the ion transport pathway. 3. Interestingly, this novel luminal Ca2+ sensing site 3 (Glu605/Asp606) and Glu457 from the luminal Ca2+ sensing site 2 of the luminal Ca2+-sensitive AtTPC1 channel were neutralized by either asparagine or alanine in the TPC1 channel from Vicia faba and many other Fabaceae. Moreover, the VfTPC1 was validated to be a hyperactive TPC1 channel with higher tolerance to luminal Ca2+ loads which was in contrast to the AtTPC1 channel features. As a result, VfTPC1 but not AtTPC1 conferred the hyperexcitability of vacuoles. When AtTPC1 was mutated for the three VfTPC1-homologous polymorphic site residues, the AtTPC1 triple mutant (E457N/E605A/D606N) gained VfTPC1-like characteristics. However, when VfTPC1 was mutated for the three AtTPC1-homologous polymorphic site residues, the VfTPC1 triple mutant (N458E/A607E/N608D) still sustained VfTPC1-WT-like features. These findings indicate that the hyperactivity of VfTPC1 is achieved in part by the loss of negatively charged amino acids at positions that - as part of the luminal Ca2+ sensing sites 2 and 3 – are homologous to AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 and are likely stabilized by other unknown residues or domains. 4.The luminal polymorphic pore residues (Glu605/Asp606 in AtTPC1) apparently do not contribute to the unitary conductance of TPC1. Under symmetrical K+ conditions, a single channel conductance of about 80 pS was determined for AtTPC1 wild type and the AtTPC1 double mutant E605A/D606A. This is in line with the three-fold higher unitary conductance of VfTPC1 (232 pS), which harbors neutral luminal pore residues at the homologous sites to AtTPC1. In conclusion, by studying TPC1 channel from Arabidopsis thaliana and Vicia faba, the present thesis provides evidence that the natural TPC1 channel variants exhibit differences in voltage gating, luminal Ca2+ sensitivity and luminal Ca2+ binding sites. N2 - Der langsam aktivierende vakuoläre SV/TPC1-Kanal wird in Pflanzen ubiquitär exprimiert und besitzt eine große Kationenleitfähigkeit in der Vakuolen¬membran. Dabei können einwertige (K+, Na+) und im Prinzip auch zweiwertige Kationen, wie Ca2+, den Kanal passieren. Der SV/TPC1-Kanal wird bei Membrandepolarisation und zytosolischem Ca2+ aktiviert, aber durch luminales Calcium gehemmt. In Bezug auf letzteres wurden zwei luminale Ca2+-Bindungsstellen (Seite I Asp240/Asp454/Glu528, Seite II Glu239/Asp240/Glu457) zwecks Koordination von luminalem Ca2+ identifiziert. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften der SV/TPC1-Kanäle in Bezug auf Regulierung und Funktion weiter aufgeklärt, wobei der Schwerpunkt auf den TPC1-Proteinen von Arabidopsis thaliana und Vicia faba lag. Zur elektrophysiologischen Analyse der Rolle verschiedener Porenaminosäuren für das Kanal-Gating und die luminale Ca2+-Erkennung wurden TPC1-Kanalvarianten durch gezielte Mutagenese erzeugt und transient als eGFP/eYFP-Fusionskonstrukte in Mesophyll-Protoplasten der TPC1-Verlust¬mutante attpc1-2 von Arabidopsis thaliana exprimiert. 1. Mittels konfokaler Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskopie wurde anhand der eGFP- bzw. eYFP-Fluoreszenzsignale nachgewiesen, dass alle AtTPC1- (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) und VfTPC1-Kanalvarianten (WT, N458E/A607E/ N608D) korrekt in die Vakuolenmembran eingebaut wurden. 2. Patch-Clamp-Studien zeigten, dass die Entfernung einer der negativen Ladungen an den Positionen Glu605 oder Asp606 bereits ausreichte, um die spannungsabhängige Kanalaktivierung mit höherer Spannungsempfindlichkeit zu fördern. Die kombinierte Neutralisierung dieser Reste (E605A/D606N) war jedoch erforderlich, um die luminale Ca2+-Empfindlichkeit des AtTPC1-Kanals zusätzlich zu reduzieren, was zu hyperaktiven AtTPC1-Kanälen führte. Die Aminosäurereste Glu605/Asp606 sind also funktionell mit dem Spannungssensor des AtTPC1-Kanals gekoppelt und modulieren dadurch das Kanaltor. Sie bilden eine neuartige luminale Ca2+-Sensorstelle 3 in AtTPC1 am luminalen Eingang des Ionentransportweges. 