TY - THES A1 - Bahndorf, Katrin T1 - Synthese und Charakterisierung von Aminosäure-basierten Amphiphilen und deren Umsetzung zu C\(_3\)-symmetrischen Sternmesogenen - Strukturkontrolle in weicher Materie über Oligopeptidaggregation T1 - Synthesis and characterization of amino-acid based amphiphiles and their conversion to C\(_3\)-symmetric star mesogens - structure control in soft matter via oligopeptide aggregation N2 - Synthese einer Bibliothek von Aminosäure-basierten Oligopeptid-Amphiphilen mittels Festphasensynthese, deren kovalente Knüpfung an einen nukleophilen Kern zu C3-symmetrischen Sternmesogenen und die Analyse der Einflüsse der verwendeten Aminosäuren auf die Sekundärstruktur des synthetisierten Moleküls. N2 - Synthesis of a library of amino acid based oligopeptide amphiphiles by solid phase synthesis, their covalent linkage to a nucleophilic core to form C3-symmetrical star mesogens and the analysis of the influences of the used amino acids on the secondary structure of the synthesized molecule. KW - Organische Chemie KW - Flüssigkristalle KW - Festphasenpeptidsynthese KW - Aminosäuren KW - Organic Chemistry KW - Liquid Crystals KW - Solid Phase Peptide Synthesis KW - Amino Acids Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252753 ER - TY - THES A1 - Pawellek, Ruben T1 - Charged Aerosol Detector Performance Evaluation and Development of Optimization Strategies for the Analysis of Amino Acids T1 - Leistungsbeurteilung des Charged Aerosol Detektors und Entwicklung von Optimierungsstrategien für die Analyse von Aminosäuren N2 - The charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector employed in liquid chromatography which has become established in the field of pharmaceutical analysis due to its outstanding performance characteristics, e.g. the almost uniform response for nonvolatile analytes. Owing to its principle of detection, the response of the CAD depends on the volatility of a compound and is inherently nonlinear. However, the newly implemented instrumental settings evaporation temperature and power function value (PFV) are valuable tools to overcome some of these drawbacks and can even enhance the detector’s capabilities when adjusted properly. This thesis aimed to evaluate the impact of the new instrumental settings on the CAD performance. Additionally, the influence of modern separation techniques for small polar compounds on the CAD was assessed and the applicability of hyphenated UV-CAD techniques explored. The optimization strategies derived from the evaluation procedures and the conjunction of the instrumental and chromatographic techniques investigated were utilized for the challenging impurity profiling of amino acids and amino acid-like drugs. The results of the method validation procedures confirmed the broad applicability of the CAD in the pharmaceutical analysis of nonvolatile compounds, supported by satisfactory sensitivity and reproducibility for meeting the regulatory requirements with respect to the ICH guidelines Q2(R1) and Q3A(R2). The limits of applicability include the analysis of semivolatile compounds, and the method transfer between current and legacy CAD models. Further advances in the definition and standardization of allowed ranges for the instrumental settings and the establishment of general optimization procedures in the method development could lead to a more widespread use of the detection technique in compendial methods. N2 - Der “charged aerosol detectorˮ (CAD) ist ein aerosol-basierter Detektor in der Flüssigchromatographie, der sich im Bereich der pharmazeutischen Analytik etabliert hat, da er über herausragende Leistungsmerkmale verfügt, wie das annährend einheitliche Signal für nichtflüchtige Analyte. Aufgrund des Detektionsprinzips ist das Signal des Detektors abhängig von der Flüchtigkeit einer Verbindung und zudem nichtlinear. Die neu eingeführten Geräteparameter Verdampfungstemperatur und „power function value” (PFV) stellen hierbei wertvolle Werkzeuge dar, um einige der mit dem Detektionsprinzip verbundenen Nachteile auszugleichen und können darüber hinaus die Detektionsmöglichkeiten erweitern, sofern sie auf geeignete Weise eingestellt wurden. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Auswirkungen der neuen Geräteparameter auf die Leistungsfähigkeit des Detektors zu untersuchen. Zusätzlich wurde der Einfluss moderner Trenntechniken auf den CAD beurteilt und die Anwendbarkeit gekoppelter UV-CAD Techniken erforscht. Die sich aus den Evaluierungsprozeduren ergebenden Optimierungsstrategien und die Verknüpfung der untersuchten instrumentellen und chromatographischen Techniken wurden anschließend verwendet, um Methoden für die herausfordernde Verunreinigungsanalyse von Aminosäuren und Arzneistoffen mit Aminosäurestruktur zu entwickeln. Die Ergebnisse der Validierungsverfahren bestätigten die weitgehende Anwendbarkeit des CAD in der pharmazeutischen Analyse nichtflüchtiger Verbindungen, unterstützt durch zufriedenstellende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, wodurch die Vorgaben der ICH-Leitfäden Q2(R1) und Q3A(R2) erfüllt werden konnten. Einschränkungen der Anwendbarkeit bestehen in der Analyse halbflüchtiger Verbindungen, sowie im Methodentransfer zwischen gegenwärtigen und alten CAD-Modellen. Weitere Fortschritte in der Definition und Standardisierung erlaubter Bereiche für die Einstellung der Geräteparameter und die Etablierung allgemeiner Optimierungsverfahren in der Methodenentwicklung könnten zu einer umfassenderen Nutzung der Detektionstechnik für Arzneibuchmethoden führen. KW - Instrumentelle Analytik KW - HPLC KW - Chemische Reinheit KW - Chromatographischer Detektor KW - Pharmaceutical Analysis KW - Charged Aerosol Detection KW - Impurity Profiling KW - Amino Acids KW - Aminosäuren Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243197 ER - TY - THES A1 - Unger, Nina T1 - Stability of Tryptophan in Parenteral Amino Acid Solutions: Identification of Degradation Products and Development of HPLC Analysis Methods T1 - Stabilität von Tryptophan in parenteralen Aminosäure-Lösungen: Identifizierung von Abbauprodukten und Entwicklung von analytischen HPLC Methoden N2 - The stability of Trp in pure solutions and in parenteral AA formulations was evaluated with regard to typically used manufacturing processes, storage conditions and primary packaging. Therefore, thorough stability studies on Trp solutions were conducted beforehand. The applied stressing method, i.e. steam sterilization by autoclave, are chemically seen relatively mild but showed to be efficient to induce Trp degradation in the presence of oxygen. Subsequent identification, separation and characterization were challenging due to similar substance properties, numerous stereoisomers and pairs of diastereomers found amongst them. However, the identified o-aminoacetophenone compounds, Kyn and NFK, are associated with photo reactivity and have photo-oxidizing properties. Thus, best possible protection from UV-light, together with strict oxygen expulsion, are the most important criteria to impede Trp degradation after autoclaving. The identification of Trp degradation products was assisted by the compilation of a substance library, which included manifold reported and chemically plausible Trp degradation substances. The substances were classified for priority and their early or late-stage occurrence. The large number of possible substances and stereoisomers was narrowed down with the information retrieved from LC-UV/MS experiments. However, final identification was achieved by the synthesis of proposed substances as references. The following eight substances were characterized as Trp degradation substances: Kyn, NFK and three pairs of diastereomers R,R/R,S DiOia, R,R/R,S Oia and cis/trans PIC. Fig. 33 shows the proposed degradation pathway and demonstrates the close chemical relationship, which may be an explanation for the conversion of some substances into each other during the storage period. The proposed pathway brings together the results of different Trp stability and stressing studies, respectively [89, 94, 97, 98, 103, 133]. To our knowledge, the simultaneous formation of the identified degradation substances has not been reported before and especially not under the stressing conditions applied. The application of a traditional RP-HPLC method was compared to two developed IP-HPLC methods and a RP-HPLC methods using a modified perfluorinated column. Orthogonal analyses methods and especially the combination of UV and MS detection are necessary in order to indicate potentially undetected degradation substances. Main evaluation criteria were the separation performance, analyses time, reproducibility and feasibility. The best results upon assessment of all Trp degradation products, in both; pure Trp solutions and pharmaceutical formulations, were obtained by a traditional RP-HPLC. The optimized method was validated according to ICH guidelines Q2(R1) and meets the criteria of a stability-indicating HPLC-UV method. The validated method has a sufficient separation performance with an adequate selectivity indicating the Trp degradation substances next to each other and next to other AAs in finished pharmaceutical formulations. The detailed knowledge of Trp degradation and the method presented may be transferred practically to the pharmaceutical industry processing Trp-containing products. In general, the findings might contribute to the quality management of such pharmaceutical products during manufacturing and storage. Additionally, the study results provide basic information for the establishment of an impurity consideration following the ICH guidelines Q3B (R2) (impurities in new drug products) for products containing Trp. However, further development of the method applying more sophisticated detectors or more potent HPLC techniques like e.g. UHPLC and the implication of more sensitive (MS) detectors like ToF-MS would be advantageous with regard to economic and practical aspects. N2 - Diese Arbeit dient der Stabilitätsbeurteilung von Tryptophan (Trp) in parenteralen Aminosäurelösungen, insbesondere im Hinblick auf Einflussfaktoren wie der Herstellungsprozess, z.B. der Sterilisationsvorgang, Lagerungsbedingungen, sowie die Art der verwendeten Primärverpackung. Zunächst wurde die Stabilität von reinen Trp-Lösungen untersucht, die mehreren aufeinanderfolgenden Sterilisationszyklen im Autoklav ausgesetzt wurden. Generell stellt der Autoklavierprozess eine Vergleichsweise milde und kontrollierte Art der Hitzebelastung dar. Dabei wurde zwischen Lösungen unterschieden, die Sauerstoff enthielten und Lösungen, in denen der gelöste Sauerstoff mittels Stickstoffgas ausgetrieben wurde und die anschließend luftdicht verschlossen wurden. Es konnte festgestellt werden, dass der Autoklavierprozess, in Anwesenheit von Sauerstoff, zu einem Abbau von Trp führt, welcher sich außerdem auch durch eine Gelbfärbung der Lösungen zeigt. Die Identifizierung und Charakterisierung der Abbauprodukte erwies sich als schwierig aufgrund von sehr ähnlichen Substanzen, die eine Trennung mittels HPLC und die UV-Detektion alleine erschwerten. Die Massenspektroskopie zeigte erst, dass einige Abbauprodukte zeitgleich eluieren und einige isomere Formen vorliegen. Mithilfe von preparativer HPLC und Fragmentierung in der Ionenfalle konnten drei Diastereomeren-Paare gefunden werden, R,R/R,S Oia und DiOia, cis/trans PIC und zwei weitere Substanzen, Kyn und NFK. Die beiden letztgenannten Stoffe haben eine Sonderstellung, denn sie besitzen jeweils ein o-Aminoacetophenon-Grundgerüst anstelle des Indols, und absorbieren dadurch zusätzlich bei Wellenlängen von > 320 nm, und wirken photosensibilisierend, wodurch die Stabilität von Trp (unter Lichteinstrahlung) zusätzlich nachteilig beeinflusst wird. Daraus lässt sich ableiten, dass der Abbau von Trp in Lösungen maßgeblich durch strengen Sauerstoff- und Lichtausschluss verhindert werden kann. Die Abbildung Fig. 33 zeigt schematisch, wie die einzelnen Abbauprodukte möglicherweise entstehen und zusammenhängen könnten. Die Aufstellung der chemischen Zusammenhänge beruht auf den Ergebnissen verschiedener Trp-Stabilitätsstudien und bringt diese auf einen Nenner [89, 94, 97, 98, 103, 133]. Soweit durch die Literaturrecherche bekannt, wurde das zeitgleiche Auftreten aller hier identifizierten Abbauprodukte bislang noch nicht dokumentiert. Insbesondere wurden keine Studien über Stabilitätsprobleme, bedingt durch die Wasserdampf- Sterilisation gefunden. Des Weiteren zeigten die quantitativen Untersuchungen von Lösungen, die eine Woche, ein und drei Jahre (nach einmaligem Autoklavieren) eingelagert wurden, dass die Abbauprodukte nicht linear entstehen und zunehmen, sondern, dass sich deren prozentuale Anteile dynamisch verändern (Kapitel 3.2.). Für die Identifizierung der Abbauprodukte von Trp war die Zusammenstellung einer Substanz- Bibliothek äußerst hilfreich. Sie beinhaltet chemisch plausible Trp-Abbauprodukte, sowie aus der Literatur bekannte Abbauprodukte, die durch verschiedenste Stressmethoden hervorgerufen werden. Diese Substanzen wurden nach Plausibilität und Priorität kategorisiert, um ein gezieltes Screening in gestressten (autoklavierten) Trp-Lösungen durchzuführen. Zusammen mit den Ergebnissen der LC-UV/MS Analyse konnte die Auswahl auf einige wenige Abbauprodukte begrenzt werden. Da es sich dabei um Isomere handelte, gelang die Identifizierung letztendlich erst durch die Synthese der in Frage kommenden Stoffe. Mithilfe der Synthese der Referenzsubstanzen konnte eine HPLC-UV Methode entwickelt, optimiert und nach den ICH Q2(R1) Richtlinien validiert werden, die eine Quantifizierung der Substanzen in reinen Trp-, und in handelsüblichen parenteralen Aminosäurelösungen ermöglicht. Für die validierte Methode wurde als stationäre Phase eine herkömmliche C18- Säule verwendet. Zu Vergleichszwecken wurde eine Methode auf einer Pentafluorophenyl (PFP)-Säule entwickelt und optimiert (Method D 1 und D 2), sowie zwei RP-Methoden mit zwei analogen Ionen-Paar-Reagenzien (Method B und C). Verglichen und beurteilt wurden dabei die Trennleistungen, Analysendauer, Reproduzierbarkeit und die praktische Anwendbarkeit der jeweiligen Methoden. Die besten Ergebnisse wurden aber mittels der traditionellen RP-HPLC erreicht. Die Ergebnisse könnten für die Herstellung, Lagerung und Beurteilung von Trp-haltigen Lösungen durchaus relevant sein. Eine strenge Kontrolle der Sauerstoffwerte sowie ein kontinuierlicher Lichtschutz während und nach der Verarbeitung sind unverzichtbar. Die Ergebnisse erlauben außerdem ein gezieltes Screening nach Abbauprodukten, bzw. „Markern“. Die Erstellung von Beurteilungen, wie es z.B in den ICH Q3B(R2) Richtlinien gefordert ist, wird erleichtert, da die Identität bestimmt wurde und eine validierte Quantifizierungsmethode entwickelt wurde. Die Methode könnte für industrielle Zwecke noch weiter optimiert werden, indem z.B. eine UHPLC entwickelt wird oder sensiblere Detektoren, wie z.B. ein ToF- Massendetektor, verwendet werden. Letztendlich sollte allerdings von der Arzneibuchmethode abgegrenzt werden, die Verunreinigungen aus dem Trp-Herstellungsprozess erfasst (1,1´ Ethyliden(bis)Trp). Die hier entwickelte Methode erfasst die Abbauprodukte von Trp in reinen Trp und in Trp-haltigen Aminosäurelösungen, die typischerweise durch Fehler bei der Herstellung oder den Autoklavierprozess hervorgerufen werden können. KW - Stabilität KW - Stability KW - Parenteral KW - Amino acids KW - Aminosäuren KW - Tryptophan KW - HPLC Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199825 ER - TY - THES A1 - Drehmann, Paul T1 - SLC7A10 als neues Gen für humane Hyperekplexie T1 - SLC7A10 - a novel candidate gene for human hyperekplexia N2 - Neuste Studien haben ergeben, dass Asc-1 Knock-out