3. Interessanterweise waren diese Aminosäurereste Glu605/Asp606 der neuartigen luminalen Ca2+-Sensorstelle 3 und Glu457 von der luminalen Ca2+-Sensorstelle 2 des luminalen Ca2+-empfindlichen AtTPC1-Kanals im TPC1-Kanal von Vicia faba und vielen anderen Fabaceae entweder durch Asparagin oder Alanin neutralisiert. Darüber hinaus wurde der VfTPC1 als hyperaktiver TPC1-Kanal mit höherer Toleranz gegenüber luminalen Ca2+-Belastungen validiert, was im Gegensatz zu den Eigenschaften des AtTPC1-Kanals stand. Infolgedessen ist VfTPC1, nicht aber AtTPC1, für die hohe Erregbarkeit der Vakuolen verantwortlich. Wenn AtTPC1 für die drei VfTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, erhielt die AtTPC1-Dreifachmutante (E457N/E605A/D606N) VfTPC1-ähnliche Eigenschaften. Wenn VfTPC1 jedoch für die drei AtTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, behielt die VfTPC1-Dreifachmutante (N458E/A607E/N608D) weiterhin VfTPC1-WT-ähnliche Merkmale. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hyperaktivität von VfTPC1 zum Teil durch den Verlust von negativ geladenen Aminosäuren an Positionen erreicht wird, die - als Teil der luminalen Ca2+-Sensorstellen 2 und 3 - homolog zu AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 sind und wahrscheinlich durch andere unbekannte Reste oder Domänen stabilisiert werden. 4. Die luminalen polymorphen Porenreste (Glu605/Asp606 in AtTPC1) beeinflussen offenbar nicht die Einzelkanaleitfähigkeit von TPC1. Unter symmetrischen K+-Bedingungen wurde für den AtTPC1-Wildtyp und die AtTPC1-Doppelmutante E605A/D606A eine Einzelkanalleitfähigkeit von etwa 80 pS ermittelt. Dies steht im Einklang mit der dreifach höheren Einzelkanalleitfähigkeit von VfTPC1 (232 pS), der an den homologen Stellen zu AtTPC1 neutrale luminale Porenreste aufweist. Durch die Untersuchung von TPC1-Kanälen aus Arabidopsis thaliana und Vicia faba konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass diese natürlichen TPC1-Kanalvarianten Unterschiede im Spannungs-Gating, der luminalen Ca2+-Empfindlichkeit und den luminalen Ca2+-Bindungsstellen aufweisen. KW - Arabidopsis thaliana KW - Vicia faba KW - vacuole KW - SV/TPC1 KW - luminal Ca2+ sensing sites KW - luminale Ca2+-Sensorstellen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251353 ER - TY - THES A1 - Zimmermann [née Papp], Lena T1 - Platelets as modulators of blood-brain barrier disruption and inflammation in the pathophysiology of ischemic stroke T1 - Thrombozyten als Modulatoren der Blut-Hirn-Schrankenstörung und Inflammation in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls N2 - Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization. Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS. N2 - Eine häufig auftretende Komplikation in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ist der Ischämie/Reperfusion Schaden (I/R Schaden), welcher trotz der erfolgreichen Wiederherstellung der zerebralen Durchblutung durch ein paradoxes Fortschreiten des entstandenen Gewebeschadens charakterisiert ist. Dieses Phänomen wird durch das schädigende Zusammenspiel von Thrombozyten und inflammatorischen Zellen am vaskulären Endothel verursacht. Allerdings sind die räumlich-temporalen und molekularen Mechanismen dieser zellulären Interaktionen und deren Beteiligung am Infarktwachstum noch nicht vollständig verstanden. Daraus folgend, beabsichtigte diese Arbeit eben diese temporalen Mechanismen des fortschreitenden Infarktwachstums nach der zerebralen Gefäßwiedereröffnung aufzuklären. Die hier vorgestellten Daten implizieren, dass das anhaltende Fortschreiten des Gewebeschadens durch die Schädigung der Bluthirnschranke verursacht wird und somit unabhängig vom Auftreten sekundär gebildeter Thromben ist. In vorangegangenen Studien konnte die Freisetzung von thrombozytären Granula als molekularer Mechanismus, mit welchem Thrombozyten zum I/R Schaden beitragen, aufgedeckt werden. Basierend auf diesen Studien wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die Sekretion thrombozytärer Granula im Zusammenhang mit der Beeinträchtigung der endothelialen Barriere gelegt. Durch die Kombination eines in vitro Ansatzes mit einem murinen Model des ischämischen Schlaganfalls konnte gezeigt werden, dass α-Granula endothelialen Schaden verursachen, wohingegen deren Absenz (NBEAL2 Defizienz) zu einer verbesserten mikrovaskulären Integrität führte. Aufgrund dessen könnte das Adressieren der α-Granula als eine neuartige Therapieoption zum Erhalt der vaskulären