Mäuse aufgrund einer verminderten intrazellulären Glycinkonzentration in synaptischen Boutons im Gehirn, einen Hyperekplexie-ähnlichen Phänotyp entwickeln. Aufgrund nicht vollständig geklärter Ursachen für die Entstehung des Krankheitsbildes der Hyperekplexie beim Menschen, wurde eine Kohorte von 51 Patienten zusammengetragen, um vor dem Hintergrund der Forschungsergebnisse zu Asc-1 im Tiermodell, das kodierende Gen beim Menschen SLC7A10 als mögliches Kandidatengen auf Sequenzalterationen zu untersuchen. Hierfür wurde aus Vollblut der an Hyperekplexie erkrankten Patienten genomische DNA isoliert, um mittels PCR und anschließendem Screening der Sequenzen, Mutationen innerhalb funktionell wichtiger Bereiche des Gens zu eruieren. Neben weiteren Sequenzunterschieden, die meist in Introns gefunden wurden, wurde die codierende Mutation G307R innerhalb von Exon 7 identifiziert, die letztendlich der Grund für eine Versuchsreihe war, um zu hinterfragen, ob dieser Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz funktionelle Konsequenzen zur Folge hat. HEK293-Zellen wurden mit dem zuvor hergestellten Klon G307R transfiziert, um über Biotinylierung, immuncytochemische Färbungen und funktionelle Untersuchungen die Aktivität des Transporters zu beurteilen. Hier zeigte sich ein Funktionsverlust von über 95 %, bei uneingeschränkter Oberflächenexpression. ASC-1 bestätigt sich damit als neue Ursache in der Ausprägung von Hyperekplexie. Ferner können Zusammenhänge mit geistiger Retardierung und eingeschränkter neuronaler Plastizität bestehen. N2 - Recent studies have shown that Asc-1 knock-out mice leads to reduced intracellular glycine concentration in synaptic boutons in the brain followed by a development of a hyperekplexia-like phenotype. In humans, the underlying cause for hyperekplexia is not complexly understood. Based on findings in the Asc-1 knockout mouse model, a patient cohort of 51 patients was used to identify possible sequence alterations in the corresponding Gen SLC7A10 as a novel candidate gene for human hyperekplexia. For this purpose, genomic DNA was extracted from blood samples of patients suffering from hyperekplexia to identify mutations within functionally important areas of the gene by means of PCR and subsequent analyses of the determined sequences. Besides other sequence alterations mainly in introns, the coding mutation G307R within exon 7 was identified and used to investigate functional consequences of this amino acid exchange in an experimental series. The clone ACS-1 G307R was transfected into HEK293 cells to assess the activity of the transporter via biotinylation, immunocytochemical stainings, and functional uptake assays. Our results showed an almost loss of function with more than 95 % reduction in the transport activity although surface expression was unaffected. In conclusion, the ASC-1 mutation was confirmed as a novel cause for human hyperekplexia. In addition, mental retardation and restricted neuronal plasticity might play a role during disease manifestation. KW - Knockout KW - Glycin KW - Aminosäuren KW - Nervenzelle KW - SLC7A10 KW - Hyperekplexie KW - ASC-1 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159736 ER - TY - THES A1 - Kühnreich, Raphael T1 - Development and Validation of Methods for Impurity Profiling of Amino Acids T1 - Entwicklung und Validierung von Methoden für die Reinheitsanalytik von Aminosäuren N2 - The requirements for the impurity profiling of substances for pharmaceutical use have become greater over time. They can be accomplished by the use of modern instrumental analysis techniques, which have been evolved in the last decades. New types of columns with HILIC, mixed-mode and chiral stationary phases are suitable for the separation of all kinds of substances mixtures, that were previously hardly possible with the use of common reversed phase columns. Modern, almost universal detectors like CAD, ELSD and CNLSD can be applied for a sensitive detection of substances without a chromophore. However, in addition to some small individual disadvantages to these methods, the costs are high and applications are still kind of rare. Thus, the introduction of these devices at a broader level has not yet taken place. While this presumably will change over time, there is a need for methods that enable the impurity profiling of challenging substances with widespread analytics devices. Methionine is a substance with hydrophobic and hydrophilic impurities. With the help of a mixed-mode stationary phase, which is a combination of a reversed phase and a strong cationic exchanger, the separation of all putative impurities was found possible with good sensitivity and selectivity. The method requires apart from the column only standard isocratic HPLC equipment and was successfully validated. The evaluation of the enantiomeric purity of amino acids is challenging. Two approaches were made. The first method utilizes CE by means of in-capillary derivation with OPA and the subsequent separation with a cyclodextrin. With the use of OPA/NAC and γ-cyclodextrin, a simple and cost-effective method for the indirect enantioseparation of 16 amino acids was developed. With the second approach, racemic amino acids can be analyzed with HPLC and in-needle derivatization. For this, different columns and chiral thiols were evaluated and the chromatographic parameters were optimized. A method with OPA/NIBLC, a pentafluorophenyl column made the enantioseparation of 17 amino acids feasible. A LOQ of the minor enantiomer down to 0.04 % can be achieved with UV spectrophotometric detection. A similar method was developed for impurity profiling of L-amino acids. This can be used alternatively for the amino acid analysis performed by the European Pharmacopoeia. A simple, robust, precise and accurate method for the evaluation of impurities in glyceryl trinitrate solution was developed and validated. The four impurities of glyceryl trinitrate are separated by means of an acetonitrile-water gradient and the assay for this substance is also possible. N2 - Die Anforderungen an die Reinheitsanalytik von Substanzen für pharmazeutische Zwecke sind mit der Zeit größer geworden. Diese können durch die Verwendung von modernen instrumentellen Analysetechniken, die sich in den letzten Jahrzehnten entwickelt haben, erfüllt werden. Neue Arten von Säulen mit HILIC, mixed-mode und chiralen Phasen sind geeignet für die Trennung von allen möglichen Substanzgemischen, die vorher mit der Verwendung von gewöhnlichen Umkehrphasensäulen kaum möglich waren. Moderne, fast universelle Detektoren wie CAD, ELSD und CNLSD können für eine sensitive Detektion von Substanzen ohne Chromophor verwendet werden. Allerdings, neben ein paar individuellen Nachteilen von diesen Methoden, sind die Kosten sehr hoch und die Anwendungen noch eher selten. Daher haben sich diese Geräte noch nicht auf breiter Ebene durchgesetzt. Auch wenn sich das mit der Zeit ändern wird, gibt es die Notwendigkeit für Analysemethoden mit denen die Reinheitsanalytik von herausfordernden Substanzen auf verbreiteten analytischen Geräten ermöglicht wird. Methionin ist eine Substanz mit hydrophilen und hydrophoben Verunreinigungen. Mit der Hilfe einer „mixed-mode“-Phase, welche eine Kombination aus Umkehrphase und starker Kationenaustauscher ist, wurde die Trennung von allen mutmaßlichen Verunreinigungen mit guter Sensitivität und Selektivität ermöglicht. Die Methode benötigt abgesehen von der Säule nur eine normale isokratische HPLC und wurde erfolgreich validiert. Die Untersuchung der chiralen Reinheit von Aminosäuren ist anspruchsvoll. Zwei Ansätze wurden durchgeführt. Die erste Methode verwendet CE mittels In-Capillary- Derivatisierung durch OPA und der anschließenden Trennung mit Hilfe von einem Cyclodextrin. Durch den Gebrauch von OPA/NAC und γ-Cyclodextrin, wurde eine einfache und kosteneffektive Methode für die indirekte