Integrität und zur Verminderung des Infarktwachstums trotz Rekanalisation genutzt werden. Neuste Erkenntnisse enthüllten, dass die dem I/R Schaden zu Grunde liegenden Pathomechanismen bereits während des Verschlusses eines großen hirnversorgenden Gefäßes zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust von penumbralem Gewebe unter Okklusion und I/R Schädigung während der Reperfusion im engen Zusammenhang stehen. Im Einklang hiermit konnten humane Daten eine Neutrophilen-dominierte Immunantwort und lokale Thrombozyten Aktivierung und deren Sekretion, anhand der Detektion der α-Granula Hauptkomponenten, im verschlossenen Gefäßsystem von ischämischen Schlaganfall Patienten nachweisen. Diese anfänglichen Beobachtungen konnten im Rahmen dieser Arbeit anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen von lokal abgenommenen ischämischen Blutproben erweitert werden. Die Phänotypisierung von Immunzellen enthüllte eine bisher unbekannte Verschiebung der Lymphozyten Population hin zu CD4+ T-Zellen und bekräftigte zusätzlich das Konzept einer unmittelbaren intravaskulären Immunantwort, welche durch Granulozyten dominiert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Thesis das erste Mal das erhöhte Auftreten von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten in dem verschlossenen humanen Gefäßsystem nachgewiesen werden. Demzufolge könnte eine Beeinflussung von Immunzellen und/oder Thrombozyten bereits unter Okklusion als potentiell vielversprechende Strategie genutzt werden, um die Ausweitung des Infarktes einzuschränken und klinische Endpunkte nach einem ischämischen Schlaganfall zu verbessern. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Entzündung KW - Thrombo-inflammation KW - Ischemic stroke KW - Platelets KW - Inflamamtion KW - Immune cells KW - Vascular system Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302850 ER - TY - THES A1 - Koser [geb. Kretzschmar], Charlotte Ursula T1 - \(Mon\) \(Aprendisage\) - Midwifery Training at the Hôtel-Dieu de Paris 1704 T1 - \(Mon\) \(Aprendisage\) - Hebammenausbildung am Hôtel-Dieu de Paris 1704 N2 - This thesis provides an edition and commentary of a manuscript discovered by Michael Stolberg in the archives of the central library in Zurich under the title “Mon aprendisage à l'Hôtel Dieu de Paris 1704.” (My apprenticeship at the Hôtel-Dieu de Paris 1704). The manuscript contains records of a midwifery student at the Hôtel-Dieu de Paris, an old hospital famous among others for its education in midwifery in the maternity ward. We read about managing different births, recipes for common remedies, direct questions answered by the maîtresse sage-femme, the leading midwife at the Hôtel-Dieu de Paris and more. Although other accounts exist of the maternity ward at the Hôtel-Dieu de Paris, \(Mon\) \(Aprendisage\) is the first and only account from a midwife’s perspective that gives more than just instructions on obstetrical techniques. It takes us into the day-to-day experience of a woman as she progressed through her training at the Hôtel-Dieu. N2 - Diese Arbeit ist eine Edition und ein Kommentar eines Manuskripts unter dem Titel "Mon aprendisage à l'Hôtel-Dieu de Paris 1704" (Meine Ausbildung am Hôtel-Dieu de Paris 1704), welches von Michael Stolberg im Archiv der Zentralbibliothek in Zürich gefunden wurde. Dieses Manuskript beinhaltet die Niederschriften einer Hebammenschülerin am Hôtel-Dieu de Paris, einem altes Krankenhaus, dass unter anderem bekannt war für seine herrausragende Ausbildung von Hebammen auf der Entbindungsstation. Wir lesen über den Umgang mit verschiedenen Geburten, Rezepte für gängige Heilmittel, direkte Fragen, die von der Maîtresse sage-femme, der leitenden Hebamme im Hôtel-Dieu de Paris beantwortet werden, und vieles mehr. Obwohl es auch andere Berichte über die Entbindungsstation des Hôtel-Dieu de Paris gibt, ist \(Mon\) \(Aprendisage\) der erste und einzige Bericht aus der Sicht einer Hebamme, der mehr als nur Anweisungen zu geburtshilflichen Techniken gibt. Er nimmt uns hinein in die alltäglichen Erfahrungen einer Frau, die ihre Ausbildung im Hôtel-Dieu absolviert. KW - midwifery KW - midwifery training KW - Hôtel-Dieu de Paris KW - history of midwifery KW - childbirth KW - midwife KW - obstetrics KW - midwifery