Enantioseparation von 16 Aminosäuren entwickelt. Mit dem zweiten Ansatz können Aminosäuren mittels HPLC und einer In-Needle- Derivatisierung analysiert werden. Dafür wurden verschiedene Säulen und chirale Thiole getestet und die chromatographischen Parameter optimiert. Eine Methode mit OPA/NIBLC, einer Pentafluorophenyl-Säule ermöglichte die Trennung on 17 Aminosäuren. Ein LOQ des kleinen Enantiomers von 0,04 % kann mit UV-spektroskopischer Detektion erreicht werden. Eine ähnliche Methode wurde für die Reinheitsanalytik von L-Aminosäuren entwickelt. Diese kann alternativ zur Aminosäurenanalyse im Europäischen Arzneibuch verwendet werden. Zusammenfassung 163 Eine einfache, robuste, präzise und richtige Methode zur Untersuchung der Verunreinigungen in Glyceryltrinitratlösung wurde entwickelt und validiert. Die vier Verunreinigungen von Glyceryltrinitrat werden mit Hilfe eines Acetonitril-Wasser-Gradienten getrennt und die Gehaltsbestimmung dieser Substanz ist ebenfalls möglich. KW - Aminosäuren KW - HPLC KW - Enantiomere KW - Trennung KW - amino acid KW - impurity profiling KW - chiral separation KW - Aminosäure KW - Reinheitsanalytik KW - chirale Trennung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145718 ER - TY - THES A1 - Wahl, Oliver T1 - Impurity Profiling of Challenging Active Pharmaceutical Ingredients without Chromophore T1 - Erstellen von Verunreinigungsprofilen von anspruchsvollen Wirkstoffen ohne Chromophor N2 - The impurity profiling of pharmaceutical ingredients can oppose many challenges. The best part of active pharmaceutical ingredients (APIs) and the related substances are detectable by UV detection, a very common detection principle. However, if an API lacks a suitable chromophore other means of detection are necessary. The corona charged aerosol detector (CAD) is a detector capable of detecting substances independent of their chemical structure. This “universal” detector has only one limitation: The analyte has to have a sufficiently low vapor pressure. Another important challenge that comes often together with the lack of a chromophore concerns the separation. These substances (e.g. most amino acids and derivatives) often contain structures that make them difficult to retain on conventional reversed phase columns. Possible solutions to overcome these challenges, like the application of the CAD and the benefit of so-called mixed-mode stationary phases in impurity profiling for pharmacopoeial purposes were explored in this work. The related substances analyzed in this thesis comprise amino acids, inorganic ions, bisphosphonic acids, basic and acidic derivatives of amino acids (esters and amides). The successful development and validation of mixed-mode liquid chromatography methods with CAD detection for carbocisteine and ibandronate sodium might help to increase the acceptance of this versatile detector in the pharmaceutical industry and in official authorities dealing with the determination of related substances. The combination of UV and CAD detection proved very useful during the analysis of Bicisate. Most of the related substances and some unidentified impurities were detectable by CAD whereas a synthesis by-product, a semi-volatile ester, was only detectable in the UV trace. The simple combination covers all relevant impurities in a single analysis. Two truly orthogonal methods regarding separation and detection for the enantiomeric purity of magnesium-L-aspartate helped to find the reason for elevated D aspartic acid content in the drug substance. A very quick and sensitive indirect separation using the OPA derivatization with NAC was developed as a powerful screening tool, whereas the direct separation of D- and L-CBQCA-Asp derivatives confirmed the results. Both methods were optimized in order to do without substances mentioned on the REACH list, like sodium tetraborate which is very frequently applied in standard derivatization protocols and CE separations. The importance of orthogonal detection principles in the determination of related substances of amino acids was discussed in a review article dealing with the revision of amino acid monographs in the Ph. Eur.. N2 - Die Reinheitsprüfung pharmazeutischer Wirkstoffe kann den Analytiker vor verschiedene Hürden stellen. So gilt für den größten Teil pharmazeutischer Wirkstoffe und deren verwandte Substanzen, dass sie mit Hilfe des weit verbreiteten UV-Detektors nachweisbar sind. Verfügt ein Wirkstoff hingegen nicht über ein geeignetes Chromophor, so benötigt man andere Möglichkeiten der Detektion. Der corona charged aerosol detector (CAD) ist in der Lage Substanzen unabhängig von ihrer chemischen Struktur zu detektieren, vorausgesetzt, sie sind schwerflüchtig. Eine weitere Herausforderung, die häufig mit dem Fehlen eines Chromophors einhergeht betrifft die Trennung. Verbindungen dieser Art (z.B. die meisten Aminosäuren und deren Derivate) enthalten häufig Strukturen, die eine Trennung auf konventionellen Umkehrphasen erschweren. Mögliche Ansätze um die genannten Herausforderungen zu meistern, wie zum Beispiel die Verwendung des CAD und sogenannter mixed-mode Phasen in der pharmazeutischen Reinheitsanalytik wurden erarbeitet und an konkreten Anwendungen erprobt. Die in dieser Arbeit bestimmten verwandten Substanzen sind vor allem Aminosäuren, anorganische Ionen, Bisphosphonate sowie basische und saure Derivate von Aminosäuren (Ester und Amide). Die erfolgreiche Entwicklung und Validierung von mixed-mode flüssig-chromatographischer Methoden kombiniert mit CAD für Carbocistein und Ibandronat Natrium könnte dabei helfen die Akzeptanz in der Pharmazeutischen Industrie und bei den für Reinheitsprüfungen zuständigen Behörden für diesen vielseitigen Detektor zu verbessern. Die Kombination von UV-Detektion und CAD erwies sich bei der Analyse von Bicisate als sehr nützlich. Die meisten verwandten Substanzen und einige unbekannte Verunreinigungen konnten mittels CAD detektiert werden, während ein Nebenprodukt der Synthese, ein halb-flüchtiger Ester, nur mit Hilfe des UV Detektors sichtbar war. Die Kombination zweier Detektionstechniken ermöglichte die Bestimmung aller relevanten Verunreinigungen in einer einzigen Analyse. Die Bestimmung der optischen Reinheit von Magnesium-L-Aspartat gelang mittels zweier orthogonaler Methoden und der Grund für das Auftreten von erhöhten Konzentrationen an D-Aspartat wurde gefunden. Eine schnelle indirekte Bestimmung der OPA/NAC-Derivate eignete sich als Screening-tool, während die direkte Trennung der enantiomeren CBQCA-Derivate die Ergebnisse bestätigte. Beide Methoden wurden im Hinblick darauf optimiert, dass sie ohne Substanzen wie Natriumtetraborat, eine Substanz auf der REACH Liste für besonders besorgniserregende Substanzen, sowie gebräuchlicher Puffer bei Derivatisierungsreaktionen und CZE Trennungen, auskamen. Die Bedeutung von orthogonalen Detektionstechniken bei der Bestimmung der verwandten Substanzen von Aminosäuren wurde in einem Übersichtsartikel, der in Zusammenhang mit der Revision von Aminosäuren Monographien des Europäischen Arzneibuches steht, diskutiert. KW - Chromatographie KW - Verunreinigung KW - Impurity Profiling KW - Amino acids KW - Corona charged aerosol detector KW - Aminosäuren Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137205 ER - TY - THES A1 - Meyer, Frank T1 - Soft X-ray Spectroscopic Study of Amino Acid and Salt Solutions T1 - Weichröntgenspektroskopische Untersuchungen von Aminosäuren und Salzen in wässriger Lösung N2 - This thesis focuses on the investigation of the electronic structure of amino acids and salts in aqueous solution using X-ray spectroscopic methods. Both material groups are of fundamental importance with regards to many physiological reactions, especially for the Hofmeister effect which describes the solubility of proteins in salt solutions. Hence, the investigation of the electronic structure of amino acids and