education KW - Hebamme Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349520 ER - TY - THES A1 - Maier, Matthias T1 - Inorganic and Inorganic-Organic Hybrid Polymers Containing BN Units in the Main Chain T1 - Anorganische und anorganisch-organische hybrid Polymere mit BN Einheiten in der Hauptkette N2 - π-Conjugated organic polymers have attracted tremendous attention in the last decades, and the interest in these materials is mainly driven by their applicability in next-generation electronic and optoelectronic devices (OLEDs, OFETs, photovoltaics). The partial or complete replacement of carbon atoms by main group elements in conjugated polymers can significantly change the characteristics and applications of these macromolecules. In this work, a class of inorganic polymers comprising a backbone of exclusively boron and nitrogen atoms (poly(iminoborane)s, PIBs) and their monodisperse oligomers is described. In addition, novel inorganic–organic hybrid polymers containing BN units in their polymer backbone were synthesized and characterized. In chapter 2.1, the development of catalytic B–N coupling routes for the controlled synthesis of macromolecular materials is described. While the reaction of an N-silyl-B-chloro-aminoborane with the electrophilic reagent trimethylsilyl triflate led to effective B–N coupling, the reaction with a silver(I) salt resulted in an intramolecular Cl/Me exchange between the boron and silicon centers. In chapter 2.2-2.4, the study of oligo- and poly(iminoborane)s is discussed. Monodisperse and cyclolinear oligo(iminoborane)s based on diazaborolidines with up to 7 boron and 8 nitrogen atoms were synthesized by successively extending the B-N main chain. However, the use of benzodiazaborolines only led to limited BN catenation. Furthermore, the redistribution processes resulting from the reaction of longer oligomers with non-stoichiometric amounts of (di)halogenated boranes is reported. In chapter 2.5-2.6, the synthesis of 1,2,5-azadiborolanes as building blocks for the synthesis of poly(iminoborane)s and inorganic-organic hybrid polymers is described. While the attempt to apply an azadiborolane with sterically demanding groups on the boron-bridging ethylene unit for the construction of PIB was unfeasible, it was successfully incorporated in inorganic-organic hybrid polymers. Photophysical studies indicated π-conjugation along the polymer chain. A first attempt to synthesize PIBs based on azadiborolanes with unsubstituted ethylene units showed promising results. In chapter 2.7-2.8, a comprehensive study of poly(arylene iminoborane)s, which are BN analogs of poly(arylene vinylene)s is described, and the properties of four polymers as well as twelve monodisperse oligomers were investigated. Photophysical investigations of the monomers, dimers and polymers showed a systematic bathochromic shift of the absorption maximum with increasing chain length and thiophene content. Based on TD-DFT calculations of the model oligomers, the lowest-energy absorption band could be assigned to HOMO to LUMO transitions with π-π* character. The oligo- and poly(arylene iminoborane)s showed only very weak to no emission in solution but they were emissive in the solid state. For four oligomers the aggregation induced emission (AIE) in a THF/water mixture was investigated and DLS studies confirmed the formation of nanoaggregates. In chapter 2.9, oligo- and polymerizations of sulfur-containing building blocks and subsequent pH-triggered degradation of the products is described. While a sulfilimine-containing oligomer could not be isolated, the sulfone-, sulfoximine-, and sulfoxide-containing molecular oligomers and polymers could be successfully synthesized by B=N or B–O bond formation reactions. The sulfur-containing building blocks were successfully released under acidic or basic conditions, which was confirmed by NMR spectroscopy and mass spectrometry. N2 - π-Konjugierte organische Polymere haben in den letzten Jahrzehnten immer größere Aufmerksamkeit erhalten. Das Interesse an diesen Materialien wird hauptsächlich durch ihre Anwendbarkeit in elektronischen und optoelektronischen Geräten der nächsten Generation (OLEDs, OFETs, Photovoltaik) angetrieben. Der teilweise oder vollständige Ersatz von Kohlenstoffatomen