the influence of ions on the hydrogen bonding network of liquid water are important milestones to a deeper understanding of the Hofmeister series. Besides investigating the electronic structure of amino acids in aqueous solution, the spectra were used to develop a building block model of the spectral fingerprints of the functional groups and were compared to spectral signatures of suitable reference molecules. In the framework of this thesis, it is shown that the building block approach is a useful tool with allows the interpretation of spectral signatures of considerably more complex molecules In this work, the focus lies on the investigation of the occupied and unoccupied electronic states of molecules in solid state, as well as in aqueous solution. Hereby, different X-ray spectroscopic methods were applied. X-ray emission spectroscopy (XES) was used to probe the occupied electronic structure of the solution, while the unoccupied electronic structure was addressed by using X-ray absorption spectroscopy (XAS). Finally, resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) as a combination of XAS and XES measurements provides the combined information about the unoccupied and occupied molecular levels. The element specific character of the three measurement methods is a feature which allows the investigation of the local electronic structure of a single functional group. With RIXS, also non-equivalent atoms of the same element can be addressed separately. Within this thesis firstly, a library of the XE spectra of all 20 proteinogenic amino acids in zwitterionic form is presented. From this sample-set XES fingerprints of the protonated alpha-amino group NH3+ and the deprotonated carboxylic group COO- were evaluated and used to identify the XES fingerprints of the nitrogen and oxygen containing functional groups of the side chains of the amino acids. The data is discussed based on a building block approach. Furthermore, the XE spectra of the functional groups of lysine and histidine, namely the NH2 group and the C3N2H4 ring structure, are both compared to XE spectra of suitable reference molecules (imidazole, ammonia and methylamine). It is found that the XE and RIXS spectra of the side chains of lysine and histidine show large similarities to the XE spectra of the reference molecules. This agreement in the XE and RIXS spectra allows a qualitative investigation of XE and RIXS spectra of more complex amino acids using the XE and RIXS spectra of suitable reference molecules. The chemical structure of histidine and proline is quite different from the structures of the other proteinogenic amino acids. Due to the unique chemical structure of the side chain which in both cases consists of a heterocyclic ring structure, these two amino acids were investigated in more detail. Zubavichus et al. [1] have shown that amino acids are decomposing while exposed to X-ray radiation of the experiment. The damage is irreversible and molecular fragments can adsorb on the membrane of the experimental setup. This contamination can also create a spectral signature which then overlaps with the signal of the solution and which complicates the interpretation of the data. To record spectra which are free from contributions of adsorbed molecular fragments on the membrane, the adsorption behavior was investigated. In contrast to the solid phase in which the amino acids are present as salts in one electronic conformation, the charge state of the amino acids can be manipulated in aqueous solution by tuning the pH-value. By doing this, all possible charge states are accessible (cation, anion, zwitterion). In this work it is shown that also the spectra of the different charge states can be modeled by the spectra of suitable reference molecules using the building block approach. The spectral changes occurring upon protonation and deprotonation of the functional groups are explored and verified by comparing them to theoretical calculations. The comparison with measurements of pyrrolidine show that the electronic structure which surrounds the nitrogen atom of proline is strongly influenced by the ring structure of the side chain. Furthermore, the proline, pyrrolidine, and histidine molecules are also degrading during the liquid sample measurements. This can be observed by the detection of a new spectral component which increases with the measurement time originating from the window membrane. In all cases, the speed of the agglomeration of molecular fragments at the membrane was observed to be highly sensitive to the pH value of the solution. To understand the Hofmeister series, also the impact of the salt ions have to be investigated. In this study the influence of potassium chloride (KCl) on the hydrogen bond network of water was studied by using non-resonantly excited XES as well as RIXS. A decreased dissociation of hydrogen molecules and changes in the molecular vibrations could be detected. These changes were interpreted with a molecular reorganization of the water molecules and a decreased number of hydrogen bonds. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit werden Untersuchungen zur elektronischen Struktur von verschiedenen Aminosäuren sowohl in wässriger Lösung als auch als Festkörper präsentiert. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf dem Erlangen eines fundamentalen Verständnisses über die elektronische Struktur der Aminosäuren in wässriger Lösung und der Entwicklung eines Baukastenprinzips für die qualitative Analyse der Röntgenemissions- und resonanten inelastischen Röntgenstreuungsspektren. In dieser Arbeit wird neben Aminosäuren auch der Einfluss von Salzionen auf das dynamische Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk des flüssigen Wassers untersucht. Beide Aspekte stellen wichtige Zwischenschritte auf dem Weg zu einem detaillierten Verständnis des Hofmeister-Effekts dar. In dieser Arbeit wurden röntgenspektroskopische Methoden verwendet, um die besetzten und unbesetzten Zustände der Moleküle sowohl im Festkörper als auch in wässriger Lösung zu untersuchen. Angewandt wurde dabei die Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS), welche die Untersuchung der unbesetzten Zustände erlaubt. Im Gegensatz dazu liefert die Röntgenemissionsspektroskopie (XES) Informationen über die besetzten Zustände. Die resonante inelastische Röntgenstreuung (RIXS) vereint diese beiden Techniken und enthält Informationen über die gesamte elektronische Struktur eines Systems. Der elementspezifische Charakter dieser Messmethoden muss dabei gesondert hervorgehoben werden, denn dadurch ist es möglich die lokale elektronische Struktur unterschiedlicher funktioneller Gruppen getrennt voneinander zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst eine Bibliothek der XES-Spektren der zwanzig proteinogenen Aminosäuren angelegt. Daraus konnten spektrale Fingerabdrücke der einzelnen funktionellen Gruppen und der Stickstoff und Sauerstoff enthaltenden Seitenketten der Aminosäuren erstellt werden. Die Spektren der einzelnen funktionellen Gruppen von Lysin und Histidin wurden in einem zweiten Schritt mit den Spektren von kleineren Molekülen, welche die pure funktionelle Gruppe repräsentieren, verglichen. Durch die sehr gute Übereinstimmung konnte gezeigt werden, dass die Röntgenemissionsspektren der untersuchten Aminosäuren nach einem Baukastenprinzip durch die Spektren der kleineren und dadurch einfacheren Referenzmoleküle beschrieben werden können. Mit Hilfe dieses Baukastenprinzips wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit die detaillierte Untersuchung der elektronischen Struktur der Aminosäuren Prolin und Histidin möglich. Die Aminosäuren Histidin und Prolin wurden dabei wegen ihrer speziellen chemischen Struktur, welche sich durch eine Ringstruktur an der Seitenkette von der chemischen Struktur der restlichen Aminosäuren unterscheidet, für eine genauere Untersuchung ausgewählt. Sowohl Prolin als auch Histidin werden durch die starke Röntgenstrahlung während des Experiments irreparabel beschädigt, wodurch sich die spektrale Signatur der Moleküle sehr stark ändert. Um diese Beschädigungen zu erkennen und zu vermeiden wurden die Veränderungen der Spektren in Abhängigkeit der Belichtungszeit dokumentiert. Neben Festkörpermessungen, bei welchen die Aminosäuren nur in einer einzigen Konfiguration vorhanden sind (zwitterionisch), wurden die Aminosäuren auch in ihrer natürlichen Umgebung, der wässrigen Lösung, untersucht. Durch die Variation des pH-Wertes der Lösung kann die Konfiguration und damit die elektronische Struktur geändert werden (Kation, Anion, Zwitterion). Eine starke Veränderung in den Spektren in Abhängigkeit des pH-Wertes konnte festgestellt werden. Dabei fällt auf, dass die elektronische Struktur des Stickstoffs in der Aminosäure Prolin sehr stark durch die Ringstruktur der Seitenkette beeinflusst wird, was durch den Vergleich des Spektrums mit dem Spektrum des Pyrrolidin Moleküls gezeigt wurde. Des Weiteren konnte sowohl bei den Flüssigexperimenten mit Prolin als auch mit Histidin eine Kontamination der Membran festgestellt werden, welche durch Molekülfragmente entsteht. Dieser Kontaminierungsprozess konnte für Prolin und Histidin vor allem bei neutralem und hohem pH-Wert beobachtet werden. Dennoch konnten durch das Baukastenprinzip und die Untersuchungen der Referenzmoleküle Imidazol und Pyrrolidin Erkenntnisse über die elektronische Struktur von Histidin und Prolin gewonnen werden. Mit Hilfe der resonanten inelastischen Röntgenstreuung konnten die spektralen Fingerabdrücke der beiden nicht äquivalenten Stickstoffatome des Imidazols experimentell voneinander getrennt werden. Des Weiteren wurden innerhalb der RIXS-Spektren starke resonante Einflüsse beobachtet. Mit Hilfe von berechneten Spektren von isolierten Imidazol und Imidazolium Molekülen konnten die spektralen Signaturen sowohl im nicht resonanten Spektrum als auch im resonanten Spektrum erklärt werden und im Einzelnen auf die Struktur der Valenzorbitale zurückgeführt werden. Auf dem Weg zum Verständnis des Hofmeister-Effekts ist neben den Aminosäuren natürlich auch der Einfluss von Salzen auf die Lösung zu berücksichtigen. Im letzten Teil dieser Arbeit stehen daher die Auswirkungen der Ionen des Kaliumchlorids auf das Röntgenemissionsspektrum des Wassers im Fokus. Dazu wurden KCl Lösungen verschiedener Konzentrationen untersucht. Durch die Zugabe von Salz konnte eine Umorientierung der Wassermoleküle und des damit verbundenen Netzwerks von Wasserstoffbrückenbindungen beobachtet werden. KW - Aminosäuren KW - Elektronenstruktur KW - Röntgenspektroskopie KW - RIXS KW - resonant inelastic x-ray scattering KW - amino acids KW - aqueous solution KW - electronic structure KW - salt solutions KW - Elektronenstruktur KW - Röntgenspektroskopie KW - Salzlösung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124295 ER - TY - THES A1 - Almeling, Stefan T1 - The use of aerosol-based detection systems in the quality control of drug substances T1 - Die Verwendung von aerosol-basierten Detektionssystemen in der Qualitätskontrolle von Arneiwirkstoffen N2 - The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs. N2 - Die durchgeführten Arbeiten hatten zum Ziel, das Potential von evaporationsbasierten HPLC-Detektoren sowie weiterer moderner Techniken hinsichtlich ihrer Eignung zur Reinheitsprüfung von pharmazeutischen Wirkstoffen zu untersuchen. Im Zuge der Arbeiten wurden verschiedene neue Methoden zur Identifizierung, Verunreinigungskontrolle und zur Überprüfung der Zusammensetzung von pharmazeutischen Wirkstoffen entwickelt. Ein evaporationsbasierter Detektor, der in den letzten Jahren Einzug in die pharmazeutische Analytik gehalten hat, ist der Lichtstreudetektor (ELSD). Allerdings wurde berichtet, dass es im Zusammenhang mit der Injektion konzentrierter Testlösungen zum Auftreten nicht reproduzierbarer Spikes kam. In einer systematischen Studie wurden die Gründe hierfür ermittelt und gleichzeitig Möglichkeiten ihrer Vermeidung aufgezeigt. Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit der Empfindlichkeit des Detektors von der Zusammensetzung der mobilen Phase, der LC-Flußrate und den Einstellungen des ELSD untersucht. Im Zuge der Revision der Monografien für Asparaginsäure und Alanin wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von 1 mmol/L Perfluorheptansäure und Detektion mittels eines geladenen Sprühnebeldetektors (Charged Aerosol Detector – CAD) für die Reinheitskontrolle von Asparaginsäure entwickelt und validiert. Mit Hilfe dieser Methode konnten sowohl organische Säuren als auch die wesentlichen Aminosäuren, die als prozessrelevante Verunreinigungen bekannt sind, abgetrennt werden. Nach geringfügiger Modifikation konnte diese Methode auch zur Reiheitskontrolle von Alanin eingesetzt werden. Basierend auf der HPLC-CAD-Methode für Alanin wurde eine vergleichende Studie der Leistungsfähigkeit verschiedener evaporationsbasierter HPLC-Detektoren durch-geführt. Untersucht wurden der ELSD, der CAD und der kürzlich entwickelte „Nano Quantity Analyte Detektor“ (NQAD). Weiterhin wurden ein massenspektrometrischer Detektor (MSD) sowie die Quantifizierung mittels NMR-Spektroskopie (qNMR) in die Untersuchung einbezogen. Im Ergebnis war die Reinheitskontrolle von Alanin auf einem ICH konformen Niveau unter Verwendung des CAD, NQAD und MSD sowie mittels qNMR möglich. Hinsichtlich der Kriterien Leistungsfähigkeit, Preis und Benutzerfreundlichkeit waren der CAD und der NQAD die geeignetsten Alternativen. Bezüglich Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit war der CAD dem NQAD leicht überlegen. Die Qualität von Streptomycinsulfat wird von der aktuellen Arzneibuchmonografie mangels eines geeigneten Reinheitstests nicht ausreichend kontrolliert. Aus diesem Grund wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von Perfluorpropionsäure und Detektion mittels CAD zur Identifizierung und Kontrolle der Verunreinigungen entwickelt. Mit dieser Methode konnten 21 Verunreinigungen von Streptomycin abgetrennt und nach massenspektormetrischer Kopplung identifiziert werden. Die Methode erwies sich als ausreichend empfindlich, um Verunreinigungen mit einer Ausschlussgrenze von 0.1%, wie sie im Europäischen Arzneibuch für Fermentationsprodukte üblicherweise angewandt wird, zu kontrollieren. Derzeit wird der Aescingehalt in standardisiertem Rosskastanien-Trockenextrakt mittels einer komplexen photometrischen Methode bestimmt. Für den entsprechen-den Entwurf einer Monografie des Europäischen Arzneibuchs wurde eine selektivere HPLC-UV-Methode vorgeschlagen. Die Möglichkeiten einer weiteren Verbesserung dieser Methode unter Verwendung des CAD wurden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine modifizierte HPLC-CAD-Methode geeignet ist, Probleme, die sich aus der unterschiedlichen UV-Absorption der im Aescingemisch enthaltenen Substanzen ergeben, zu eliminieren. Weiterhin wurde die vorgeschlagene Referenzstandard Strategie überprüft. Abschließend wurde am Beispiel von zwei Gruppen pharmakologisch wirksamer Peptide nachgewiesen, wie kollisionsinduzierte Massenspektrometrie (CID-MS) erfolgreich für die Identitätskontrolle in Arzneibuchmongrafien eingesetzt werden kann. Diesbezüglich erbrachte die Kombination der direkten Massenbestätigung mittels des m/z-Verhältnisses des Molekül-Ions mit den aus dem CID-MS-Experiment erhaltenen Informationen ein höheres Maß an Gewissheit hinsichtlich der Identitätsbestätigung als die derzeit beschriebenen Tests. Als weitere Vorteile dieses Ansatzes wurden ein wesentlicher Effizienzgewinn sowie eine erhebliche Reduktion des durch die Testung verbrauchten Probenmaterials identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Arbeiten an verschiedenen Beispielen, wie aktuelle Entwicklungen im Bereich der analytischen Chemie