durch andere Hauptgruppenelemente in konjugierten Polymeren kann die Eigenschaften und Anwendungen dieser Makromoleküle erheblich verändern. In dieser Arbeit wird eine Klasse anorganischer Polymere mit einer Hauptkette aus ausschließlich Bor- und Stickstoffatomen (Poly(iminoboran)en, PIBs) und deren monodisperse Oligomere beschrieben. Darüber hinaus wurden neuartige anorganisch-organische Hybridpolymere, die BN-Einheiten in ihrem Polymerrückgrat enthalten, synthetisiert und charakterisiert. In Kapitel 2.1 wird die Entwicklung von katalytischen B-N-Kupplungsmethoden für die kontrollierte Synthese von makromolekularen Materialien beschrieben. Während die Reaktion eines N-Silyl-B-Chlor-Aminoborans mit dem elektrophilen Reagenz Trimethylsilyltriflat zu einer effektiven B-N-Kupplung führte, führte die Reaktion mit einem Silber(I)-Salz zu einem intramolekularen Cl/Me-Austausch zwischen den Bor- und Siliziumzentren. In den Kapiteln 2.2-2.4 wird die Untersuchung von Oligo- und Poly(iminoboran)en behandelt. Durch die sukzessive Verlängerung der BN-Hauptkette wurden monodisperse und zyklolineare Oligo(iminoboran)e, basierend auf Diazaborolidinen, mit bis zu 7 Bor- und 8 Stickstoffatomen synthetisiert. Die Verwendung von Benzodiazaborolinen führte allerdings nur zu einer begrenzten BN-Bindungsknüpfung. Darüber hinaus wurde über Umverteilungsprozesse berichtet, die bei der Umsetzung von längeren Oligomeren mit nicht stöchiometrischen Mengen von (di)halogenierten Boranen resultieren. In den Kapiteln 2.5-2.6 wird die Synthese von 1,2,5-Azadiborolanen als Bausteine für die Synthese von Poly(iminoboran)en und anorganisch-organischen Hybridpolymeren beschrieben. Während der Versuch, ein Azadiborolan mit sterisch anspruchsvollen Gruppen an der borverbrückenden Ethyleneinheit für den Aufbau von PIBs einzusetzen nicht zum Erfolg führte, wurde diese Einheit jedoch erfolgreich in anorganisch-organische Hybridpolymere eingebaut. Photophysikalische Untersuchungen deuteten auf eine π-Konjugation entlang der Polymerkette hin. Ein erster Versuch, PIBs auf der Basis von Azadiborolanen mit unsubstituierten Ethyleneinheiten zu synthetisieren, zeigte vielversprechende Ergebnisse. In den Kapiteln 2.7-2.8 wird die umfassende Studie von Poly(aryleniminoboran)en, die die BN-Analoga von Poly(arylenvinylen)en darstellen, beschrieben und die Eigenschaften von vier Polymeren und zwölf monodispersen Oligomeren untersucht. Photophysikalische Untersuchungen der Monomere, Dimere und Polymere zeigten eine systematische bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums mit zunehmender Kettenlänge und Thiophengehalt. Auf der Grundlage von TD-DFT-Berechnungen der Modelloligomere konnte die niederenergetischste Absorptionsbande, HOMO-LUMO-Anregungen mit π-π* Charakter zugeordnet werden. Die Oligo- und Poly(aryleniminoboran)e zeigten nur sehr schwache oder keine Emission in Lösung, emittieren aber im festen Zustand. Für vier Oligomere wurde die aggregationsinduzierte Emission (AIE) in einem THF/Wasser-Gemisch untersucht und DLS-Studien bestätigten die Bildung von Nanoaggregaten. In Kapitel 2.9 werden Oligo- und Polymerisationen von schwefelhaltigen Bausteinen und die anschließende pH-gesteuerte Degradierung beschrieben. Während ein Sulfilimin-haltiges Oligomer nicht isoliert werden konnte, konnten die Sulfon-, Sulfoximin- und Sulfoxid-haltigen molekularen Oligomere und Polymere erfolgreich durch B=N oder B O Bindungsbildung synthetisiert werden. Die schwefelhaltigen Bausteine konnten unter sauren oder basischen Bedingungen erfolgreich freigesetzt werden, was durch NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie bestätigt wurde. KW - Anorganische Polymere KW - Konjugierte Polymere KW - Polyarylenvinylene KW - Polyiminoboranes KW - Silicon-Boron Exchange KW - Silizium-Bor Austausch KW - Bor-Stickstoff Bindung KW - boron-nitrogen bond Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351536 ER - TY - THES A1 - Däullary, Thomas T1 - Establishment of an infection model of the human intestinal epithelium to study host and pathogen determinants during the \(Salmonella\) Typhimurium infection process T1 - Etablierung eines Infektionsmodells des menschlichen Darmepithels zur Untersuchung von Wirts- und Erregerdeterminanten während des \(Salmonella\) Typhimurium-Infektionsprozesses N2 - According to the WHO, foodborne derived enteric infections are a global disease burden and often manifest in diseases that can potentially reach life threatening levels, especially in developing countries. These diseases are caused by a variety of enteric pathogens and affect the gastrointestinal tract, from the gastric to the intestinal to the rectal tissue. Although the complex mucosal structure of these organs is usually well prepared to defend the body against harmful agents, specialised pathogens such as Salmonella enterica can overcome the intestinal defence mechanism. After ingestion, Salmonella are capable of colonising the gut and establishing their proliferative niche, thereby leading to inflammatory processes and tissue damage of the host epithelium. In order to understand these processes, the scientific community in the last decades mostly used cell line based in vitro approaches or in vivo animal studies. Although these approaches provide fundamental insights into the interactions between bacteria and host cells, they have limited applicability to human pathology. Therefore, tissue engineered primary based approaches are important for modern infection research. They exhibit the human complexity better than traditional cell lines and can mimic human-obligate processes in contrast to animal studies. Therefore, in this study a tissue engineered human primary model of the small intestinal epithelium was established for the application of enteric infection research with the exemplary pathogen Salmonella Typhimurium. To this purpose, adult stem cell derived intestinal organoids were used as a primary human cell source to generate monolayers on biological or synthetic scaffolds in a Transwell®-like setting. These tissue models of the intestinal epithelium were examined for their comparability to the native tissue in terms of morphology, morphometry and barrier function. Further, the gene expression profiles of organotypical mucins, tight junction-associated proteins and claudins were investigated. Overall, the biological scaffold-based tissue models showed higher similarity to the native tissue - among others in morphometry and polarisation. Therefore, these models were further characterised on cellular and structural level. Ultrastructural analysis demonstrated the establishment of characteristic microvilli and tight-junction connections between individual epithelial cells. Furthermore, the expression pattern of typical intestinal epithelial protein was addressed and showed in vivo-like localisation. Interested in the cell type composition, single cell transcriptomic profiling revealed distinct cell types including proliferative cells and stem cells, progenitors, cellular entities of the absorptive lineage, Enterocytes and Microfold-like cells. Cells of the secretory lineage were also annotated, but without distinct canonical gene expression patterns. With the organotypical polarisation, protein expression, structural features and the heterogeneous cell composition including the rare Microfold-like cells, the biological scaffold-based tissue model of the intestinal epithelium demonstrates key requisites needed for infection studies with Salmonella. In a second part of this study, a suitable infection protocol of the epithelial tissue model with Salmonella Typhimurium was established, followed by the examination of key features of the infection process. Salmonella adhered to the epithelial microvilli and induced typical membrane ruffling during invasion; interestingly the individual steps of invasion could be observed. After invasion, time course analysis showed that Salmonella resided and proliferated intracellularly, while simultaneously migrating from the apical to the basolateral side of the infected cell. Furthermore, the bacterial morphology changed to a filamentous phenotype; especially when the models have been analysed at late time points after infection. The epithelial cells on the other side released the cytokines Interleukin 8 and Tumour Necrosis Factor α upon bacterial infection in a time-dependent manner. Taken together, Salmonella infection of the intestinal epithelial tissue model recapitulates important steps of the infection process as