dazu beitragen können, die Qualitätskontrolle von Arzneimittelwirkstoffen zu verbessern. KW - Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie KW - Qualitätskontrolle KW - Arzneimittel KW - Reinheitsanalytik KW - evaporationsbasierte Detektoren KW - Charged Aerosol Detektion KW - Streptomycin KW - Aminosäuren KW - Aescin KW - HPLC KW - Europäsches Arzneibuch KW - Purity control KW - evaporation based detectors KW - charged aerosol detector KW - Streptomycin KW - Amino acids KW - Aescin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64722 ER - TY - THES A1 - Beyer, Tanja T1 - Quantitative NMR-Spektroskopie in der pharmazeutischen Analytik -- Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen T1 - Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical analysis -- Identity, purity and content of drugs N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Fragestellung, ob sich die quantitative NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen eignet, und wie sich Präzision und Empfindlichkeit dieser Methode im Vergleich zu etablierten chromatographischen Verfahren verhalten. Die quantitative Untersuchung der drei strukturell jeweils verwandten Mehrkomponentengemische Codergocrinmesilat, Clomifencitrat und Flupentixoldihydrochlorid bewies eindrucksvoll die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie als orthogonale, analytische Messmethode im Vergleich zu validierten HPLC-Arzneibuchmethoden. Die im Rahmen einer Validierung der 1H-NMR-Methode ermittelten Ergebnisse erfüllten bezüglich Präzision und Richtigkeit die an eine im pharmazeutischen Bereich eingesetzte analytische Methode gestellten Anforderungen; zudem wurden weitere Prüfparameter wie Selektivität, Linearität, Robustheit und Stabilität verifiziert. Externe-Standard-Experimente wie "Zwei-Röhrchen-Methode" und ERETIC-Verfahren bestätigten die quantitativen Ergebnisse der Internen Standardisierung; jedoch wurde hier -- insbesondere für die ERETIC-Technik -- eine höhere Fehleranfälligkeit und somit eine größere Streuung der Einzelergebnisse beobachtet. Am Beispiel von Codergocrinmesilat und Flupentixoldihydrochlorid konnte zudem die Eignung anderer NMR-aktiver Kerne wie 13C und 19F für die quantitative Analyse von komplexen Substanzgemischen aufgezeigt werden. Das Potential der 1H-NMR-Spektroskopie für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen wurde am Beispiel der Aminosäure L-Alanin aufgezeigt. Die zu erwartenden Verunreinigungen Glutamin-, Asparagin-, Äpfel- und Fumarsäure konnten im Gegensatz zu den "veralteten" Prüfmethoden des Europäischen Arzneibuches eindeutig identifiziert und quantifiziert werden; mit einer Bestimmungsgrenze von <= 0.03% wurden die Vorgaben der ICH-Richtlinie Q3A(R2) erfüllt. Die deutliche Übereinstimmung der NMR-spektroskopisch ermittelten Ergebnisse einer quantitativ untersuchten Alanin-Modellmischung mit einer für den Routinebetrieb geeigneten HPLC-Methode unter Einsatz verschiedener Detektoren wie CAD, NQAD, ELSD und MS, sowie der Vergleich wichtiger Prüfparameter wie Linearität und Nachweisgrenze bestätigten die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Qualitätskontrolle. Die Aufdeckung von Arzneimittelfälschungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der zwei aktuellen Fallbeispiele Heparin und Glycerin näher untersucht. Die in Zusammenhang mit dem Heparin-Skandal verantwortliche Kontaminante OSCS konnte neben Dermatansulfat und weiteren natürlich vorkommenden Glykosaminoglykan-Verunreinigungen im 1H-NMR-Spektrum eindeutig identifiziert und auf 0.1% OSCS bzw. 0.5% Dermatansulfat begrenzt werden. Eine präzise und richtige quantitative Bestimmung der beiden Glykosaminoglykane wurde über die N-Acetyl-Resonanzen mit Hilfe der Signalhöhenbestimmung und dem Standard-Additionsverfahren ermöglicht; deutliche Abweichungen vom "wahren" Gehalt wurden hingegen, bedingt durch starke Signalüberlagerungen, nach Flächenvergleich beobachtet. Weitere Verunreinigungen, insbesondere Lösungsmittelrückstände, die während des Extraktions- und Reinigungsprozesses des Heparins eingesetzt werden, konnten ebenfalls über charakteristische Resonanzen identifiziert und mit Hilfe der Internen-Standard-Methode quantitativ erfasst werden. Eine umfangreiche Untersuchung von 145 Heparin-API-Mustern mittels NMR-Spektroskopie und weiteren, neuentwickelten Verfahren wie HPLC, CE, IR- und Raman-Spektroskopie konnte die Eignung der entwickelten 1H-NMR-Methode bestätigen. Potentielle Glycerin-Kontaminanten wie Diethylenglycol und Ethylenglycol konnten ebenso wie eine weitere, natürlich vorkommende Verunreinigung, Propylenglycol, mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Beide Methoden erfüllten die in der USP beschriebenen Anforderungen, die für pharmazeutisch eingesetztes Glycerin jeweils höchstens 0.1% Diethylenglycol bzw. Ethylenglycol erlaubt. Während die quantitative Reinheitsprüfung beim Einsatz der 1H-NMR-Spektroskopie mit einer Messdauer im Bereich von etwa 30 min für den Routineeinsatz geeignet ist, ist die entwickelte quantitative 13C-NMR-Methode beim Einsatz von Spektrometern geringer Magnetfeldstärke aufgrund einer geringen Nachweisempfindlichkeit und der NOE-Problematik für den Routinebetrieb nur bedingt anwendbar. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die untersuchten Beispiele die NMR-Spektroskopie als in hohem Maße geeignet für die quantitative Analyse von Arzneimitteln ausweisen. N2 - The main objective of the present thesis was the investigation of the suitability of quantitative NMR spectroscopy for identification, purity assay, and quantification of a given drug, as well as a comparison of precision and sensitivity of this method with well-established chromatographic routines. The quantitative analysis of the three multi-component drug mixtures codergocrine mesylate, clomiphene citrate, and flupentixol dihydrochloride strikingly demonstrates the suitability of the 1H NMR spectroscopy as an independent analytical measurement technique in comparison to validated HPLC methods of international pharmacopoeias. Concerning precision and accuracy, the results obtained from validation of the 1H NMR method met the requirements that are made on an analytical routine for pharmaceutical purposes; additionally, further validation parameters such as selectivity, linearity, robustness, and stability have been verified. Experiments like the "twin tube" and ERETIC techniques utilizing external standards confirm these results; however, in this context an increased error rate and therefore larger variance was observed, especially in the case of ERETIC. By means of codergocrine mesylate and flupentixol dihydrochloride, additionally the suitability of other NMR active nuclei as 13C or 19F for quantification of complex mixtures was shown. The potential of the 1H NMR spectroscopy for purity assays was demonstrated for the example of the amino acid L-alanin. Identification and quantification of the expected impurities glutamic acid, aspartic acid, malic acid, and fumaric acid was possible, in contrast to "out-dated" test methods of the European Pharmacopoeia; achieving a limit of quantification <= 0.03%, the demands of the ICH guideline Q3A(R2) have been met. Concerning the quantification of an alanine model mixture, the clear agreement between the results obtained by means of NMR spectroscopy and a HPLC method using various detectors like CAD, NQAD, ELSD, and MS, suited for routine analysis, as well as the comparison of various relevant parameters such as linearity and limit of quantification confirmed the qualification of 1H NMR spectroscopy in the field of routine quality assurance. Within the scope of this work, the disclosure of counterfeit drugs by means of NMR spectroscopy was investigated in detail utilizing two current case studies, namely heparin and glycerin. Besides dermatan sulfate and other natural occurrences of glycosaminoglycan