described in the literature, and hence demonstrates a valid in vitro platform for the investigation of the Salmonella infection process in the human context. During the infection process, intracellular Salmonella populations varied in their bacterial number, which could be attributed to increased intracellular proliferation and demonstrated thereby a heterogeneous behaviour of Salmonella in individual cells. Furthermore, by the application of single cell transcriptomic profiling, the upregulation of Olfactomedin-4 (OLFM4) gene expression was detected; OLFM4 is a protein involved in various functions including cell immunity as well as proliferating signalling pathways and is often used as intestinal stem cell marker. This OLFM4 upregulation was time-dependent, restricted to Salmonella infected cells and seemed to increase with bacterial mass. Investigating the OLFM4 regulatory mechanism, nuclear factor κB induced upregulation could be excluded, whereas inhibition of the Notch signalling led to a decrease of OLFM4 gene and protein expression. Furthermore, Notch inhibition resulted in decreased filamentous Salmonella formation. Taken together, by the use of the introduced primary epithelial tissue model, a heterogeneous intracellular bacterial behaviour was observed and a so far overlooked host cell response – the expression of OLFM4 by individual infected cells – could be identified; although Salmonella Typhimurium is one of the best-studied enteric pathogenic bacteria. This proves the applicability of the introduced tissue model in enteric infection research as well as the importance of new approaches in order to decipher host-pathogen interactions with higher relevance to the host. N2 - Nach Angaben der WHO stellen lebensmittelbedingte Darminfektionen eine globale Krankheitslast dar und äußern sich häufig in Krankheiten, die potenziell lebensbedrohliche Ausmaße annehmen können, insbesondere in Entwicklungsländern. Diese Krankheiten werden durch eine Vielzahl von enterischen Erregern verursacht und betreffen den Magen-Darm-Trakt, vom Magen über den Darm bis zum Enddarm. Obwohl die komplexe Schleimhautstruktur dieser Organe in der Regel gut darauf vorbereitet ist, den Körper vor schädlichen Reagenzien zu schützen, können spezialisierte Erreger wie Salmonella enterica den Abwehrmechanismus des Darms überwinden. Nach der Nahrungsaufnahme sind Salmonellen in der Lage, den Darm zu kolonisieren und ihre proliferative Nische zu etablieren, was letztlich zu entzündlichen Prozessen und Gewebeschäden des Wirtsepithels führt. Um diese Prozesse zu verstehen, hat die Wissenschaft in den letzten Jahrzehnten hauptsächlich auf Krebslinien basierende in vitro-Ansätze oder in vivo-Tierstudien verwendet. Obwohl diese Ansätze grundlegende Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen lieferten, sind sie nur begrenzt auf die Pathologie des Menschen übertragbar. Daher sind Tissue engineering und primärzellbasierte Ansätze für die moderne Infektionsforschung wichtig. Sie spiegeln die menschliche Komplexität besser wider als Ansätze mit Krebszellen und können im Gegensatz zu Tierversuchen human-obligate Prozesse nachbilden. Daher wurde in dieser Studie ein tissue engineered humanes Primärmodell des Dünndarmepithels für die Anwendung in der enterischen Infektionsforschung am Beispiel des Erregers Salmonella Typhimurium etabliert. Zu diesem Zweck wurden aus adulten Stammzellen gewonnene Darmorganoide als primäre humane Zellquelle verwendet, um 2D-Monolayer auf biologischen oder synthetischen Trägestrukturen in einer Transwell®-ähnlichen Umgebung zu erzeugen. Die so erzeugten Gewebemodelle des Darmepithels wurden auf ihre Vergleichbarkeit mit dem nativen Gewebe in Bezug auf Morphologie, Morphometrie und Barrierefunktion untersucht. Weiterhin wurde die Genexpression von organtypischen Muzinen, Tight Junction-assoziierten Proteinen und Claudinen sowie das Expressionsmuster der Tight Junction-Proteine untersucht. Insgesamt wiesen die auf biologischen Matrizes basierenden Gewebemodelle eine größere Ähnlichkeit mit dem nativen Gewebe auf - unter anderem in Bezug auf Morphometrie und Polarisation -, weshalb diese Modelle auf zellulärer und struktureller Ebene tiefgehender charakterisiert wurden. Die ultrastrukturelle Analyse zeigte die Ausbildung charakteristischer Mikrovilli und Tight-Junction-Verbindungen zwischen einzelnen Epithelzellen. Darüber hinaus wurden die Expressionsmuster typischer Darmepithelproteine untersucht, die eine in vivo ähnliche Lokalisation aufwiesen. Im Hinblick auf die Zelltypenzusammensetzung ergab die Analyse des Transkriptoms auf Einzel-Zell-Ebene definierte Zelltypen. Dies waren Zellen mit proliferativem Profil, Stammzellen und Vorläuferzellen, und Zellen der absorptiven Linie, Enterozyten und Microfold-Zellen. Zellen der sekretorischen Linie wurden ebenfalls annotiert, jedoch ohne eindeutige kanonische Genexpression. Mit der organotypischen Polarisierung, der Proteinexpression, den strukturellen Merkmalen und der heterogenen Zellzusammensetzung, einschließlich der seltenen Microfold-Zellen, weist das auf einer biologischen Matrix basierende Gewebemodell des Darmepithels die wichtigsten Voraussetzungen für Infektionsstudien mit Salmonellen auf. Im zweiten Teil dieser Studie wurde ein geeignetes Infektionsprotokoll für das Epithelgewebemodell mit Salmonella Typhimurium erstellt, gefolgt von der Untersuchung der wichtigsten Merkmale des Infektionsprozesses. Salmonella hafteten an den epithelialen Mikrovilli und verursachten während der Invasion das typische Membran-Kräuseln; interessanterweise konnten die Schritte der Invasion einzeln beobachtet werden. Nach der Invasion zeigte die Zeitverlaufsanalyse der Infektion, dass die Salmonellen intrazellulär lokalisierten und replizierten, während sie gleichzeitig von der apikalen zur basolateralen Seite der infizierten Zelle migrierten. Darüber hinaus veränderte sich die Morphologie der Bakterien in der Spätphase der Infektion zu einem filamentösen Phänotyp. Die Epithelzellen auf der anderen Seite setzten nach der bakteriellen Infektion zeitabhängig die Zytokine Interleukin 8 und Tumor-Nekrose-Faktor-α frei. Insgesamt rekapituliert die Salmonelleninfektion des intestinalen Epithelgewebemodells wichtige Schritte des Infektionsprozesses, wie sie in der Literatur beschrieben sind und stellt somit eine valide in vitro Plattform für die Untersuchung des Salmonelleninfektionsprozesses in einem menschlichen Kontext dar. Interessanterweise variierten die intrazellulären Salmonellenpopulationen während des Infektionsprozesses in ihrer Bakterienzahl, was auf eine erhöhte intrazelluläre Proliferation zurückgeführt werden konnte und somit ein heterogenes Verhalten der Salmonellen in einzelnen Zellen demonstriert. Darüber hinaus wurde durch die Anwendung von Einzel-Zell-Transkriptom-Analysen die Hochregulierung der Genexpression von Olfactomedin-4 (OLFM4) nachgewiesen; OLFM4 ist ein Protein mit verschiedenen Funktionen, darunter Prozesse der Zellimmunität sowie proliferierende Signalwege, und es wird häufig als Darmstammzellmarker verwendet. Diese OLFM4-Hochregulierung war zeitabhängig, auf mit Salmonella infizierten Zellen beschränkt und schien mit der intrazellulären Bakterienmasse zuzunehmen. Bei der Untersuchung der OLFM4-Regulationsmechanismen konnte eine nuclear factor κB-induzierte Hochregulierung ausgeschlossen werden, während die Hemmung der Notch-Signalübertragung zu einem Rückgang der OLFM4-Gen- und Proteinexpression führte. Darüber hinaus führte die Hemmung von Notch zu einer verminderten Bildung von filamentösen Salmonella. Insgesamt konnte durch die Verwendung des hier eingeführten primären Epithelgewebemodells ein heterogenes intrazelluläres bakterielles Verhalten beobachtet und eine bisher übersehene Wirtszellantwort - die Expression von OLFM4 durch einzelne infizierte Zellen - bei einem der am besten untersuchten enterischen Pathogene identifiziert werden. Dies beweist die Anwendbarkeit des vorgestellten Gewebemodells in der enterischen Infektionsforschung sowie die Bedeutung neuer Ansätze zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit höherer Relevanz für den Wirt. KW - Salmonella typhimurium KW - Tissue Engineering KW - Darmepithel KW - Infektion KW - Infektionsmodell KW - menschliches Darmepithel KW - Infektionsprozess KW - Gewebemodell KW - Wirt-Erreger Interaktion KW - infectionmodel KW - human intestinal epithelium KW - infectionprocess KW - Host-pathogen interaction KW - tissue model Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311548 ER -