impurities, the contaminant OSCS revealed in connection with the recent heparin affair was clearly identified in the 1H NMR spectrum and these contaminants could be limited to 0.1% OSCS and 0.5% dermatan sulfate, respectively. A precise and accurate quantification of these two glycosaminoglycanes was achieved using signal height and standard addition methods applied to the N-acetyl resonances; comparison of signal areas however yielded considerable deviations from the "true" content, which are due to strong signal overlap. Further contaminants, especially solvent residues originating from the extraction and purification processes of heparin, have been able to be identified with the help of characteristic resonances; their quantification was possible. An extensive study of 145 heparin API samples by means of NMR spectroscopy and other novel techniques such as HPLC, capillary electrophoresis, IR and Raman spectroscopy confirmed the qualification of the developed 1H NMR method. Potential contaminants in glycerin such as diethylene glycol and ethylene glycol have been able to be identified as well as quantified by means of 1H and 13C NMR spectroscopy, as was the case for propylene glycol, which is naturally present. Both methods met the requirements of the USP, limiting the amount of diethylene glycol and ethylene glycol for pharmaceutical purposes to 0.1%, respectively. While 1H NMR spectroscopy with a measurement time of about 30 min is well suited for routine application, the applicability of the 13C NMR method is limited due to the NOE effect and the low sensitivity at low field strengths. In conclusion, each of the attended topics showed, that NMR spectroscopy is a powerful tool within the framework of quantitative drug analysis. KW - NMR-Spektroskopie KW - Protonen-NMR-Spektroskopie KW - Quantitative Analyse KW - Qualitätskontrolle KW - Arzneimittel KW - Heparin KW - Aminosäuren KW - qNMR KW - Gehaltsbestimmung KW - Reinheitsanalytik KW - Arzneimittelfälschungen KW - Mehrkomponentengemische KW - quantitative analysis KW - purity control KW - counterfeit drugs KW - quantitative NMR spectroscopy KW - multicomponent drugs Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65091 ER - TY - THES A1 - Borst, Claudia T1 - Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europäischen Arzneibuchs T1 - Capillary electrophoretic impurity analysis of different drugs of the European Pharmacopoeia N2 - Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte. N2 - The separation mechanism of capillary electrophoresis (CE) is based on the mobility of ions in an electric field. CE is a versatile technique, which can be operated in different modes. In this work, both aqueous capillary zone electrophoresis (CZE) and nonaqueous CE (NACE) and microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) were investigated. Using these CE methods, impurity analysis was accomplished for serveral pharmaceuticals, which are described in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): ethambutol, quetiapine, ephedrine, levodopa and correspondingly related substances. The active agent ethambutol is used in the (S,S)-configuration and in Ph. Eur. 7 the monograph describes the dichloride of the substance. In order to develop a separation method for (S,S)-ethambutol, its enantiomer and the achiral meso-compound were synthesized by the reaction of 2-amino-1-butanol and diethyloxalate. For the separation of these ethambutol compounds the CZE technique was chosen. After using an acid phosphate buffer, the concentration of the sample solution had to be set at 1 mg/ml for an sufficient UV adsorption (λ: 200 nm). After using a basic tetraborate buffer, the chromophore was more sensitive due to the electron pair of the nitrogen molecule, which led to higher peak intensity. Native α-, β- and γ-cyclodextins (CDs) and some derivatives of β-CD were added to the background electrolyte (BGE) as chiral selectors. The CZE method was modified in many ways, e. g. in molarity and pH value of the BGE, in concentration of the chiral selectors, in voltage and in temperature. In spite of various variations, the separation of the stereoisomers was not successful. A CD-modified MEEKC method was applied to separate the racemates of dopa, methyldopa, tyrosine and phenylalanine. For this purpose, a microemulsion (ME) was employed, which consisted of ethyl acetate, SDS, 1-butanol, phosphate buffer, sulf. β-CD and 2-propanol, used as an organic modifier, if necessary. For each DL-amino acid the composition of the ME and the instrument settings (voltage, temperature) were optimized. The separation of DL-dopa was accomplished without an organic modifier. Based on the methods evolved individually, two CD-modified MEEKC methods were developed to separate all four racemates. The concluding validation of these methods with respect of repeatability (resolution, migration time, ratio of the corrected peak areas, and number of theoretical plates) and limit of detection showed that the methods give precise results. The technique of MEEKC was also used for the separation of ephedrine derivatives. By means of a HDAS-β-CD-modified CZE method, Wedig et al. achieved baseline separation of racemic ephedrine, pseudoephedrine, N-methylephedrine and norephedrine in one run. In their experiment the BGE consisted of 50 mM phosphate buffer, pH 3.0. An ME was composed of this buffer as aqueous phase and the organic compounds, which formed the oil-phase of the ME for the amino acids. Contrary to the CZE method of Wedig et al., who used HDAS-β-CD, no satisfying resolution was observed. Replacing the chiral selector HDAS-β-CD with sulf. β-CD and modifying the phosphate buffer in ionic strength and pH value, led to baseline separation of the four mentioned ephedrine derivatives eventually. This MEEKC method was subjected to the separation of other ephedrine derivatives. So racemic 2-(dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol could partly be separated, whereas complete separation could be observed for racemic adrenaline, 2-amino-1-phenylethanol and diethylnorephedrine. Whereas the MEEKC method is much cheaper by using sulf. β-CD, the application of the HDAS-modified CZE method resulted in the separation of all four racemic ephedrine alkaloids in one run. Finally, an impurity analysis of quetiapine and its related compounds quetiapine desethanol, quetiapine-N-oxide and quetiapine lactam was develop. The molecular structure of quetiapine lactam needed to be clarified, as this compound had not been described before. By using mass spectrometric (MS) as well as infrared (IR) and NMR investigations, the substance could be identified: Dibenzo[b,f][1,4]thiazepine-11(10H)one. As quetiapine lactam was found to be nearly insoluble in water and aqueous solutions, an NACE method had to be applied. Indeed, a method was developed with a BGE consisting of methanol, acetonitril, ammonium acetate and acetic acid. Thereby, the separation of quetiapine and its three mentioned impurities was observed with high resolution values. However, validation was impossible, because of numerous aborts of the current. Alternatively, an aqueous and highly reproducible CZE method was found with a BGE composed of 80 mM phosphate buffer, pH 4.0. Due to the water insolubility of quetiapine lactam, only quetiapine desethanol and quetiapine-N-oxide could be analysed as impurities. Finally, the aqueous CZE method was validated; the high precision of the results could be verified. KW - Kapillarelektrophorese KW - Arzneimittel KW - Verunreinigung KW - Qualitätskontrolle KW - Europäisches Arzneibuch KW - chirale Trennung KW - Ethambutol KW - Aminosäuren KW - Ephedrin KW - Quetiapin KW - MEEKC KW - CZE KW - NACE KW - Cyclodextrine KW - capillary electrophoresis KW - chiral separation KW - cyclodextrin KW - amino acids Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56243 ER -